一种M1型巨噬细胞的鉴定方法与应用与流程

一种m1型巨噬细胞的鉴定方法与应用
技术领域
1.本发明涉及细胞检测与分型技术领域，尤其涉及一种巨噬细胞的检测与分型。


背景技术：

2.巨噬细胞主要来源于骨髓前体细胞，在机体固有免疫应答和适应性免疫应答中发挥极其重要的作用，与炎症反应、免疫防御、血管形成、肿瘤的形成以及内环境稳定等密切相关。
3.在不同的微环境中，巨噬细胞可以分化为不同细胞亚群：m1型与m2型，前者促进炎症并抑制细胞增殖，后者促进增殖和组织修复。巨噬细胞表型转换与众多疾病包括动脉粥样硬化、心肌梗死、脑梗死、肿瘤、哮喘、感染性疾病等疾病的发生、发展、转归等方面密切相关。例如，痴呆ad患者m2b巨噬细胞亚群减少，m1巨噬细胞亚群增加，而pm2k cd14 m2b巨噬细胞亚群减少则表现为认知功能下降[pmid:32170772]。非小细胞肺癌中肿瘤相关巨噬细胞的m1型与生存时间呈正相关[pmid:20338029]。巨噬细胞m2/m1比值可作为判断食管腺癌淋巴结转移及预后不良的敏感指标，m2d巨噬细胞可能在食管腺癌转移中起重要作用[pmid:26263481]。在多变量分析中，m1/m2是生存率的一个正的独立预测因子。多变量分析证实，m1巨噬细胞密度和m1/m2比值可以帮助预测胃癌根治术后患者的生存时间[pmid:24283947]。组织浸润的m1巨噬细胞组分与肾透明细胞癌的肿瘤分期、分期及肿瘤组织学分级有显著相关性[pmid:33181696]。浸润性乳腺癌破骨细胞样巨细胞主要具有m2巨噬细胞表型[pmid:29129494]。骨肉瘤转移到肺，转移瘤中以肿瘤促进免疫抑制的m2巨噬细胞为主与患者生存率低下有一定联系。相比之下，m1巨噬细胞的优势与较长的生存期相关[pmid:32313728]。在慢性阻塞性肺疾病患者的血液和肿瘤中，辅助性t细胞因子1和m1巨噬细胞的相对优势意味着这些患者存在更强的促炎模式。炎症不应该系统地针对所有肺癌患者。肺癌患者应至少在疾病的早期阶段进行潜在呼吸道疾病的筛查和特定炎症模式的识别[pmid:27793775]。也有研究表明，m1巨噬细胞诱导的内皮细胞向间充质细胞的转化促进了婴儿血管瘤的消退，并可能为这种血管瘤的治疗提供新的治疗方法[pmid:28710904]。因此，检测患者的外周血中m1型巨噬细胞的数量及占比，可以判断临床相关疾病的预后。而通过调控m1/m2的比例，使病理状态得到改善，可能成为治疗上述疾病的一种新思路。
[0004]
现有技术中对巨噬细胞的分型，检测的是一组细胞表面标志物及其差异表达水平。关于m1型巨噬细胞的标志物，则可以从膜分子的表达、细胞因子分泌情况和精氨酸代谢途径等多方面进行鉴定。在膜分子方面，cd86可作为m1型巨噬细胞理想的标志物；在细胞因子分泌情况上此型巨噬细胞高表达tnf、il
‑
12和il
‑
18，因此这些细胞因子可作为m1型巨噬细胞的标志物；在精氨酸代谢途径方面，以精氨酸为原料合成一氧化氮是m1型巨噬细胞的重要特点，诱导型一氧化氮合成酶inos可作为m1型巨噬细胞的标志物。然而，所需要检测的指标众多，需要花很多的时间和经费，并且以上指标还存在争议。
[0005]
目前，鉴定m1和m2型巨噬细胞的方法，主要采用分子生物学方法，包括流式细胞术、western blot、rt
‑
pcr、elisa、免疫荧光等，来检测上述m1和m2型巨噬细胞的分子标记
物。存在检测指标多、指标特异性不够、耗时的缺点，不易于向临床转化。


技术实现要素：

[0006]
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种特异性高且方便快捷的巨噬细胞分型方法。
[0007]
本发明首先提供了一种m1型巨噬细胞的鉴定方法，采用微流控技术从单细胞整体层面检测巨噬细胞的电学特性，以细胞膜比电容作为检测指标，对待测样品进行检测，待测样品为单细胞或细胞群，根据检测结果判断待测样品是否为m1型巨噬细胞，或根据检测结果计算待测样品中m1型巨噬细胞的含量或占比。
[0008]
当所检测的巨噬细胞单细胞的细胞膜比电容满足单细胞电学特性标定体系中m1型巨噬细胞细胞膜比电容范围时，判断其为m1型巨噬细胞。
[0009]
所述单细胞电学特性标定体系中m1型巨噬细胞细胞膜比电容范围为2.700
±
0.527μf/cm2。
[0010]
进一步地，当以细胞群作为待测样品时，对细胞群中的单细胞进行细胞膜比电容的检测，根据相同的鉴定方法统计m1型巨噬细胞的数量，进而计算细胞群中m1型巨噬细胞的占比，实现对待测细胞群中m1型巨噬细胞的定量检测。
[0011]
当细胞群中50％以上的单细胞符合m1型巨噬细胞细胞膜比电容范围时，可判断该细胞群为m1型巨噬细胞群。
[0012]
本发明中所涉及到的细胞膜比电容的检测，可采用本领域检测细胞电学特性的常规检测方法进行，如膜片钳系统，或公开号为cn106959391a的中国专利中所记载的细胞膜比电容检测方法。
[0013]
本发明还提供了细胞电学特性检测方法在m1巨噬细胞鉴定分型中的应用。
[0014]
本发明还提供了细胞膜比电容在作为m1巨噬细胞鉴定分型检测特异性指标中的应用。
[0015]
基于前述技术方案，本发明还提供一种巨噬细胞指纹图谱，所述指纹图谱为采用微流控技术，以细胞质电导率为横坐标，以细胞膜比电容为纵坐标，每个细胞为一点，绘制出的单细胞电学特性散点分布热图。
[0016]
更进一步地，在前述方案可以实现m1型巨噬细胞分型鉴定的基础上，本发明还提供了前述方法在预测与m1型巨噬细胞相关的慢性疾病进展和急性疾病预后中的应用；以及前述方法在体内回输m1型巨噬细胞进行细胞治疗的质量控制中的应用；以及前述方法在筛选靶向调控m1型巨噬细胞的相关药物方面的应用。
[0017]
本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
[0018]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
[0019]
本发明的有益效果在于：
[0020]
本发明开创性地采用微流控技术，利用了细胞在细胞膜表面形貌、细胞膜结构及膜蛋白表达等方面的差异而导致的细胞电学特性(如细胞膜比电容和细胞质电导率)方面的不同，实现单细胞的捕获，检测了单细胞的细胞膜比电容，从而达到细胞鉴别与分型的目的，有较高的灵敏度与特异性。
[0021]
本发明采用这种基于尺寸和电学特性的多维度的细胞的非标记式检测技术，可以实现巨噬细胞的电学特性“指纹图谱”的检测，从电学表征方面鉴定巨噬细胞m1表型。
[0022]
本发明采用的微流控技术单细胞电学流式细胞术方法检测细胞膜比电容的方法，可以无需化学标记、快速、特异、高区分度的鉴定m1型巨噬细胞，一方面可以帮助评估相关疾病包括肿瘤、感染性疾病、哮喘、动脉粥样硬化等疾病的发生、发展、转归；另一方面，该方法还可以评估靶向干预m1型巨噬细胞药物的效能。
[0023]
从鉴定m1型巨噬细胞的指标特异性的角度来说，目前没有一个单一指标可以鉴定m1型巨噬细胞，都是用多种分子标记物共同鉴定m1型巨噬细胞。本发明采用微流控技术从细胞整体层面检测巨噬细胞的电学特性(细胞膜比电容、细胞质电导率)发现，发现m1型巨噬细胞的细胞膜比电容显著高于m0型巨噬细胞、m2型巨噬细胞，大大提高了m1型巨噬细胞和m0、m2型巨噬细胞的区分度；并且用m1型巨噬细胞的抑制剂rosiglitazone maleate和m1型巨噬细胞的激活剂gw9662对m1型巨噬细胞进行干预，发现细胞膜比电容分别被显著下调和上调，两者对细胞膜比电容的影响，呈现出相反的趋势，验证了细胞膜比电容可以作为m1型巨噬细胞的特异性标记物。
[0024]
从鉴定m1型巨噬细胞水平的层面上来说，微流控技术是单细胞水平的检测方法，与流式细胞术一样，可以分析一个细胞群中m1型巨噬细胞的占比情况，而且标记物区分度高；而western blot、elisa、rt
‑
pcr这三种方法，不是单细胞水平的分析，是对一个细胞群体的标记物表达总量的半定量方法，分析方法比较粗糙。
[0025]
从检验m1型巨噬细胞的速度上说，本发明采用的微流控方法的检测速度，达到了3
‑
6个细胞/秒的速度，与流式细胞术相比，同样为单细胞水平的检测，但是免去了标记细胞的这一步骤；与western blot(1
‑
2天)、elisa(最短2小时左右)、rt
‑
pcr(4小时左右)相比，检测周期短很多，本发明采用交叉通道测量细胞的细胞膜比电容，不需要通过光学测量得到细胞长度，摆脱价格昂贵的显微镜和高速摄像头，同时简化测量步骤和操作难度。检测结果不需要进行图像处理等复杂的数据处理过程，可以实现自动化和实时处理。因此，无论是急性病还是慢性病，都可以快速的鉴定m1的表达，可以快速的鉴定m1型巨噬细胞的占比，将来可以用于疾病的诊断和预后，也可以用来筛选靶向调控m1型巨噬细胞表型的药物。
附图说明
[0026]
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]
图1为本发明实施例1中的巨噬细胞拍照图；
[0029]
图2为本发明实施例1中m0、m1、m2型巨噬细胞的细胞膜比电容/细胞质电导率图。
[0030]
图3为本发明实施例2中m0、m1、m2型巨噬细胞，以及m1型巨噬细胞的抑制剂rosiglitazone maleate和m1型巨噬细胞的激活剂gw9662对m1型巨噬细胞的细胞膜比电容影响的电学图和统计图。
具体实施方式
[0031]
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0032]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0033]
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0034]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]
实施例1
[0037]
本实施例用于说明本发明所述鉴定方法对巨噬细胞尤其是m1型巨噬细胞所进行的分型鉴定。
[0038]
一、m0、m1、m2巨噬细胞细胞诱导，培养与收集
[0039]
day0：(1)取两个六孔板，准备培养6孔细胞，m0、m1、m2各两孔。向每孔内加入1ml细胞培养液；(2)取培养了三天准备传代的培养瓶中的细胞，细胞浓度约为106cells/ml，向每孔内加1ml细胞悬液；(3)生物安全柜内拍照记录(20x，相差模式)；(4)向每孔内加入2μl100μg/ml pma(最终浓度100ng/ml)；诱导2天。
[0040]
day2：(1)生物安全柜内拍照记录(20x，相差模式)；(2)每孔换新的2ml培养液；(3)m1的2孔 2μl 100μg/ml lps(最终浓度100ng/ml)和2μl 20μg/ml ifn
‑
γ(最终浓度20ng/ml)；(4)m2的2孔 2μl 20μg/ml il
‑
4and 4μl 10μg/ml il
‑
13(最终浓度20ng/ml)；
[0041]
day3：生物安全柜内拍照记录(20x，相差模式)
[0042]
day4：(1)生物安全柜内拍照记录(20x，相差模式，图1)；(2)用于电学测试的m0、m1、m2细胞，在电学测试前，吸出培养液，加入1ml胰蛋白酶，消化5min，加入2ml培养液终止消化，拍照记录，吸出细胞装入5ml离心管，离心(900r/min，5min)，去2ml上清，将细胞吹散装入1.5ml离心管，离心(900r/min，5min)，去上清，加入300μl细胞培养液重悬。
[0043]
二、电学测量
[0044]
本发明采用公开号为cn106959391a的中国专利中所公开的细胞膜比电容检测系统，包括一对交叉通道，所述交叉通道的第一通道位于第一方向，第二通道位于与第一方向交叉的第二方向。当细胞受到驱动器驱动，通过细胞流入通道从细胞穿行压缩通道穿行时，阻抗测量模块记录电极间的阻抗变化，结合细胞电学等效模型计算得到该细胞的细胞膜比电容。
[0045]
在检测过程中，电信号频率的设置范围为1khz
‑
10mhz，驱动器的压力的设置范围为3kpa
‑
20kpa。每个测试周期为5min，可检测1000
‑
2000个细胞，并计算出细胞膜比电容与细胞质电导率。以细胞质电导率作为横坐标，细胞膜比电容作为纵坐标，绘制热点图，如图2所示。
[0046]
三、检测结果
[0047]
由图1可以看出，从细胞大小来看，与m0巨噬细胞相比，m1和m2巨噬细胞体积较大；从细胞形态来看，m1巨噬细胞呈梭形，m1和m2巨噬细胞呈圆形。说明m1和m2型的巨噬细胞诱导成功。
[0048]
由图2可以看出，纵坐标是细胞膜比电容，横坐标是细胞质电导率。从电学图及统计分析结果可以看出，m1型巨噬细胞的细胞膜比电容显著高于m0型巨噬细胞和m2型巨噬细胞，可以作为将m1和m0、m2区分开的指标。
[0049]
实施例2
[0050]
本实施例用于说明本发明所述鉴定方法对巨噬细胞尤其是m1型巨噬细胞所进行的分型鉴定。
[0051]
一、m0、m1、m2型巨噬细胞细胞诱导，并用m1型巨噬细胞的抑制剂与m1型巨噬细胞的激动剂进行干预，培养并收集。
[0052]
研究表明，pparγ的激动剂rosiglitazone可以抑制m1型巨噬细胞[pmid:32345753][pmid:32622513]，pparγ的抑制剂gw9662可以促进m1型巨噬细胞向m2型转化[pmid:32805581]。因此采用这两个药物进行干预，作为方法学的验证。
[0053]
day0：(1)取两个六孔板，准备培养10孔细胞，m0、m1、m1 rosiglitazone maleate、m1 gw9662、m2各两孔。向每孔内加入1ml细胞培养液；(2)取培养了三天准备传代的培养瓶中的细胞，细胞浓度约为106cells/ml，向每孔内加1ml细胞悬液；(3)生物安全柜内拍照记录(20x，相差模式)；(4)向每孔内加入2μl100μg/ml pma(最终浓度100ng/ml)；诱导2天。
[0054]
day2：(1)生物安全柜内拍照记录(20x，相差模式)；(2)每孔换新的2ml培养液；(3)m1的2个孔，m1 rosiglitazone maleate的2个孔，m1 gw9662的2个孔，以上6个孔均加入2μl 100μg/ml lps(最终浓度100ng/ml)和2μl 20μg/ml ifn
‑
γ(最终浓度20ng/ml)；(4)m2的2个孔均加入2μl 20μg/ml il
‑
4和4μl 10μg/ml il
‑
13(最终浓度20ng/ml)；
[0055]
day3：(1)生物安全柜内拍照记录(20x，相差模式)；(2)加入可以干预m1的药物：m1 40μm rosiglitazone maleate，m1 10μm gw9662；
[0056]
day4：用于电学测试的m0、m1、m2、m1 40μm rosiglitazone maleate、m1 10μm gw9662细胞，在电学测试前，吸出培养液，加入1ml胰蛋白酶，消化5min，加入2ml培养液终止消化，拍照记录，吸出细胞装入5ml离心管，离心(900r/min，5min)，去2ml上清，将细胞吹散装入1.5ml离心管，离心(900r/min，5min)，去上清，加入300μl细胞培养液重悬。
[0057]
二、电学测量
[0058]
测量方法同实施例1，m0、m1、m2型巨噬细胞以及m1型巨噬细胞经过m1型巨噬细胞抑制剂rosiglitazone和m1型巨噬细胞激活剂gw9662的干预以后，各细胞膜比电容(表示为csm)及其变化的小提琴图见图3。
[0059]
三、检测结果
[0060]
由图3可以看出，m1型巨噬细胞的抑制剂rosiglitazone可以降低细胞膜比电容、m1型巨噬细胞的激活剂gw9662可以显著升高细胞膜比电容。巨噬细胞的电学检测速率约为3
‑
6个细胞/秒。采用计算软件可以实时分析数据，实现了高效的数据分析。
[0061]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明
将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种m1型巨噬细胞的鉴定方法，其特征在于，采用微流控技术从单细胞整体层面检测巨噬细胞的电学特性，以细胞膜比电容作为检测指标，对待测样品进行检测，待测样品为单细胞或细胞群，根据检测结果判断待测样品是否为m1型巨噬细胞，或根据检测结果计算待测样品中m1型巨噬细胞的含量或占比。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，当所检测的巨噬细胞单细胞的细胞膜比电容满足单细胞电学特性标定体系中m1型巨噬细胞细胞膜比电容范围时，判断其为m1型巨噬细胞。3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，将细胞群中的单细胞检测鉴定，根据鉴定结果统计计算细胞群中m1型巨噬细胞的占比，实现对待测细胞群中m1型巨噬细胞的定量检测。4.细胞电学特性检测方法在m1巨噬细胞鉴定分型中的应用。5.细胞膜比电容在作为m1巨噬细胞鉴定分型检测指标中的应用。6.一种巨噬细胞指纹图谱，其特征在于，采用微流控技术，以细胞质电导率为横坐标，以细胞膜比电容为纵坐标，每个细胞为一点，绘制出的单细胞电学特性散点分布热图。7.权利要求1
‑
3任意一项所述的鉴定方法在预测与m1型巨噬细胞相关的慢性疾病进展和急性疾病预后中的应用。8.权利要求1
‑
3任意一项所述的鉴定方法在体内回输m1型巨噬细胞进行细胞治疗的质量控制中的应用。9.权利要求1
‑
3任意一项所述的鉴定方法在筛选靶向调控m1型巨噬细胞的相关药物方面的应用。
技术总结
本发明涉及细胞检测与分型技术领域，具体公开了一种M1型巨噬细胞的鉴定方法。本发明所述方法采用微流控技术从单细胞层面检测巨噬细胞的电学特性，根据检测结果细胞膜比电容判断待测样品是否为M1型巨噬细胞，或根据检测结果计算待测样品中M1型巨噬细胞的含量或占比，并可应用本方法，进行高通量的靶向M1型巨噬细胞的药物筛选。本发明开创性地利用了细胞在表面形貌、细胞膜结构、膜蛋白表达和胞浆成分等方面的差异而导致的细胞电学特性(如细胞膜单位面积电容、细胞质电导率)特性方面的不同，达到细胞鉴别与分型的目的，有较高的灵敏度与特异性。异性。


技术研发人员：赵海苹 赵阳 黄成军 叶一菲 栾晓凤 李宇昂
受保护的技术使用者：中国科学院微电子研究所
技术研发日：2021.02.25
技术公布日：2021/6/29