一种产3-甲硫基丙醇的链霉菌及其在防治植物卵菌和真菌病害中的应用的制作方法

一种产3
‑
甲硫基丙醇的链霉菌及其在防治植物卵菌和真菌病害中的应用
技术领域
1.本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种链霉菌，具体涉及一种分离自马铃薯产区的产3
‑
甲硫基丙醇的链霉菌及其在防治植物卵菌和真菌病害中的应用。


背景技术：

2.马铃薯是茄科茄属双子叶植物，也是全球第四大粮食作物，其地位仅次于小麦、水稻和玉米。而由致病疫霉(phytophthorainfestans)引起的马铃薯晚疫病，是马铃薯生产上最具毁灭性的病害之一。致病疫霉被归类为卵菌，可通过空气进行传播。致病疫霉在合适的温湿度条件下，可在较短时间内致使田间大面积发病，造成绝收。目前马铃薯晚疫病的防控主要依赖于化学农药防治，但该方法以环境污染和威胁粮食安全为代价。因此，积极挖掘化学农药代替品，例如微生物源的生物防治剂，对我国马铃薯晚疫病发生区的科学防治具有十分重要的作用。
3.番茄是茄科茄属双子叶植物。因番茄果实独特的外观、风味和高营养价值使之成为世界上最受欢迎的果蔬之一。然而，番茄果实极易受真菌侵染，导致果实品质恶化，保质期缩短。番茄灰霉病由灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)引起，是影响番茄果实最严重的病害之一，也是造成番茄采后损失率高的原因。灰葡萄孢是核盘菌科、孢盘菌属真菌，可以导致多种植物产生灰霉病。尽管灰霉菌是一种典型的“高风险”病原菌，但采后病害通常是通过使用化学杀菌剂来实现的。过度使用这些化学杀菌剂会对环境、食品安全和人类健康造成危害，甚至会导致抗真菌菌株的产生。因此，为了控制番茄灰霉病，延长番茄果实的贮藏寿命，迫切需要从生物源中提取安全的抗菌剂。近年来，大量生物源杀菌剂或一般认为安全的物质(gras)已成功用于控制各种水果的采后病害，如香芹酚、甲基苏合香和从植物或微生物中获得的各种含硫香料化合物。
[0004]3‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇(分子式为c4h
10
os，又名3
‑
甲硫基丙醇)是一种含硫香料化合物，天然存在于许多水果、啤酒和麦芽威士忌中。关于3
‑
甲硫基丙醇的现有报告表明，它主要对葡萄酒、面包和其他食品的风味质量有显著贡献。此外，3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇还可以提高0.3％味精溶液中的鲜味，用于补偿食品中氯化钠的减少。3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇的抗菌活性至今未见报道。而关于产3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇的链霉菌菌株也没有被报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的发明人从马铃薯产区分离到一株产3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇的链霉菌a10，通过实验证实该菌株a10能够抑制植物致病菌致病疫霉和灰葡萄孢菌，有望成为植物真菌病害和卵菌病害防治的新的生防试剂。基于此，本发明请求保护如下技术方案：
[0006]
一种产3
‑
甲硫基丙醇的链霉菌(streptomycessp.)a10，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为cgmccno.21146。
[0007]
上述的链霉菌或其发酵产物在防治植物卵菌或真菌病害中的应用，或在制备防治
植物卵菌或真菌病害产品中的应用；优选所述发酵产物为乙酸乙酯提取物。
[0008]
优选地，所述植物卵菌病害为晚疫病，进一步优选所述植物卵菌病害的致病菌为致病疫霉。
[0009]
优选地，所述植物真菌病害为灰霉病，进一步优选所述植物真菌病害的致病菌为灰葡萄孢菌。
[0010]
一种防治植物卵菌和真菌病害的产品：其活性成分包含链霉菌(streptomyces violascens)a10 cgmccno.21146或/和a10的发酵产物；
[0011]
优选所述发酵产物为乙酸乙酯提取物。
[0012]
优选地，所述a10的发酵产物中包含3
‑
甲硫基丙醇或/和氧化石竹烯。
[0013]
本发明还请求保护3
‑
甲硫基丙醇在防治植物卵菌或真菌病害中的应用。
[0014]
优选地，所述植物卵菌病害为晚疫病，优选所述植物卵菌病害的致病菌为致病疫霉；
[0015]
所述植物真菌病害为灰霉病，优选所述植物真菌病害的致病菌为灰葡萄孢菌。
[0016]
本发明的有益效果是：本申请从中国马铃薯产区土壤中分离鉴定出一株产3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇的链霉菌(streptomyces violascens)a10，经实验证实，a10菌体及其发酵产物3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇对马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉和番茄灰霉病致病菌灰葡萄孢菌均有显著的抑制作用，其发酵产物氧化石竹烯对致病疫霉也有显著的抑制作用，a10是一株效果显著的生防菌；a10发酵液经100℃处理30min对致病疫霉仍有显著的抑制作用。本申请的这株链霉菌a10及其发酵产物3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇、氧化石竹烯具有可作为防治马铃薯晚疫病和/或番茄灰霉病的生防制剂的极大前景，有望为植物真菌病害和卵菌病害的防治提供一种新的生防试剂，减少化学农药使用，保护环境。
附图说明
[0017]
图1是a10菌株对致病疫霉的拮抗活性实验结果。
[0018]
图2是a10菌株在不同培养基上的生长情况图。
[0019]
图3是a10菌株基于16s rrna的系统发育树。
[0020]
图4是a10的乙酸乙酯提取物经不同温度处理后的抑菌作用实验结果。
[0021]
图5是a10发酵产物中的挥发性物质3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇、氧化石竹烯的抑卵菌作用实验结果。
[0022]
图6是a10发酵产物中的挥发性物质3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇的抑真菌作用实验结果。
[0023]
图7是3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇熏蒸处理抑制番茄果实灰霉病实验结果。
具体实施方式
[0024]
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
[0025]
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0026]
主要试剂来源：
[0027]
各实施例中所用培养基如无特殊说明，均为本领域常规培养基。
[0028]3‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇(cas号为505
‑
10
‑
2)纯度≥99％、氧化石竹烯(cas号为1139
‑
30
‑
6)纯度≥95％，均通过商购获得。各实施例中所用其它生物和化学试剂如无特殊说明，
均为本领域常规试剂，均可商购获得。
[0029]
实施例1、a10菌株的分离及拮抗活性
[0030]
2018年6月从重庆市巫溪县马铃薯栽培区的马铃薯根际进行样品采集。将根际土利用梯度稀释的方法涂布在高氏1号培养基上，28℃恒温暗培养15天。将致病疫霉与分离菌进行对峙培养，持续观察并筛选到对致病疫霉菌丝有强抑制作用的分离菌a10。进一步利用划线法进行菌株纯化，得到单菌落a10。图1是致病疫霉与a10平板对峙实验，结果显示a10对致病疫霉菌丝有强抑制作用(图1a,1b)，且持续培养3个月后a10依然强烈抑制致病疫霉的生长(图1c,1d)。
[0031]
实施例2、a10在不同培养基上的生长
[0032]
采用国际链霉菌计划(isp)所指定的7种培养基，即胰蛋白胨酵母提取物肉汤培养基(isp
‑
1)、酵母膏麦芽膏琼脂培养基(isp
‑
2)、燕麦粉琼脂培养基(isp
‑
3)、无机盐淀粉琼脂培养基(isp
‑
4)、甘油天冬酰胺琼脂培养基(isp
‑
5)、蛋白胨酵母提取物铁琼脂培养基(isp
‑
6)、酪氨酸琼脂培养基(isp
‑
7)。将各种培养基灭菌后倒在无菌的培养皿中(60mm直径)，培养基冷却后每皿涂布20μl a10孢子悬浮液(将菌株a10在高氏1号固体培养上28℃暗培养7天，洗下a10的孢子，得到5ml孢子悬浮液)。在超净台中吹干水分，用封口膜封住。置于28℃恒温暗培养7天。结果如图2所示，除isp
‑
4，a10在国际链霉菌计划中的6种培养基上均能迅速生长。
[0033]
实施例3、a10菌株鉴定
[0034]
将a10接种于常规马铃薯葡萄糖液体培养基在28℃摇床培养3天。通过离心法收集a10菌体沉淀。采用细菌基因组dna提取试剂盒提取a10基因组dna，电泳检测正确后进行pcr扩增。引物27f序列为:agagtttgatcctggctca(seq id no:1)，引物1492r序列为:ggttaccttgttactt(seq id no:2)。ex taq为takara公司(中国，大连)产品，货号drr001a。
[0035]
pcr反应体系如下：
[0036][0037]
pcr反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，24个循环；72℃10min。
[0038]
然后电泳检测，送测序，分析结果序列并进行拼接得到a10的16s rrna序列(seq id no:3)。
[0039]
基于16s rrna序列选择与ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)对比到种属水平上最接近的11株菌，通过mega 6.0软件选择nj(neighbor
‑
joining)法构建系
统进化树。系统发育树如图3所示，本实验从中国马铃薯产区重庆巫溪县的马铃薯根际土壤中分离获得的细菌样本a10归属于链霉菌属(streptomyces)，未鉴定到种。我们进一步将a10的dna做全基因组完成图测序分析，发现a10与streptomyces violascens的平均核苷酸一致性(ani)最高(表1)。因此，a10被鉴定为streptomyces violascens strainsa10。
[0040]
表1.基于a10和链霉菌全基因组序列的ani值
a
.
[0041][0042][0043]
a
,
b
这些链霉菌的16s rrna序列与a10高度相似，这也与图3一致；
[0044]
c
,
d
如果某一链霉菌有多个基因组数据，则选择组装水平高、大小大的基因组序列。
[0045]
e
基于a10和链霉菌之间的全基因组序列的ani值通过在线ani计算器计算：https://www.ezbiocloud.net/tools/ani。
[0046]
实施例4、a10的乙酸乙酯提取物经不同温度处理后的抑菌实验
[0047]
a10在200rpm和28℃的无菌isp2液体培养基中暗培养7天，得到a10发酵液。将1升a10发酵液以12000rpm离心15分钟，并使用等体积乙酸乙酯提取上清液。旋转蒸发乙酸乙酯相，在1ml乙酸乙酯中再悬浮，并通过0.22μm细菌过滤器过滤，得到a10粗提物。对于温度测试，按前面步骤收集a10发酵液的乙酸乙酯相，分别在30℃、70℃、100℃下处理30分钟。通过琼脂孔扩散法评估a10粗提物对菌丝生长的抑制活性。用无菌软木钻在黑麦培养基(直径60mm)上打孔四个孔(直径5mm)。然后，向每个孔中添加20μla10粗提物。以等量乙酸乙酯(10％，v/v)作为对照。在每个培养皿的中心无菌放置一个致病疫霉菌盘(直径5mm)。每次实验重复3次。拮抗活性用抑制百分比表示，结果如图4所示：在30℃条件下，a10无细胞发酵液对马铃薯晚疫病菌的抑菌活性最强，70℃和100℃处理的a10无细胞发酵液对菌丝生长仍具有显著的抑菌活性，抑制率分别为77.21％和79.80％。
[0048]
实施例5、a10发酵产物中的代谢物检测
[0049]
a10在200rpm和28℃的无菌isp2液体培养基中暗培养7天，然后在12000rpm下离心15分钟，并用0.22μm细菌过滤器过滤收集a10无细胞发酵液(a10
‑
nc)。利用液相色谱
‑
串联质谱(lc
‑
ms)技术对a10无细胞发酵液进行了广泛非靶向代谢物检测分析，以isp2液体培养基为对照(ck)。在a10无细胞发酵过程中，共鉴定出559种代谢物，这些代谢物属于胺、有机酸、挥发性化合物、小肽等(如5
‑
羟色胺、吲哚
‑3‑
乙醇)。其中，前10位的代谢物分别是去铁氧胺、鲁氟沙星、脲基异丁酸、泽隆酮、氧化石竹烯、高香兰素、3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇、苯丙氨酸、赖氨酸
‑
亮氨酸
‑
天冬氨酸和亮氨酸
‑
丙氨酸
‑
缬氨酸，如表2中所示。
[0050]
表2 a10无细胞发酵液中前10位代谢产物分析
[0051][0052]
其中，ck
a
、a10
‑
nc
b
列数据表示lc
‑
ms检测的各代谢物的数值。
[0053]
实施例6、a10发酵产物中的挥发性物质(3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇、氧化石竹烯)的抑卵菌作用
[0054]
通过二分格平板(直径90mm,高15mm)分别进行挥发性物质3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇和氧化石竹烯的抑菌检测。在二分格的一侧加入黑麦培养基并接种致病疫霉，在二分格的另一侧放置一张无菌滤纸条，并滴入200μl待测化合物(其中3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇化合物是液态的，直接使用；氧化石竹烯的实验浓度为30mg/ml)，以滴入等体积无菌水为对照。为了防止挥发性化合物(3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇、氧化石竹烯)的损失，培养板用封口膜密封并在20℃黑暗中培养。培养7天后，通过测量两个垂直方向上菌落的直径来确定平均径向生长(参照najdabbasi等人的方法，2020)。每次实验重复3次。拮抗活性用上述抑制百分比表示。a10发酵产物中的挥发性物质(3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇、氧化石竹烯)的抑卵菌作用如图5所示：结果表明，3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇和氧化石竹烯对马铃薯晚疫病菌有明显的抑制作用，抑制率分别为60.35％和56.52％。
[0055]
实施例7、a10发酵产物中的挥发性物质(3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇)的抑真菌作用
[0056]
通过二分格平板进行挥发性物质的抑菌检测。在二分格的一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基并接种灰霉菌，在二分格的另一侧放置一张无菌滤纸条，并滴入20，200μl待测化合物(液态3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇直接用于实验)，以滴入200μl无菌水为对照。为了防止挥发性化合物(3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇)的损失，培养板用封口膜密封并在28℃黑暗中培养。培养5天后，通过测量两个垂直方向上菌落的直径来确定平均径向生长。每次实验重复3次。a10发酵产物中的挥发性物质(3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇)的抑真菌作用如图6所示：(3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇)显著抑制灰霉菌菌丝生长，呈剂量依赖性。
[0057]
实施例8、3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇熏蒸处理抑制番茄果实灰霉病
[0058]
将大小均匀且无病害的番茄洗净晾干，置于大的玻璃培养皿(直径和高分别为15cm,5.5cm)中，每个培养皿放10个番茄。在大的玻璃培养皿中再放置一个直径为6cm的小培养皿，小培养皿中放置一张滤纸。将所有番茄赤道位置用无菌牙签划伤后，接种3mm的灰
霉菌菌块。在小培养皿中添加50μl 3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇(3
‑
mp)，而后立刻将培养皿密封。以添加50μl无菌水代替3
‑
mp处理作为对照。置于28℃恒温培养箱暗培养，每隔12小时测量番茄的病斑。结果如图7所示：。3
‑
(甲硫基)
‑1‑
丙醇熏蒸处理显著延迟了番茄上灰霉菌的侵染，显著减少了番茄上的病斑面积。
[0059]
将菌株a10于2020年11月送中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年11月09日，保藏编号为cgmcc no.21146，分类名为链霉菌streptomyces sp.。

技术特征：
1.一种产3
‑
甲硫基丙醇的链霉菌(streptomyces sp.)a10，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为cgmcc no.21146。2.权利要求1所述的链霉菌或其发酵产物在防治植物卵菌或真菌病害中的应用，或在制备防治植物卵菌或真菌病害产品中的应用；优选所述发酵产物为乙酸乙酯提取物。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物卵菌病害为晚疫病，优选所述植物卵菌病害的致病菌为致病疫霉。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物真菌病害为灰霉病，优选所述植物真菌病害的致病菌为灰葡萄孢菌。5.一种防治植物卵菌和真菌病害的产品，其特征在于：其活性成分包含链霉菌(streptomyces violascens)a10 cgmcc no.21146或/和a10的发酵产物；优选所述发酵产物为乙酸乙酯提取物。6.如权利要求5所述的防治植物卵菌和真菌病害的产品，其特征在于：所述a10的发酵产物中包含3
‑
甲硫基丙醇或/和氧化石竹烯。7.3
‑
甲硫基丙醇在防治植物卵菌或真菌病害中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物卵菌病害为晚疫病，优选所述植物卵菌病害的致病菌为致病疫霉；所述植物真菌病害为灰霉病，优选所述植物真菌病害的致病菌为灰葡萄孢菌。
技术总结
本发明公开了一种产3


技术研发人员：冯顺 金良 董攀 李正国 简永飞 汤世才
受保护的技术使用者：重庆大学
技术研发日：2021.03.18
技术公布日：2021/6/29