一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

1.本发明涉及一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。


背景技术：

2.耶尔森氏菌属属于肠杆菌科，由三种人类致病菌组成：鼠疫耶尔森氏菌(鼠疫病原体)，假结核耶尔森氏菌和负责人肠道耶尔森氏菌病的小肠结肠炎耶尔森氏菌。肠型耶尔森菌病是由于食用受污染的食物或水引起的食源性疾病，可通过粪
‑
口途径在人群之间传播。肠型耶尔森菌病通常以在肠道中开始的自限性急性感染为特征，并且通常限于回盲肠交界处。腹泻是小肠结肠炎耶尔森氏菌感染的主要症状。此外，小肠结肠炎耶尔森氏菌还可以引起不同的临床症状，例如皮疹，结膜炎，急性器官衰竭和中毒性休克综合症，也可能发生更严重的感染和败血症，尤其是在新生儿，老年人和免疫功能低下的患者中。小肠结肠炎耶尔森氏菌在世界范围内广泛分布，在寒冷和温带地区发病率更高。大多数与人类耶尔森氏菌病相关的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株均属于2/o：9、4/o：3、2/o：5,27、3/o：3和1b/o：8血清型。据统计，小肠结肠炎耶尔森氏菌是法国和欧洲仅次于弯曲杆菌和沙门氏菌的第三大细菌性腹泻病原体。
3.目前，通过从粪便培养物中直接分离肠致病性耶尔森氏菌，并在特定的肉汤中富集，然后再在头孢磺啶
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氯苯酚
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新生霉素的半选择性培养基上进行分离，生化鉴定，即可检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。然而，在选择性培养基上进行分离，需要耗时的富集步骤。一些分子技术应用于小肠结肠炎耶尔森氏菌分析检测，例如dna菌落杂交，pcr，实时pcr，多基因座序列分型和脉冲场凝胶电泳等。但是，其中大部分技术都需要分离细菌或富集步骤，还需要特定的设备，及专业的操作人员。免疫分析由于操作简单、快速、实时检测、反应灵敏、价格便宜等优点广泛地应用于食源性致病菌分析检测，为食源性致病菌提供另一种检测途径。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
5.本发明的第一个目的是提供一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株jsl 3h3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号cgmcc no.20786。
6.本发明的第二个目的是提供小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体，由保藏编号为cgmcc no.20786的单克隆细胞株jsl 3h3分泌产生。
7.本发明的第三个目的是提供小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的应用。
8.本发明的一种实施方式中，所述应用是食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分析检测。
9.本发明的一种实施方式中，一种试剂盒，含有所述的单克隆细胞株jsl3h3。所述试剂盒在检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的中的应用。
10.本发明的第四个目的是提供小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原的制备方法。
11.本发明的小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：
12.(1)完全抗原的制备：小肠结肠炎耶尔森氏菌(cicc 21681,cicc 21669,cicc 21668,cicc 21567,cicc 21565,cicc 10869)购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。将小肠结肠炎耶尔森氏菌接入100ml lb肉汤培养基中，180rpm，28℃下搅拌过夜，然后将小肠结肠炎耶尔森氏菌过夜培养物在100℃的水浴中加热灭活15min，4℃，5000
×
g离心20min，收获细菌，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于5ml pbs中，
‑
20℃保存；
13.(2)小鼠的免疫：将灭活的小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原与等体积弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic
‑
elisa)检测小鼠血清效价；
14.(3)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(peg 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic
‑
elisa)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic
‑
elisa测定阳性细胞孔的交叉反应，通过有限稀释法对高阳性且对其他革兰氏阳性及革兰氏阴性菌无交叉反应的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株jsl 3h3；
15.(4)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过双抗夹心elisa测定检测限和特异性。
16.本发明的有益效果：本发明提供的小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有较好的特异性，为检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌含量提供了免疫学方法。本发明提供的小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，具有实际应用价值。
17.生物材料样品保藏：一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株jsl 3h3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号cgmcc no.20786。
附图说明
18.图1小肠结肠炎耶尔森氏菌的双抗夹心elisa标准曲线。
具体实施方式
19.本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
20.本发明通过将小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic
‑
elisa筛选细胞上清，最终得到了对小肠结肠炎耶尔森氏菌有较好特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞株jsl 3h3。
21.实施例1杂交瘤细胞株jsl 3h3的制备
22.(1)完全抗原的制备：将小肠结肠炎耶尔森氏菌接入100ml lb肉汤培养基中，180rpm，28℃下搅拌过夜，然后将肠结肠炎耶尔森氏菌过夜培养物在100℃的水浴中加热灭活15min，4℃，5000
×
g离心20min，收获细菌，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于5ml pbs中，
‑
20℃保存。
23.(2)动物免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。将小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原与等体积弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μl 995μl抗体稀释液＝抗血清)，使用ic
‑
elisa测定小鼠血清效价，选择效价高的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
24.(4)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
25.a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入体积浓度75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用rpmi
‑
1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
26.b、收集sp2/0细胞：融合前7
‑
10天，将sp2/0瘤细胞用含10％fbs(胎牛血清)rpmi
‑
1640培养基在5％co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚
×
107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi
‑
1640基础培养液中，进行细胞计数；
27.c、融合过程7min：第1min，将1ml的peg 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1ml rpmi
‑
1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2ml rpmi
‑
1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi
‑
1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50
×
hat的rpmi
‑
1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
28.(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi
‑
1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100
×
ht的rpmi
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1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic
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elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用小肠结肠炎耶尔森氏菌及其他常见的革兰氏阳性菌和阴性菌，用ic
‑
elisa对阳性细胞进行交叉反应的测定。选择对小肠结肠炎耶尔森氏菌有较好特异性且对其他细菌无交叉反应的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株jsl 3h3。
29.(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8
‑
10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸
‑
硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂
蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01m pbs溶液(ph 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于
‑
20℃保存。杂交瘤细胞株jsl 3h3的单克隆抗体亚型鉴定如表1所示。
30.表1杂交瘤细胞株jsl 3h3的单克隆抗体的亚型鉴定
31.抗体亚型od
450nm
igm0.3762iga0.3214igg10.980333igg2a1.302igg2b2.012igg30.531kappa1.895lambda1.018
32.实施例2小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的应用
33.将杂交瘤细胞株jsl 3h3通过小鼠腹腔腹水制备的单克隆抗体应用于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测，ic
‑
elisa检测抗体效价具体步骤如下：
34.(1)包被：将小肠结肠炎耶尔森氏菌用0.05m ph9.6碳酸盐缓冲液从108cfu/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h；
35.(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
36.(3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
37.(4)加样：将抗体从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp
‑
羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min；
38.(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min；
39.(6)终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od
450
值。
40.食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌双抗体夹心elisa测定步骤：
41.(1)包被：用浓度为4μg/ml的细胞株编号为jsl 3h3的抗体包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；
42.(2)洗涤：用pbst洗涤反应板三次，每次3min，200μl/孔，然后甩干反应板；
43.(3)封闭：加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h；
44.(4)洗涤：同步骤(2)；
45.(5)样品：用pbs将小肠结肠炎耶尔森氏菌稀释成107cfu/ml，再三倍进行梯度稀释；另设一个pbs空白对照。每孔加入100μl样品，于37℃温育1h；
46.(6)洗涤：同步骤(2)；
47.(7)加酶标抗体(jsl 3h3
‑
hrp，2μg/ml)，100μl/孔，37℃反应1h；
48.(8)洗涤：同步骤(2)；
49.(9)显色：加tmb显色液100μl/孔，显色12min；
50.(10)终止：加终止液50μl/孔；
51.(11)测定：用酶标仪检测od
450nm
。
52.溶液的配置：
53.碳酸盐缓冲液(cbs)：称取na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；
54.磷酸盐缓冲液(pbs)：8.0g nacl，0.2g kcl，0.2g kh2po4，2.9g na2hpo4·
12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
55.洗涤液(pbst)：1000ml的0.01mol/l ph7.4的pbs溶液中加入0.5ml的tween
–
20；pbst：含0.05％tween
–
20的pbs；
56.抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
57.tmb显色液：a液：na2hpo4·
12h2o 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mg tmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1:5混合即为tmb显色液，现用现混。
58.试验结果如下：本发明所获得的小肠结肠炎耶尔森氏菌双抗夹心elisa标准曲线如图1所示，所获得的小肠结肠炎耶尔森氏菌检测曲线方程为y＝2.645
‑
2.489/[1 (x/32284.005)^0.886](r2＝0.9990)，检测限为3.38
×
103cfu/ml。具体请见图1。杂交瘤细胞株jsl 3h3的单克隆抗体的交叉反应如表2所示。
[0059]
表2杂交瘤细胞株jsl 3h3的单克隆抗体的交叉反应
[0060][0061][0062]
综上所述，说明小肠结肠炎耶尔森氏菌杂交瘤细胞准jsl 3h3所产生的单克隆抗体对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有高灵敏度和高特异性，可用于小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫分析检测。
[0063]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技
术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株jsl 3h3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号cgmcc no.20786。2.一种小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为cgmcc no.20786的杂交瘤细胞株jsl 3h3分泌产生。3.小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原的制备方法，其特征在于：将小肠结肠炎耶尔森氏菌接入lb肉汤培养基中，常温下搅拌过夜，然后将小肠结肠炎耶尔森氏菌在水浴中加热灭活，离心，从过夜培养物中收获细菌，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于pbs缓冲液中，冷冻保存。4.根据权利要求3所述小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：将小肠结肠炎耶尔森氏菌接入100ml lb肉汤培养基中，180rpm、28℃下搅拌过夜；然后将小肠结肠炎耶尔森氏菌过夜培养物在100℃的水浴中加热灭活15min；4℃、5000
×
g离心20min，收获细菌，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于5ml pbs缓冲液中，
‑
20℃保存。5.根据权利要求3所述小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原的制备方法，其特征在于：所述小肠结肠炎耶尔森氏菌具体为cicc 21681、cicc 21669、cicc 21668、cicc 21567、cicc 21565、cicc 10869。6.权利要求2所述小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的应用，其特征是：建立小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性检测，应用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的分析检测。7.根据权利要求6所述小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的应用，其特征是：所述检测领域为食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分析检测。8.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的单克隆细胞株jsl3h3。9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于食品安全中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分析检测。10.权利要求8或9所述试剂盒在检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的中的应用。
技术总结
一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株JSL3H3，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20786。此细胞株分泌的单克隆抗体，对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有较好的特异性和检测灵敏度。本发明合成了小肠结肠炎耶尔森氏菌完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株JSL 3H3。此细胞株分泌的单克隆抗体，对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有较好的特异性，本发明成果可用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性检测，具有实际应用价值。具有实际应用价值。


技术研发人员：胥传来 曾露 匡华 徐丽广 孙茂忠 刘丽强 吴晓玲 宋珊珊 胡拥明 郝昌龙
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2021.04.06
技术公布日：2021/6/29