治疗类风湿性关节炎的方法与流程

治疗类风湿性关节炎的方法
1.相关申请的交叉引用:
2.本申请要求于2018年10月18日提交的美国临时专利申请第62/747,581号以及于2018年12月5日提交的美国临时专利申请第62/775,631号的优先权。这些在先申请和公开以全文引用的方式并入本文。


背景技术：

3.自身免疫性疾病是对正常身体部分异常免疫反应的结果。导致此状况的诱因通常未知。目前，对多种自身免疫性疾病的治疗涉及促炎性因子(例如，抗tnfα抗体)，或者涉及控制这些细胞因子的释放(例如，jak抑制剂)。
4.尽管引入抗tnf和抗il1与传统疾病改善药物(dmard)的组合疗法已改善了对自身免疫性疾病的治疗，仍有相当数量的患者要么对治疗方案没有应答，要么最终变得对治疗产生难治性。
5.因此，对用于治疗自身免疫疾病的新疗法存在着极大需求。此外，还需要新的方法来确定新的治疗方法，以更具体地针对自身免疫疾病的根本原因，从而更具体地针对症状而不影响免疫系统。


技术实现要素：

6.本发明还提供了通过b细胞特异性抗cd22抗体干扰b细胞来治疗自身免疫性病症的方法，该方法采用在多个周期中多次、每两周一次、两个周期间跨越12周的给药方案。每两周给药相对于每周给药具有许多优点，包括但不限于，总注射次数更少，患者配合度提高(即，由于注射频率较低)，并且患者以及医疗服务人员的成本更低。
7.本发明还提供了治疗因b细胞(包括不同的b细胞亚型，如调节性b细胞(breg))的调节和/或抑制功能丧失所致的自身免疫性疾病的方法。这种调节和/或抑制功能的丧失可归因于与其配体结合的cd22和/或其他siglecs从顺式到反式构型的转化不足，或者人cd22和/或其他siglecs上的自由配体结合位点因这些位点被顺式配体结合“掩蔽”而不可用。优选地，抗siglecs抗体是靶向优选存在于具有高亲和力的人cd22的结构域2中的表位的抗cd22抗体，其与人cd22的结合将导致人cd22的同源多聚结构的破坏，同时在空间上阻碍人cd22配体的顺式再接合；当人cd22在与抗cd22抗体结合而被诱导内化时，人cd22上用于反式结合的配体结合位点的可用性将进一步得到改善。内化将顺式结合的cd22带入胞内体/溶酶体中，此处低ph环境将释放所有配体结合；重新表面化的cd22(经由再循环(recycling))将与抗cd22抗体结合(对于在内化过程中已经被抗cd22抗体结合的cd22而言，再循环的cd22将在重新表面化时继续被抗cd22抗体结合)，防止进一步顺式配体结合，并使得更多的cd22可用于反式配体结合。cd22与其他造血细胞上的配体的反式结合对于诱导和维持自身抗原耐受性来说非常重要。
8.本发明还提供了鉴定用于恢复b细胞对自身组织免疫抑制功能的人cd22或其他siglec特异性抗体的方法，以及通过允许cd22与其他造血细胞上的配体接合来使用这些抗
体恢复对自身组织免疫耐受的方法。所鉴定的抗体用于治疗免疫系统对自身组织的过度反应有害的病症。该方法包括对受试者每两周一次施用抗体的静脉内注射。抗体优选为重组抗体(嵌合或框架搭接(framework
‑
patched)/人源化的)，所述重组抗体特异性结合人siglecs，优选人cd22，更优选人cd22的结构域2，最优选结合位于人cd22的结构域2中的构象不连续表位。
9.本发明还提供了治疗其中对自身组织的过度反应性免疫活性有害的病症的方法。这些方法包括利用组合疗法，在该组合疗法中，将人抗体与另一种治疗剂一起施用给受试者，所述另一种治疗剂例如结合其他靶标的一种或多种其他抗体(例如，结合其他细胞因子(包括il1β、il6、l12、il13、il17a、il20、il22、il23、tnfα)以及其他细胞表面受体(如cd4、cd5、cd20、cd28、cd147、cd154(cd40l)、gmcsf
‑
受体)的抗体)、一种或多种细胞因子、可溶性tnfα受体和/或一种或多种抑制上述细胞因子和/或表面受体的产生和活性的化学剂，例如和优选地，甲氨蝶呤，和/或jak(jak1、2、3和酪氨酸激酶2)抑制剂。抗体优选为特异性结合人cd22的重组嵌合或框架搭接(framework
‑
patched)(人源化)抗体。本发明抗体的特征在于，在存在于人cd22的结构域2中的特定表位处以高亲和力结合人cd22，并且在于通过cd22诱导的细胞失活以及可能的轻度细胞毒性来抑制b细胞活性。
10.抗体可为全长的(例如，igg1或igg4抗体)，或者可以仅包含抗原结合部分(例如，fab、fab’、f(ab)
’2、scfv片段或单个结构域)。
11.在另一实施方式中，重组抗体为sm03(嵌合)或sm06(通过框架搭接(framework patching)人源化的形式)，并且具有包含seq id no：004的氨基酸序列的轻链cdr3结构域和包含seq id no:008的氨基酸序列的重链cdr3结构域(在附录01中阐述)。在一些实施方式中，sm03抗体具有包含seq id no：001的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)和包含seq id no:005的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)；而sm06抗体具有包含seq id no:009的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)和包含seq id no:010的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)。这些抗体在中国专利zl 03123054.7和zl 011 44894.6以及美国专利7,321,026b2和7,338,659b2中描述，以上文献以全文引用的方式并入本文。
12.在一个实施方式中，本发明提供了用于鉴定和评价抗体的方法，所述抗体能有效破坏人cd22的顺式连接以进行反式结合，从而诱导对自身抗原的免疫耐受性或抑制活性。该方法包括产生表达细胞外人cd22的细胞系(该细胞系不具有用于顺式连接的a2
‑6‑
相连的唾液酸(2,6sia)残基(仅可以与其他细胞或外源性多嵌合配体反式连接))以及以顺式构型表达细胞外cd22的细胞系，使用这些细胞系和外源性多嵌合配体(如由a2
‑6‑
唾液乳糖取代的fitc
‑
或生物素轭合的聚丙烯酰胺(6’paa
‑
fitc和6’paa
‑
b)来评价针对人cd22的抗体，该抗体将破坏顺式结合并促进与外源性合成多嵌合配体的反式结合。本领域技术人员可将该方法应用于鉴定和评价能有效破坏其他siglec抗原的顺式连接的其他抗体。
13.在另一实施方式中，本发明提供了治疗其中过度活跃或不受控制的免疫(或自身免疫)活性有害的病症的方法。在另一实施方式中，本发明提供了采用siglec特异性抗体、尤其是在破坏顺式结合的表位处靶向人cd22的抗体来治疗其中过度活跃或不受控制的免疫(或自身免疫)活性有害的病症的方法。这些方法包括通过在多个周期内多次经静脉内、皮下、腹膜内或口服施用抗
‑
siglec抗体，特别是抗cd22抗体来抑制或改变b细胞活性，从而治疗病症。这些病症可以是，例如，自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎、红斑狼疮、脊椎
炎、舍格伦(sjogren’s)综合征、变态反应、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾病综合征)、恶性肿瘤、移植排斥或移植物抗宿主病和肠道病症。在一些实施方式中，病症可以是自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎(ra)、类风湿性脊椎炎、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、自身免疫性糖尿病、舍格伦(sjogren’s)综合征或舍格伦(sjogren’s)病、牛皮癣、炎性肠病、格雷夫斯(graves’)病、1型糖尿病、乳糜泻、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、寻常型天胞疮、阿尔茨海默病、白塞病(bd)和/或b细胞性恶性肿瘤。在一些实施方式中,每两周进行一次施用,每个周期跨越12周。
14.在另一实施方式中，本发明提供了治疗其中过度活跃或不受控制的免疫系统(或自身免疫)活性有害的病症的方法。这些方法包括通过经静脉内、皮下、腹膜内或口服施用对siglecs(例如人cd22抗原)的表位有特异性的抗体来抑制或改变循环cd22

细胞的活性和/或数量，这将破坏siglecs(例如人cd22)与甲氨蝶呤的顺式配体结合，从而治疗病症。一方面，所述抗体是抗cd22抗体。另一方面，甲氨蝶呤与抗siglec或抗cd22抗体共同施用。另一方面，在施用抗siglec或抗cd22抗体之前施用甲氨蝶呤。在又另一方面，在施用抗siglec或抗cd22抗体之后施用甲氨蝶呤。
15.在另一个实施方式中，用于治疗其中过度活跃或不受控制的免疫系统(或自身免疫)活性有害的病症的抗siglec或抗cd22抗体是嵌合和/或框架搭接(人源化)抗cd22抗体。优选地，通过每两周一次在多个周期中多次经静脉内施用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分进行治疗，其中每个周期跨越12周；更优选地，通过每两周一次在两个周期中两次经静脉内施用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分进行治疗，其中每个周期跨越12周；甚至更优选地，通过每两周一次在两个周期中三次经静脉内施用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分进行治疗，其中每个周期跨越12周。此后，在所有治疗方案中，通过每隔6周单次静脉内施用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体来维持治疗反应。抗体或其抗原结合部分优选地结合cd22抗原的第二n
‑
末端结构域(结构域2)，该结合将破坏顺式配体结合的同源多聚体cd22构型，并释放更多配体结合位点以便与来自其他免疫细胞或自身组织的配体反式连接，所述其他免疫细胞或自身组织表达末端序列n
‑
乙酰神经氨酸a(2
‑
6)半乳糖(neuac
‑
a(2
‑
6)gal)，使得b细胞对靶向自身组织上的自身抗原的bcr施加抑制性或调节性控制；更优选地，与结构域2序列
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相互作用，甚至更优选地，与同一结构域中的不连续构象表位相互作用，所述不连续构象表位包含以下序列：
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和
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；进一步更优选地，以1.22x10
‑8m或更低的kd和0.137s
‑1或更低的kd与人cd22解离，甚至进一步更优选地，以1.22x10
‑9m或更低的kd和0.0137ru s
‑1或更低的kd与人cd22解离，二者均通过表面等离子体共振测定。而且，抗体或其抗原结合部分特异性地结合针对抗cd22抗体的抗原结合位点(abs)的抗独特型抗体，优选针对sm03和sm06的abs(针对sm03/sm06的抗独特型抗体称为lrid)(zhao等，(2014)plos one 9(5)：e96697；leung等，(2015)mabs 7(1)：66
‑
76)，其ec
50
在0.799μg/ml或更低的范围内，在一些实施方式中，ec
50
在0.0799μg/ml或更低的范围内。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分诱导针对重组工程替代靶细胞系的补体依赖性细胞毒性(cmc)活性，该重组工程替代靶细胞系表达针对抗cd22抗体的表面结合抗独特型结合部分，ec
50
在1.658μg/ml或更低的范围内，或者
在一些实施方式中，ec
50
在0.1658μg/ml或更低的范围内。
16.在另一个实施方式中，本发明提供了通过在多个周期中多次对受试者施用嵌合或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分来治疗其中过度活跃的免疫系统(或自身免疫)活性有害的病症的方法。该抗体或其抗原结合部分包含一种或多种以下特性：
17.a)结合人cd22抗原的第二n
‑
末端结构域(结构域2)，优选与结构域2序列
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相互作用。在一些实施方式中，与同一结构域的不连续构象表位相互作用，所述不连续构象表位包含序列
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173
和
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。在一些实施方式中，该结合将破坏顺式配体结合的同源多聚体cd22构型，并释放更多配体结合位点以便与来自其他免疫细胞或自身组织的配体反式连接，所述其他免疫细胞或自身组织表达末端序列n
‑
乙酰神经氨酸a(2
‑
6)半乳糖(neuac
‑
a(2
‑
6)gal)，使得b细胞将对靶向自身组织上的自身抗原的bcr施加抑制性或调节性控制。
18.b)当经由循环通路结合时，诱导cd22抗体复合物内化，导致在胞内体/溶酶体的酸性环境下破坏顺式配体结合，包含未与抗体结合但与其他顺式结合的cd22抗体复合物一起内化的人cd22分子，并将无配体的cd22重新表面化以用于反式配体结合；
19.c)结合lrid抗体的独特型，其是对sm03和sm06d抗原结合位点(abs)有特异性的鼠源抗体，ec
50
在79.9ng/ml或更低的范围内；
20.d)诱导针对重组工程替代靶细胞系的补体介导细胞毒性(cmc)活性，该重组工程替代细胞系表达表面结合的抗独特型结合片段(fab融合体)，ec
50
在0.1509μg/ml或更低的范围内；
21.e)以0.0137ru s
‑1或更低的kd与人cd22解离，该kd通过表面等离子体共振测定；
22.f)具有轻链cdr3结构域，该轻链cdr3结构域包含seq id no:004的氨基酸序列或者从seq id no:004修饰得到的氨基酸序列，所述修饰经由在位置处的保守性氨基酸置换进行，或通过使用在中国专利zl200880024788.2中所述的cdr人源化方法用来自可用人抗体数据库(例如kabat数据库)的已知人lcvr cdr3序列替换seq id no：004进行。
23.g)具有重链cdr3结构域，该重链cdr3结构域包含seq id no:008的氨基酸序列或从seq id no:008修饰得到的氨基酸序列，所述修饰经由在相应位置处的保守性氨基酸置换进行，或通过使用在中国专利zl200880024788.2中所述的cdr人源化方法用来自可用人抗体数据库(例如kabat数据库)的已知人hcvr cdr3序列替换seq id no:008进行，该中国专利通过引用并入本文。
24.更优选地，抗体或其抗原结合部分以1.22x10
‑8m或更低的kd，甚至更优选以1.22x10
‑9m或更低的kd在结构域2不连续构象表位处结合人cd22。仍然更优选地，抗体或其抗原结合部分以0.137ru s
‑1或更低的kd在结构域2不连续构象表位处与cd22解离，甚至仍然更优选地，以0.0137ru s
‑1或更低的kd在结构域2不连续构象表位处与cd22解离。
25.在又另一实施方式中，本发明提供了治疗其中过度活跃或不受控制的免疫系统(或自身免疫)活性有害的病症的方法。这些方法包括在多个周期中多次对受试者每两周一次静脉内施用嵌合或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分，每个周期跨越12周。抗体或其抗原结合部分优选包含lcvr，该lcvr具有cdr3结构域，该cdr3结构域包含seq id no:004的氨基酸序列或从seq id no：004修饰得到的氨基酸序列，所述修饰经由在相应位置处的保守性氨基酸置换进行，或通过使用在中国专利zl200880024788.2中所述的cdr人源化
方法，用来自可用人抗体数据库(例如kabat数据库)的已知人lcvr cdr3序列替换来进行，该中国专利通过引用并入本文；并且包含hcvr，该hcvr具有cdr3结构域，该cdr3结构域包含seq id no:008的氨基酸序列或从seq id no:008修饰得到的氨基酸序列，所述修饰经由在相应位置处的保守性氨基酸置换进行，或通过使用cdr人源化方法，用来自可用人抗体数据库(例如kabat数据库)的已知人hcvr cdr3序列替换来进行。更优选地，该lcvr还具有包含seq id no：003的氨基酸序列的cdr2结构域，该hcvr还具有包含seq id no：007的氨基酸序列的cdr2结构域。仍然更优选地，该lcvr还具有包含seq id no：002的氨基酸序列的cdr1结构域，该hcvr还具有包含seq id no:006的氨基酸序列的cdr1结构域。
26.在又另一个实施方式中，本发明提供了通过在多个周期中多次对受试者每两周一次静脉内施用分离的嵌合或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分来治疗其中过度活跃的免疫系统(或自身免疫)活性有害的病症的方法，每个周期跨越12周。抗体或其抗原结合部分优选包含lcvr和hcvr，该lcvr包含seq id no：001或seq id no：009的氨基酸序列，该hcvr包含seq id no:005或seq id no：010的氨基酸序列。在某些实施方式中，抗体具有igg1重链恒定区或igg4重链恒定区。在仍然其他的实施方式中，抗体是fab片段、fab’片段、f(ab’)s片段或单链fv片段。
27.本发明的又另一方面涉及包含制剂的试剂盒，所述制剂包含药物组合物。试剂盒包含抗cd22抗体和可药用载体。试剂盒包含每两周一次静脉内给药药物组合物以治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的使用说明。另一方面，本发明涉及包含制剂的试剂盒，该制剂包含药物组合物，还包含抗cd22抗体、甲氨蝶呤和可药用载体。试剂盒包含静脉内给药药物组合物以治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的使用说明。
28.另一实施方式提供了采用完全不连续表位定位的技术提供与sm03(和sm06)结合的特异性表位的方法。又另一实施方式提供了在减轻免疫反应或抑制对自身抗原的自身免疫中恢复人cd22的免疫调节功能的方法，包括以下步骤：将sm03或sm06以破坏性方式与人cd22结合或接触，以将人cd22的唾液酸结合位点从顺式结合构型释放为反式配体形式。在一些实施方式中，sm03或sm06以高亲和力与抗原相互作用。
29.另一方面，本发明提供了用于在人类受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，包括在两个周期中对患有类风湿性关节炎的人类受试者静脉内(或皮下)施用抗cd22抗体，其中第一周期在第0周开始，第二周期在第12周开始；每个周期包括两次或三次输注施用，其中每次输注包含600mg的全身剂量，并且每次输注间隔两周，其中抗cd22抗体包含igg1重链恒定区并结合人cd22抗原的结构域2内的不连续构象表位，该不连续构象表位包含序列
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和
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。
30.另一方面，本发明提供了用于在人类受试者中治疗类风湿性关节炎的方法：包括在两个周期中对患有类风湿性关节炎的人类受试者静脉内(或皮下)施用cd22抗体,其中第一周期在第0周开始，第二周期在第12周开始；而每个周期包含两次或三次输注施用，其中每次输注包含600mg的全身剂量，并且每次输注间隔两周，其中抗cd22抗体包含igg1重链恒定区并且结合人cd22抗原的结构域2内的不连续构象表位，该不连续构象表位包含序列
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；其中抗cd22抗体结合抗独特型抗体(lrid)的独特位，该抗独特型抗体具有轻链可变(“vl”)区和重链可变(“vh”)区，该vl链区具有seq id no:012的氨基酸序列，该vh链区具有seq id no:013的氨基酸序列。
31.另一方面，本发明提供了用于在人类受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，包括在两个周期中对患有类风湿性关节炎的人类受试者静脉内(或皮下)施用抗cd22抗体，其中第一周期在第0周开始，第二周期在第12周开始；而每个周期包括两次或三次输注施用，其中每次输注包含600mg的全身剂量，并且每次输注间隔两周，其中抗cd22抗体包含igg1重链恒定区并结合人cd22抗原的结构域2内的不连续构象表位，该不连续构象表位包含序列
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；其中抗cd22抗体结合抗独特型抗体(lrid)的独特位，该抗独特型抗体具有轻链可变(“vl”)区和重链可变(“vh”)区，该vl链区具有seq id no：012的氨基酸序列，该vh链区具有seq id no：013的氨基酸序列；其中抗cd22抗体可诱导针对替代靶细胞的补体介导细胞毒性(cmc)和抗体依赖性细胞毒性(adcc)，该替代靶细胞表达表面结合抗独特型抗体fabs，该表面结合抗独特型抗体fabs具有seq id no：012的vl和seq id no:013的vh。
32.另一方面，本发明提供了用于在人类受试者中治疗类风湿性关节炎的方法：包括在两个周期中对患有类风湿性关节炎的人类受试者静脉内(或皮下)施用cd22抗体,其中第一周期在第0周开始，第二周期在第12周开始；而每个周期包含两次或三次输注施用，其中每次输注包含600mg的全身剂量，并且每次输注间隔两周，其中抗cd22抗体包含igg1重链恒定区并且结合人cd22抗原的结构域2内的不连续构象表位，该不连续构象表位包含序列
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；其中抗cd22抗体结合抗独特型抗体(lrid)的独特位，该抗独特型抗体具有轻链可变(“vl”)区和重链可变(“vh”)区，该vl链区具有seq id no:012的氨基酸序列，该vh链区具有seq id no:013的氨基酸序列；其中抗cd22抗体可诱导针对替代靶细胞的补体介导细胞毒性(cmc)和抗体依赖性细胞毒性(adcc)，该替代靶细胞表达表面结合抗独特型抗体fab，该表面结合抗独特型抗体fab具有seq id no:012的vl和seq id no:013的vh，其中抗cd22抗体包含igg1重链恒定区、轻链可变(“vl”)区和重链可变(“vh”)区，该vl链区包含具有seq id no:002的氨基酸序列的cdr1、具有seq id no:003的氨基酸序列的cdr2和具有seq id no：004的氨基酸序列的cdr3，该vh链区包含具有seq id no：006的氨基酸序列的cdr1、具有seq id no:007的氨基酸序列的cdr2和具有seq id no:008的氨基酸序列cdr3。
33.在另一实施方式中，抗cd22抗体的vl链区具有seq id no:001的氨基酸序列(sm03)，抗cd22抗体的vh链区具有seq id no:005的氨基酸序列。
34.在另一实施方式中，抗cd22抗体的vl链区具有seq id no:009的氨基酸序列(sm06)，抗cd22抗体的vh链区具有seq id no:010的氨基酸序列。
35.在另一实施方式中，抗cd22抗体施用至少24周的时间。
36.另一方面，本发明提供了用于在人类受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括由以下步骤组成：对患有类风湿性关节炎的人类受试者静脉内施用包含600mg人抗cd22抗体的组合物，每两周一次，持续足以治疗类风湿性关节炎的时间，其中抗cd22抗体包含igg1重链恒定区并结合人cd22抗原的结构域2内的不连续构象表位，该不连续构象表位包含序列
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；其中抗cd22抗体结合抗独特型抗体(lrid)的独特位，该抗独特型抗体具有轻链可变(“vl”)区和重链可变(“vh”)区，该vl链区具有seq id no:012的氨基酸序列，该vh链区具有seq id no：013的氨基酸序列；其中抗cd22抗体可诱导针对替代靶细胞的补体介导细胞毒性(cmc)和抗体依赖性细胞毒性
(adcc)，该替代靶细胞表达表面结合抗独特型抗体fab，该表面结合抗独特型抗体fab具有seq id no:012的vl和seq id no:013的vh，其中抗cd22抗体包含igg1重链恒定区、轻链可变(“vl”)区和重链可变(“vh”)区，该vl链区包含具有seq id no:002的氨基酸序列的cdr1、具有seq id no:003的氨基酸序列的cdr2和具有seq id no:004的氨基酸序列的cdr3，该vh链区包含具有seq id no:006的氨基酸序列的cdr1、具有seq id no:007的氨基酸序列的cdr2和具有seq id no：008的氨基酸序列的cdr3，其中人抗cd22抗体以可药用组合物的形式施用。
37.另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，包括对受试者施用治疗有效量的抗cd22抗体，其中
38.(a)所述抗cd22抗体在至少两个周期中施用；
39.(b)每个周期包括两个或更多个剂量；和
40.(c)每个剂量每两周施用一次。
41.在另一实施方式中，每个周期为6
‑
12周长，并且包括两个或三个剂量。
42.在另一实施方式中，每个周期为12周长。
43.在另一实施方式中，每个周期的第一个剂量在该周期的第0日施用。
44.在另一实施方式中，每个剂量为约500mg
‑
750mg。在另一实施方式中，每个剂量为600mg。
45.在另一实施方式中，每个周期包括至少两个剂量，每个剂量为600mg，总计1200mg，在4周内施用。
46.在另一实施方式中，每个周期包括至少三个剂量，每个剂量为600mg，总计1800mg，在6周内施用。
47.在另一实施方式中，抗cd22抗体经静脉内或皮下施用。
48.在另一实施方式中，每两周是每9
‑
19天，11
‑
17天，13
‑
15天，或14天。
49.在另一实施方式中，每两周是每14天。
50.在另一实施方式中，每个周期是相同长度的时间，每个周期具有相同的抗cd22抗体施用量。
51.在另一实施方式中，抗cd22抗体在两个周期中施用，其中每个周期长12周，并且每个周期施用的抗cd22抗体的量为1200mg或1800mg。
52.在另一实施方式中，每个周期施用的抗cd22抗体的量为两个或三个剂量。
53.在另一实施方式中，第一周期在第0周开始，第二周期在第12周开始。
54.在另一实施方式中，抗cd22抗体结合cd22抗原的表位的两个不连续序列，所述两个不连续序列位于所述cd22抗原的结构域2中。
55.在另一实施方式中，两个不连续序列包含cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，两个不连续序列分别与cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc至少95、96、97、98或99％同源。在另一实施方式中，两个不连续序列分别为cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。
56.在另一实施方式中，抗cd22抗体包含igg1重链的恒定区和κ轻链的恒定区。
57.在另一实施方式中，抗cd22抗体结合抗独特型抗体的独特位，该抗独特型抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:012的氨基酸序列，所述重链
可变区包含seq id no:013的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗cd22抗体结合抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:012至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，所述重链可变区包含与seq id no:013至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
58.在另一实施方式中，抗cd22抗体包含轻链可变区，其包含seq id no:002的氨基酸序列、seq id no:003的氨基酸序列和seq id no:004的氨基酸序列；其中抗cd22抗体包含重链可变区，其包含seq id no:006的氨基酸序列、seq id no:007的氨基酸序列和seq id no:008的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗cd22抗体包含轻链可变区，其包含与seq id no:002至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，与seq id no:003至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，和与seq id no：004至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列；其中抗cd22抗体包含重链可变区，其包含与seq id no:006至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，与seq id no:007至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，和与seq id no:008至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
59.在另一实施方式中，抗cd22抗体包含轻链可变区，其包含seq id no:001的氨基酸序列，并且该抗cd22抗体包含重链可变区，其包含seq id no:005的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗cd22抗体包含轻链可变区，其包含与seq id no:001至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，且抗cd22抗体包含重链可变区，其包含与seq id no:005至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
60.在另一实施方式中，抗cd22抗体包含轻链可变区，其包含seq id no:009的氨基酸序列，并且该抗cd22抗体包含重链可变区，其包含seq id no:010的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗cd22抗体包含轻链可变区，其包含与seq id no:009至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，并且该抗cd22抗体包含重链可变区，其包含与seq id no:010至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
61.在另一实施方式中，受试者是人。
62.在另一实施方式中，抗cd22抗体选自由以下组成的组：sm03、sm06及其组合。
63.在另一实施方式中，受试者患有类风湿性关节炎，但对甲氨蝶呤的应答或耐受性不足。
64.在另一实施方式中，该方法还包括施用用于治疗类风湿性关节炎的其他治疗剂。
65.另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，包括对受试者施用有效量的抗cd22抗体。在另一实施方式中，有效量为约1,200mg至1,800mg。
66.在另一实施方式中，抗cd22抗体经静脉内或皮下施用给受试者。
67.在另一实施方式中，抗cd22抗体结合cd22抗原的表位的两个不连续序列，所述两个不连续序列位于所述cd22抗原的结构域2中。
68.在另一实施方式中，两个不连续序列包含cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，两个不连续序列分别与cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc至少95、96、97、98或99％同源。在另一实施方式中，两个不连续序列分别为cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。
69.在另一实施方式中，抗cd22抗体选自由以下组成的组：sm03、sm06及其组合。
70.在一些实施方式中，所述的方法还包括施用用于治疗类风湿性关节炎的其他治疗
剂。
71.在另一实施方式中，其他治疗剂选自免疫系统抑制剂、针对免疫细胞抗原的药剂、抗炎剂、类固醇或激酶抑制剂。
72.在另一实施方式中，所述免疫系统抑制剂选自甲氨蝶呤；所述抗炎剂选自抗tnf剂、抗il17剂、抗il1、抗il12、抗il23或抗il6剂；所述激酶抑制剂选自抑制jak、btk的药剂；所述针对免疫细胞抗原的药剂是抗cd20抗体、抗blys抗体、抗april抗体、抗cd40l(cd154)、抗gmcsf或抗gmcsf受体。
73.在另一实施方式中，所述疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(ra)、类风湿性脊椎炎、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、自身免疫糖尿病、舍格伦(sjogren’s)综合征或舍格伦(sjogren’s)病、牛皮癣、炎性肠病、格雷夫斯(graves’)病、1型糖尿病、乳糜泻、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、寻常型天胞疮、阿尔茨海默病、白塞病(bd)和b细胞性恶性肿瘤。
74.另一方面，本发明提供了用于治疗自身免疫的试剂盒，其包含治疗有效量的抗cd22抗体和陈述以下内容的施用说明：
75.(a)抗cd22抗体在至少两个周期中施用；
76.(b)每个周期包括两个或更多个剂量；和
77.(c)每个剂量每两周施用一次。
78.另一方面，本发明提供了预装填注射器，其包含治疗有效量的抗cd22抗体。
79.另一方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中恢复对自身免疫的免疫控制的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的破坏顺式siglec结合的抗体。恢复对自身免疫的免疫控制包括但不限于减少自身免疫反应，治疗自身免疫疾病，治疗选自以下的疾病：类风湿性关节炎(ra)、淋巴瘤、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化(ms)、舍格伦(sjogren’s)综合征、牛皮癣、炎性肠病、格雷夫斯(graves’)病、1型糖尿病、乳糜泻、阿尔茨海默氏病等。
80.在另一实施方式中，抗体通过以破坏顺式连接并在空间上阻碍顺式再连接的方式与siglec的一个或多个表位结合来破坏顺式siglec结合。
81.在另一实施方式中，所述siglec是人cd22，所述抗体是人抗cd22抗体。
82.在另一实施方式中，抗体在可进入以得到在空间上破坏cd22顺式连接的抗体结合的表位处结合人cd22的结构域2；并且抗体对人cd22具有足够的亲和力以防止cd22与其配体顺式再连接。
83.在另一实施方式中，该方法还包括在结合人抗cd22抗体时诱导人cd22内化的步骤。
84.在另一实施方式中，抗cd22抗体选自由以下组成的组：sm03、sm06及其组合。
85.在另一实施方式中，人抗cd22抗体结合cd22抗原的表位的两个不连续序列，并且其中所述两个不连续序列分别包括cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，两个不连续序列分别与以下序列至少95、96、97、98或99％同源：cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，两个不连续序列分别是cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。
86.在另一实施方式中，抗cd22抗体结合抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:012的氨基酸序列，所述重
链可变区包含seq id no:013的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗cd22抗体结合抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:012至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，所述重链可变区包含与seq id no：013至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
87.在另一实施方式中，自身免疫选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(ra)、类风湿性脊柱炎、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、自身免疫糖尿病、舍格伦(sjogren’s)综合征或舍格伦(sjogren’s)病、牛皮癣、炎性肠病、格雷夫斯(graves’)病、1型糖尿病、乳糜泻、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、寻常型天胞疮、阿尔茨海默病、白塞病(bd)和b细胞性恶性肿瘤。
88.另一方面，本发明提供了表达融合蛋白的工程细胞系，所述融合蛋白包含非内化的人cd22结构域1
‑
7，其中所述融合蛋白具有包含与seq id no：014具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一实施方式中，融合蛋白具有与seq id no:014至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。在另一实施方式中，融合蛋白具有seq id no：014的氨基酸序列。
89.另一方面，本发明提供了筛选破坏顺式siglec结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
90.a.提供表达融合蛋白和外源性st6gal i酶的工程细胞系，所述融合蛋白包含非内化的人cd22结构域1
‑
7；
91.b.比较包含多个2,6sia配体的外源性探针在存在和不存在目标抗体的情况下与所述工程细胞系的结合；和
92.c.选择更好地恢复外源性探针与工程细胞系的结合的抗体(与不存在抗体时探针与工程细胞系的结合相比)。
93.在另一实施方式中，工程细胞系是sp2/0。
94.在另一实施方式中，外源性探针是用α2
‑6‑
唾液酸乳糖(6’paa
‑
b)取代的生物素轭合的聚丙烯酰胺。
95.在另一实施方式中，融合蛋白包含与血型糖蛋白a的跨膜和胞质部分融合的人cd22的胞外结构域。
96.在另一实施方式中，融合蛋白具有包含与seq id no：014具有95％序列同一性的氨基酸序列。在另一实施方式中，融合蛋白具有与seq id no：014至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。在另一实施方式中，融合蛋白具有seq id no:014的氨基酸序列。
97.在另一实施方式中，融合蛋白包含与从衰变加速因子(daf)蛋白分离的磷脂酰肌醇信号序列融合的人cd22的胞外结构域。
98.在另一实施方式中，融合蛋白具有包含与seq id no：015的95％序列同一性的氨基酸序列。在另一实施方式中，融合蛋白具有与seq id no：015至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。在另一实施方式中，融合蛋白具有seq id no:015的氨基酸序列。
99.另一方面，本发明提供了制备用于恢复有需要的受试者对自身免疫的免疫控制的抗体的方法，包括以下步骤：(a)在合适的宿主细胞中表达包含多核苷酸的载体；其中所述多核苷酸编码包含igg1或igg4重链的恒定区,以及对siglec中与表位的结合足以破坏顺式连接并在空间上阻碍顺式再连接的区域具有特异性的可变区；(b)回收所述抗体。
100.在另一实施方式中，所述可变区对人cd22有特异性。
101.在另一实施方式中，所述可变区结合人cd22抗原的结构域2内的不连续构象表位，该不连续构象表位包含序列cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，序列分别与以下序列至少95、96、97、98或99％同源：cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，所述序列分别是cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。
102.在另一实施方式中，可变区结合抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有包含seq id no:012的氨基酸序列的轻链可变区和包含seq id no:013的氨基酸序列的重链可变区。在另一实施方式中，可变区结合抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:012至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，所述重链可变区包含与seq id no:013至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
103.在另一实施方式中，可变区包含轻链可变区，其包含seq id no：002的氨基酸序列、seq id no:003的氨基酸序列、seq id no:004的氨基酸序列；并且其中该可变区包含重链可变区，其包含seq id no:006的氨基酸序列、seq id no:007的氨基酸序列和seq id no:008的氨基酸序列。在另一实施方式中，可变区包含轻链可变区，其包含与seq id no:002至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，与seq id no:003至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，和与seq id no:004至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，并且其中该可变区包含重链可变区，其包含与seq id no:006至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，与seq id no:007至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，和与seq id no:008至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
104.另一方面，本发明提供了在免疫细胞中调节自身免疫的方法，包括将所述免疫细胞与有效量的破坏顺式siglec结合的抗体接触的步骤。
105.在另一实施方式中，抗体是抗cd22抗体。
106.在另一实施方式中，抗体是sm03、sm06或其组合。
107.另一方面，本发明提供了在治疗有需要的受试者的自身免疫中将人cd22的至少一个唾液酸结合位点从顺式结合构型释放为反式配体形式的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的抗体的步骤，其中所述抗体在可进入以得到在空间上破坏cd22顺式连接的抗体结合的表位处结合到人cd22的结构域2；并且所述抗体对人cd22具有足够的亲和力以防止cd22与其配体顺式再连接。
108.在另一实施方式中，还包括在结合到抗体时诱导人cd22内化的步骤，其中所述抗体是人抗cd22抗体。
109.在另一实施方式中，人抗cd22抗体选自由以下组成的组：sm03、sm06及其组合。
110.在另一实施方式中，人抗cd22抗体结合到cd22抗原的表位的两个不连续序列，并且其中所述两个不连续序列分别包括cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，序列分别与以下序列至少95、96、97、98或99％同源：cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。在另一实施方式中，序列分别是cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。
111.在另一实施方式中，人抗cd22抗体结合到抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有包含seq id no:012的氨基酸序列的轻链可变区和包含seq id no:013的氨基酸
序列的重链可变区。在另一实施方式中，人抗cd22抗体结合抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:012至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列，所述重链可变区包含与seq id no:013至少95、96、97、98或99％同源的氨基酸序列。
112.在另一实施方式中，自身免疫选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(ra)、类风湿性脊柱炎、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、自身免疫糖尿病、舍格伦(sjogren’s)综合征或舍格伦(sjogren’s)病、牛皮癣、炎性肠病、格雷夫斯(graves’)病、1型糖尿病、乳糜泻、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、寻常型天胞疮、阿尔茨海默病、白塞病(bd)和b细胞性恶性肿瘤。
113.另一方面，本发明提供了用于治疗自身免疫的试剂盒，包括：包含治疗有效量的破坏顺式siglec结合的抗体的药物组合物和多个使用说明，所述使用说明陈述了：
114.(a)破坏顺式siglec结合的抗体以至少两个周期施用；
115.(b)每个周期包括两个或更多个剂量；和
116.(c)每个剂量每两周施用一次。
117.在另一实施方式中，自身免疫选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(ra)、类风湿性脊柱炎、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、自身免疫糖尿病、舍格伦(sjogren’s)综合征或舍格伦(sjogren’s)病、牛皮癣、炎性肠病、格雷夫斯(graves’)病、1型糖尿病、乳糜泻、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、寻常型天胞疮、阿尔茨海默病、白塞病(bd)和b细胞性恶性肿瘤。
118.另一方面，本发明提供了预装填注射器，其包含治疗有效量的破坏顺式siglec结合的抗体。
119.另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗自身免疫同时保持对不表达2,6唾液酸配体的细胞或病原体的免疫力的方法，包括对所述受试者施用有效量的破坏顺式siglec结合的抗体。在另一实施方式中，所述细胞不表达2,6唾液酸配体。在另一实施方式中，所述病原体不表达2,6唾液酸配体。在另一实施方式中，细胞和病原体均不表达2,6唾液酸配体。
120.在另一实施方式中，所述病原体是细菌。
121.在另一实施方式中，所述细胞是病毒感染的细胞。
122.在另一实施方式，所述抗体破坏免疫细胞中的顺式连接，并且有利于所述免疫细胞与自体细胞的反式连接。
123.另一方面，本发明提供了抗体在制备用于在有需要的受试者中治疗自身免疫的药物中的用途，其中该方法包括对受试者施用有效量的破坏顺式siglec结合的抗体。
附图说明：
124.图1显示了根据示例性实施方式所述的6种不同浓度的结合人cd22抗原的抗cd22抗体(sm03)的传感图(sensorgrams)的重叠线图。
125.图2(a)显示了根据示例性实施方式所述的结合cd22d2
‑
4的sm03和sm06的ec50的剂量反应曲线。图2(b)显示了根据一示例性实施方式所述的结合lrid的sm03和sm06的ec50的剂量反应曲线。
126.图3(a)显示了根据示例性实施方式所述的用表达载体转染的小鼠骨髓瘤sp2/0细胞的流式细胞术研究，该表达载体编码针对sm03的独特型抗体的fab片段(lrid fab),该fab片段与糖蛋白a的跨膜部分(fab
‑
glycoa)融合或与来自衰变加速因子(daf)蛋白的糖磷脂酰肌醇(gpi)信号序列融合，证实了lrid fab的高水平表面表达。图3(b)显示了根据示例性实施方式所述的针对fab
‑
glycoa和fab
‑
gpi替代靶细胞的sm03诱导的cmc杀伤作用的剂量响应曲线。
127.图4(a)是根据示例性实施方式所述的剂量响应曲线，显示经png酶处理的去糖基化sm03被证实已丧失了诱导cmc活性的生物功能。图4(b)是根据示例性实施方式所述的剂量响应曲线，显示了针对替代靶细胞fab
‑
gpi的adcc活性。
128.图5(a)是根据示例性实施方式所述的还原sds
‑
page，显示了重组蛋白cd22d2
‑
4的大小。图5(b)是根据示例性实施方式所述的剂量响应曲线，显示了cd22d2
‑
4与抗cd22抗体sm03的剂量响应结合。
129.图6(a)显示了根据示例性实施方式所述的在具有二硫键桥模拟物的严格条件下记录的抗cd22抗体sm03的强度分布图。图6(b)是人cd22结构域2
‑
4的示意图。肽链
161
cllnfscygypiq
173
以红色高亮显示，肽链
198
vftrselkfspqwshhgkivtc
219
以蓝色高亮显示。
130.图7(a)显示了根据示例性实施方式所述的cho细胞的流式细胞术研究，该cho细胞表达与糖蛋白a的跨膜部分和胞质部分融合的人cd22的胞外结构域(cho
‑
cd22)，其中与探针的结合程度在sm03的存在下不受影响。图7(b)显示了sp2/0细胞的流式细胞术研究，该sp2/0细胞表达与糖蛋白a的跨膜部分和胞质部分融合的人cd22的胞外结构域，其中，根据示例性实施方式，将sp2/0
‑
cd22与sm03一起孵育有效地破坏人cd22的顺式结合，并允许将释放的cd22配体结合位点连接以反式结合6’paa
‑
b探针(sm03 sp2/0
‑
cd22 探针)。
131.图8(a)是根据示例性实施方式所述的示意图，显示人cd22反式结合2,6sia，因bcr与自身抗原的接合所致的免疫激活将受到负性调节作用，导致对自身抗原的耐受性。图8(b)是根据示例性实施方式所述的示意图，显示了人cd22以顺式结合2,6sia，经由与自身抗原的bcr接合所致的免疫刺激将不受调节，导致针对自身抗原的自身免疫。图8(c)是根据示例性实施方式所述的示意图，显示抗cd22抗体以足够高的亲和力结合人cd22中与n
‑
末端结构域充分接近的合适结构域处的合适表位，人cd22抗原在空间上被隔开，破坏顺式结合构造；所释放的人cd22结合位点将可用于反式结合其他细胞上的2,6sia配体，减轻对bcr所识别的自身抗原的免疫反应。图8(d)是根据示例性实施方式所述的示意图，显示了抗cd22抗体在远离n
‑
末端结构域的情况下，或在无效表位处，或在亲和力不足的情况下，结合人cd22结构域，对人cd22顺式连接的破坏不足，使得特定的抗cd22抗体在调节自身免疫方面效率较差。
132.图9(a)显示了根据示例性实施方式所述的分别与daudi(左)和raji(右)淋巴瘤细胞系的表面cd22结合的sm03的共焦荧光显微镜图像。图9(b)显示了根据示例性实施方式所述的sm03结合的raji细胞的共焦荧光显微镜图像，该sm03结合的raji细胞在37℃分别孵育0(左)、10(中)和20分钟(右)。
133.图10描绘了根据示例性实施方式，患有ra的患者在于第0天和第15天以抗体sm03进行两次、每两周一次的静脉给药之后12周内的压痛关节计数(tjc)、肿胀关节计数(sjc)、关节僵硬时间(jst)和血沉(esr)的时间过程。
134.图11(a)描绘了根据示例性实施方式，在两个周期的静脉内施用抗体sm03和甲氨蝶呤(在为期12周的每个周期内两次且每两周施用一次或三次且每两周施用一次)之后，患有ra的患者的acr20、acr50和acr70反应。图11(b)描绘了根据示例性实施方式，在两个周期的静脉内给药抗体sm03和甲氨蝶呤(在为期24周的每个周期内两次且每两周给药一次或三次且每两周给药一次)之后，患有ra的患者的acr20、acr50和acr70反应。
135.图12(a)是根据示例性实施方式，在患有ra的患者中静脉内给药抗体sm03或安慰剂之后24周内acr20应答者的百分比的图示。图12(b)是根据示例性实施方式，在患有ra的患者中静脉内给药抗体sm03或安慰剂之后24周内acr50应答者的百分比的图示。图12(c)是根据示例性实施方式，在患有ra的患者中静脉内给药抗体sm03或安慰剂之后24周内acr70应答者的百分比的图示。
136.图13(a)描绘了根据示例性实施方式，在24周内、两个周期、两次或三次且每两周一次静脉内给药sm03和甲氨蝶呤之后，ra患者在24周内的压痛关节计数的时间过程。图13(b)描绘了根据示例性实施方式，在24周内、两个周期、两次或三次且每两周一次静脉内给药sm03和甲氨蝶呤之后，ra患者在24周内的关节肿胀计数的时间过程。
137.图14描绘了根据示例性实施方式，在24周内、两个周期、两次或三次且每两周一次静脉内给药sm03和甲氨蝶呤之后，ra患者的健康评估问卷失能指数(haq
‑
di)的时间进程。
具体实施方式
138.定义
139.本发明涉及鉴定抗siglecs抗体，尤其是抗cd22抗体的方法，该抗体将结合特定表位处的特定结构域，并且具有足够高的亲和力以破坏siglec分子与携带配体的相邻siglecs或相邻糖蛋白的顺式结合。破坏结合的目的是释放siglec
‑
配体结合位点(例如结合n
‑
乙酰神经氨酸a(2
‑
6)半乳糖(neuac
‑
a(2
‑
6)gal)的cd22)，以使得siglec配体结合位点(例如cd22)可用于反式结合其他免疫细胞上的其特异性配体。这些调节性siglecs(例如cd22)的反式结合导致与bcr的缔合增加以及对免疫系统的抑制功能的发挥。
140.本发明还涉及对这些破坏顺式结合的抗siglecs抗体的使用，通过释放siglec结合位点以反式结合其他细胞上的聚糖，来恢复b细胞的免疫调节功能，包括治疗其中抗siglec(例如cd22)抗体的施用有益的病症的方法，其包括施用分离的嵌合或框架搭接(人源化)抗体或cdr接枝抗体或人抗体或其抗原结合部分，这些抗体或其抗原结合部分以破坏通过顺式结合形成的同源多聚体的方式结合人siglecs，特别是具有高亲和力的人cd22，并且针对特定的结构域和表位，使分离的配体结合位点以反式与其他造血细胞或自身组织上存在的末端序列n
‑
乙酰神经氨酸a(2
‑
6)半乳糖(neuac
‑
a(2
‑
6)gal)相互作用，从而治疗病症。具体地，抗体在结构域2中存在的特异性不连续构象表位处结合人cd22，该不连续构象表位包含如下序列：
161
cllnfscygypiq
173
(seq id no：016)和
198
vftrselkfspqwshhgkivtc
219
(seq id no:017)，该抗体具有0.137ru s
‑1或更低的kd，诱导人cd22内化，并且对针对抗cd22抗体的抗独特型抗体lrid具有特异性(ec
50
在79.9
±
27.6ng/ml或更低的范围内)，并且诱导针对替代靶细胞系的补体介导的细胞毒性(cmc)，该替代靶细胞系表达表面lrid结合部分(ec
50
在0.1509
±
0.0207mg/ml或更低的范围内)，其足以发挥以上作用以恢复siglecs的免疫调节和/或抑制功能，从而治疗病症。本发明的各个方面涉及合适抗体的鉴定、评价
和检测以及此类抗体和抗体片段用于治疗病症的用途，及其药物组合物。
141.本发明还涉及治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方法，包括施用分离的嵌合或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分以高亲和力结合人cd22，针对结构域2中存在的特异性不连续构象表位，并且对针对抗cd22抗体的抗独特型抗体lrid具有特异性(ec
50
在79.9
±
27.6ng/ml或更低的范围内),其诱导针对替代靶细胞系的补体介导的细胞毒性(cmc)，该替代靶细胞系表达表面lrid结合部分(ec
50
在0.1509
±
0.0207μg/ml或更低的范围内)，从而治疗病症。本发明的各个方面涉及用抗体和抗体片段及其药物组合物治疗。为更容易理解本发明，首先定义一些术语。
142.如本文中和权利要求中所用的，“包括/包含”表示包含以下要素但不排除其他要素。
143.术语“自身免疫疾病或病症”是指特征在于对正常身体细胞、组织、器官或整个身体部分的异常免疫应答。例如，免疫系统可产生攻击正常身体组织的抗体。在一些实施方式中，自身免疫疾病或病症由免疫控制功能失调引起。自身免疫疾病或病症包括但不限于，类风湿性关节炎(ra)、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、舍格伦(sjogren’s)综合征、牛皮癣、炎症肠病、格雷夫斯(graves’)病、1型糖尿病、乳糜泻、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、寻常型天胞疮、阿尔茨海默病、白塞病(bd)和b细胞性恶性肿瘤等。
144.术语“类风湿性关节炎”或“ra”是指因自身免疫反应不受控制而导致长时间炎症反应所致的系统性炎症疾病。此类炎症反应主要靶向关节，导致滑膜组织肥大和增生，破坏关节结构和软骨下骨，错位，强直，并最终限制关节功能。各种组织如皮肤、血管、心、肺、肌肉和一些内脏的其他病理变化也可能发生。类风湿性关节炎患者遭受疼痛和生活质量下降，并与发病率增加、相当多的共同发病率和残疾相关。尽管引入了抗tnfα抗体和抗il1抗体与传统的改善疾病的抗风湿药(dmard)的组合疗法已显著改进了ra治疗，仍有大量患者要么对治疗方案无应答，要么最终对治疗方案产生耐药性。
145.术语“cd22”是指b细胞限制型抗原，其属于免疫球蛋白(ig)超家族，并且是i型跨膜唾液酸糖蛋白，也称为唾液酸结合免疫球蛋白
‑
型凝集素(siglecs)，分子大小为135
‑
kd。在静息b细胞中，cd22是自身的显著顺式配体，形成cd22同源寡聚物。
146.本文所用的术语“siglecs”是指唾液酸结合免疫球蛋白
‑
型凝集素，如人cd22和siglec
‑
10。siglec
‑
10和cd22是仅有的在b细胞表面上表达的siglecs。这些分子组成性地表达在b细胞上，并且在b细胞耐受性的保持和自身免疫疾病的预防中用作b细胞抗原受体(bcr)的抑制性共同受体。
147.本文所用的术语“内化”是指组成型网格蛋白介导的siglecs(例如cd22)的内吞作用或通过结合抗siglec抗体(例如sm03和/或sm06)而增加的siglecs(例如cd22)的内吞率；这种类型的内化是一个再循环过程，其中siglec(与抗siglec抗体结合或不结合)被内吞到核内体隔室中，并且低ph环境释放siglec与其特定配体的结合(例如顺式cd22结合)，游离的siglec回到细胞表面进行可能的顺式或反式配体结合。当siglec在与破坏性抗siglec抗体(例如针对cd22的sm03和/或sm06)结合时被诱导内化时，抗体与siglec(例如cd22)一起被再循环到细胞表面，在空间上阻止顺式配体进一步结合到其他表面cd22。
148.本文所用的术语“配体结合”是指siglecs(例如cd22)与其在分布于相同细胞(顺
式)或不同细胞(反式)上的内源性糖蛋白的聚糖上的特定配体的结合；不同的siglecs将结合到不同的配体结构。例如，人cd22对以下结构具有特异性：在造血细胞和肝细胞上表达的n
‑
乙酰神经氨酸(2
‑
6)半乳糖(neuac
‑
(2
‑
6)gal)。
149.本文所用的术语“顺式结合”是指siglecs(例如cd22)与其分布在相同细胞(例如b细胞)上的内源性糖蛋白的聚糖上的特定配体的结合，通常形成同源寡聚体或同源多聚体。siglecs的顺式结合在相邻分子之间进行，其中siglec分子的聚糖结合位点被连接到相同细胞上的另一siglec或糖蛋白的聚糖分子。siglecs(如cd22)的顺式结合被证明对分子产生掩蔽作用，阻止siglec形成细胞间连接(反式结合)，而细胞间连接是诱导耐受性的抑制性免疫信号所必需的。
150.本文所用的术语“反式结合”是指位于一个细胞中的siglecs(例如cd22)与其在另一个细胞的内源性糖蛋白的聚糖上的特定配体的结合，导致siglec(例如cd22)与bcr的物理结合，从而产生最大的抑制反应。
151.本文所用的术语“破坏性结合”是指抗siglec抗体与siglec(例如cd22)分子的结合，该结合位于靠近siglec的配体结合位点的结构域，且位于将会因空间位阻而有效地撕裂与相邻分子的顺式结合的表位；抗siglec抗体的高亲和力(例如亲和力为1.22nm的sm03和/或sm06)将有利于与顺式配体结合(亲和力～30mm)竞争，并有助于在整个内化过程中保持结合，维持空间位阻以阻止siglec的顺式重新连接。
152.本文所用的术语“给药”是指施用物质(例如，抗cd22抗体或抗体片段)以实现治疗目的(例如，治疗与异常b细胞活性相关的免疫病症或疾病)。
153.本文使用的术语“每两周一次给药方案”、“每两周一次给药”和“每两周一次施用”是指向受试者施用物质(例如抗cd22抗体或抗体片段)以达到治疗目的(例如，治疗与异常b细胞活性有关的免疫病症或疾病)的时间进程。每两周一次给药方案不包括每周一次给药方案。优选地，所述物质每9
‑
19天施用一次，更优选地，每11
‑
17天施用一次，甚至更优选地，每13
‑
15天施用一次，并且最优选地，每14天施用一次。
154.本文所用的术语“给药周期”是指如下的时间段：其中包含多个每两周一次给药方案、每两周一次给药或每两周一次向受试者施用物质(例如抗cd22抗体或抗体片段)以实现治疗目的(例如，治疗与异常b细胞活性相关的免疫病症或疾病)。优选地，在一个治疗周期内以每两周一次给药方案、每两周一次给药或每两周一次施用该物质两次或三次；更优选地，在9
‑
15周的时间内，甚至更优选地，在10
‑
14周的时间段内，甚至更优选地，在11
‑
13周的时间段内，并且最优选地，在12周的时间段内以每两周一次给药方案、每两周一次给药或每两周一次施用该物质；
155.本文所用的术语“治疗周期”是指用于将物质(例如抗cd22抗体或抗体片段)施用给受试者以实现治疗目的(例如，治疗与异常b细胞活性相关的免疫病症或疾病)所采用的给药周期数。优选地，在一个治疗周期中施用1
‑
5个给药周期的物质，更优选地，1
‑
4个给药周期，甚至更优选地，1
‑
3个给药周期，并且最优选地，2个给药周期。
156.本文所用的术语“维持给药”是指在治疗周期之后维持治疗反应的给药方案，其中在所述治疗周期中，向受试者施用物质(例如，抗cd22抗体或抗体片段)以实现治疗目标(例如，对与异常b细胞活性有关的免疫病症或疾病的治疗)。优选地，在受试者完成治疗周期后每2
‑
10周、更优选地每3
‑
8周、甚至更优选地每4
‑
7周和最优选地每6周施用物质。
157.本文所用的术语“联合治疗”是指施用两种或两种以上的治疗物质，例如抗cd22抗体和药物甲氨蝶呤。甲氨蝶呤可在施用抗cd22抗体的同时、之前或之后施用。
158.本文所用的术语“人cd22”或“hcd22”意指作为分子大小为135
‑
kd的i型跨膜唾液酸糖蛋白存在的人b细胞限制性表面抗原cd22。cd22是另一种b细胞限制性抗原，属于免疫球蛋白(ig)超家族，是一种分子量为135
‑
kd的i型跨膜唾液糖蛋白。术语人cd22包括重组人cd22(rhcd22)，其可为包含细胞外区域、细胞内区域和跨膜区域的全分子形式，或表达为仅包含细胞外区域的可溶形式，或含有抗cd22抗体结合表位的细胞外部分，其可通过标准重组表达方法制备或商业购买(例如，abcam，catalog no.ab50033,cambridge，ma；creative biomart，catalog no.cd22
‑
3946h，shirely，ny；thermo fisher scientific，catalog no.11958h08h5，waltham，ma)
159.本文所用的术语“cd22的结合表位”是指抗cd22抗体所结合或与之相互作用的人cd22的特定区域、序列或多个序列。cd22的结合表位可以是单个结构域内的线性序列，优选地，其跨越多个结构域；更优选地，结合表位由多个不连续序列组成，甚至更优选地，结合表位由特定构象结构中的多个不连续序列构成。
160.本文所用的术语“不连续构象表位”是指抗原的自然折叠结构中与靶向抗体的抗原结合位点(abs)特异性相互作用的部分，并且该自然折叠结构的部分由形成特定构象的至少两个独立的、不连续的序列组成。
161.本文所用的术语“抗独特型抗体”是指对抗cd22抗体具有特异性的抗体或其抗体片段，优选地，抗独特型抗体对ab2γ型的抗cd22抗体的abs具有特异性(在不模仿cd22结合表位的内部图像的情况下识别接近抗cd22抗体副表位的独特位)，更优选地，抗独特型抗体对ab2β型的抗cd22抗体的abs具有特异性(模仿cd22结合表位的内部图像)。
162.本文所用的术语“替代靶细胞”是指经工程设计以在其表面上重组表达具有可与抗cd22抗体相互作用以诱导补体依赖性细胞毒性(cmc)和/或抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性的结合部分的细胞系。结合部分可以是人cd22的部分，优选地，结合部分是包含cd22的结合表位的序列，更优选地，结合部分是针对抗cd22抗体的抗独特型抗体，甚至更优选地，结合部分是针对抗cd22抗体的抗独特型抗体的fab片段(参见例如中国专利第zl201210286457.4号；美国专利第9,371,396b2号，以上专利通过引用并入本文)。
163.本文所用的术语“抗体”意指由四个多肽链组成的免疫球蛋白分子，所述四个多肽链为通过二硫键互相连接的两个重(h)链和两个轻(l)链。每个重链均由重链可变区(这里缩写为hcvr或vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由ch1、ch2和ch3三个结构域组成，在ch1和ch2结构域之间由一个短的柔性铰链区连接。每个轻链均由轻链可变区(这里缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间穿插有名为框架区(fr)的更为保守的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
164.本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保留特异性结合到抗原(例如，人cd22)的能力的一个或多个抗体片段。已经证明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的示例包括：(i)fab片段，由不含铰链区的vl、vh、cl和sh1结构域组成的单价片段；(ii)fab’片段，由
附接有铰链区的vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(iii)f(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iv)fd片段，其由vh和ch1结构域组成；(v)fv片段，其由抗体单臂的vl和vh结构域组成；(vi)dab片段(ward等人，(1989)nature 341:544
‑
546)，其由vh结构域组成；和(vii)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由独立的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成连接子连接，使它们成为其中vl和vh区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链fv(scfv)；参见，例如，bird等人(1988)science 242:423
‑
426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879
‑
5883)。此类单链抗体也包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。其他形式的单链抗体，如双抗体也包括在内。双抗体是二价的双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短，无法再同一个链上的两个结构域之间配对，从而迫使这些结构域与另一个链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点(参见，例如，holliger，p.等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：6444
‑
6448；poljak，r.j.等人(1994)structure 2：1121
‑
1123)。
165.更进一步地，抗体或其抗原结合部分可为较大的免疫粘附分子的一部分，其由抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价缔合形成。此类免疫粘附分子的示例包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scfv分子(kipriyanov，s.m.等人(1995)human antibodies and hybridomas 6：93
‑
101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和c末端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scfv分子(kipriyanov，s.m.等(1994)mol.immunol.31：1047
‑
1058)。抗体部分(例如fab、fab’和f(ab’)2片段)可分别使用常规技术(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)由完整抗体制备。此外，如本文所述，可以使用标准重组dna技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。
166.本文所用的术语“嵌合抗体”意图包括具有来自小鼠或其它非人来源免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体，而轻链和重链的恒定cl和ch1
‑
铰链
‑
ch2
‑
ch3区衍生自人免疫球蛋白。本文所用的术语“框架搭接(人源化)抗体”意图包括具有接枝到人框架的链段上的cdr的抗体，而这些框架的链段(例如hcvh和lcvl的fr1、fr2、fr3和fr4)可衍生自相同的人免疫球蛋白序列，或者从不同的人免疫球蛋白序列中自由选取(框架搭接)。嵌入这些人框架的cdr与人免疫球蛋白的恒定cl和ch1
‑
铰链
‑
ch2
‑
ch3区基因融合。
167.本文所用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达或者产生或分离的所有嵌合和框架搭接(人源化)抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下面的第二节中进一步描述)，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(在下面的第三节中进一步描述)，从转基因为人免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见taylor，l.d.等人(1992)nucl.acis res.20：6287
‑
6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因剪接到其他dna序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。
168.本文所用的“分离的抗体”意指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合人cd22的分离的抗体基本上不含特异性结合非人cd22的抗原的抗体)。然而，特异性结合人cd22的分离的抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的cd22)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学品。
[0169]“生物活性抗体”是如下的抗体：其在体内发挥生物反应，表现为外周血b细胞群抑制或减少，或破坏靶分子的顺式配体结合，或引起人肿瘤消退，或在疾病条件(如免疫病症)
下调节免疫反应，或在人淋巴瘤细胞系中诱导凋亡，或在人淋巴瘤细胞系中诱导内化，或引起针对人淋巴瘤细胞系的抗体依赖性细胞毒性(adcc)，或引起针对替代靶细胞的补体介导的细胞毒性(cmc)或抗体依赖性细胞毒性(adcc)，该替代靶细胞表达针对生物活性抗体的表面结合部分。这些生物活性的指示剂可以通过本领域已知的若干体外或体内标准中的一种或多种来评估。优选地，通过在体外引起针对替代靶细胞的cmc或adcc来评估针对人cd22有特异性的生物活性抗体。
[0170]
术语“sm03”是指针对人cd22(hcd22)的嵌合抗体(例如，如在以下中描述的抗体：leung等人，中国专利第zl03123054.7号，以上文献通过全文引用的方式并入本文)。
[0171]
术语“sm06”是指嵌合抗体sm03的框架搭接或人源化形式，其经过工程设计以减少其潜在的免疫原性，并显示出与sm03相当的针对人cd22的亲和力和特异性(liang等人，(2006)chinese j new drug 15(21)：1832
‑
1836)。框架搭接的sm06的构建及其用途在以下中描述：中国专利第l 011 44894.6号，美国专利7,321,026b2和7,338,659b2，以上文献通过全文引用的方式并入本文。
[0172]
本文所用的术语“表面等离子体共振”是指允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度变化来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用biacore系统(pharmacia biosensor ab，uppsala，sweden and piscataway，nj)。更多描述请参见johnsson，u.等人(1993)ann.biol.clin.51:19
‑
26；johnsson，b.等人(1995)j.mol.recognit.8：125
‑
131；and johnnson，b.，等人(1991)anal.biochem.198:268
‑
277。
[0173]
本文所用的术语“kd”意指特定抗体
‑
抗原相互作用的平衡离解常数。它可以定义为游离抗体浓度和游离抗原浓度的乘积与抗体
‑
抗原复合物浓度的比值，即[抗原]x[抗体]/[抗原
‑
抗体]。
[0174]
本文中使用的术语“kd”意指特定抗体
‑
抗原相互作用的解离速率常数，用于描述抗体
‑
抗原复合物的稳定性，即每秒解离的复合物的分数。
[0175]
本文所用的术语“ka”意指特定抗体
‑
抗原相互作用的平衡缔合常数。它是平衡解离常数的倒数，即＝1/kd。
[0176]
本文使用的术语“ka”意指缔合速率常数，其描述抗体
‑
抗原复合物形成的速率，即在抗体和抗原的一摩尔溶液中每秒形成的复合物的数目。
[0177]
本文所用的术语“ec
50”意指产生半数最大响应的抗体浓度。
[0178]
本文所用的术语“ic
50”意图指应答或结合减少一半的抗体浓度。
[0179]
本文所用的术语“核酸分子”意图包括dna分子和rna分子。核酸分子可为单链或双链的，但优选为双链dna。
[0180]
本文所用的术语“分离的核酸分子”在涉及编码结合人cd22的抗体或抗体部分(例如，vh、vl、cdr3)时意指如下的核酸分子：其中编码该抗体或抗体部分的核苷酸序列不含其他核苷酸序列，所述其他核苷酸序列编码非人cd22的抗原的抗体或抗体部分，并且可天然地位于人基因组dna的核酸侧翼。因此，例如，编码抗cd22抗体的vh区的本发明的分离的核酸不包含编码结合非人cd22的抗原的其他vh区的其他序列。
[0181]
本文所用的术语“载体”意指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指可将额外的dna链段连接到其中的圆形的双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna链段可被连接到病毒基因组。某些载体能够在它们所被
引入其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有复制的细菌起源的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般来说，在重组dna技术中实用的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括具有等效功能的此类其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0182]
本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意图指已向其中引入重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅是指特定的受试细胞，而且还指这种细胞的后代。由于突变或环境影响，可在随后的世代中发生某些修饰，因此此类子代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
[0183]
本发明的各个方面在以下小节中进一步详细描述。
[0184]
i.破坏顺式siglecs结合的抗体
[0185]
本发明提供了一种利用对siglecs有特异性的抗体来破坏siglecs与其配体的顺式结合的方法，释放siglecs的配体结合位点以便与其他免疫细胞上的配体反式连接，从而使siglecs在与b细胞受体(bcr)物理结合时发挥其抑制功能，并恢复对bcr抗原的免疫耐受。具体地，本发明中用作示例的siglecs之一是人cd22。本发明还提供了使用表达非内化cd22胞外结构域的细胞系来评估抗cd22抗体的方法，所述抗cd22抗体破坏顺式cd22结合而不影响其反式结合。该方法包括在不存在和存在抗cd22抗体的情况下使用这些细胞系与经a2
‑6‑
唾液酸乳糖取代的合成配体fitc或生物素共轭聚丙烯酰胺(6'paa
‑
fitc和6'paa
‑
b)(glycotech，rockville，md)反式结合。抗cd22抗体的反式结合增强程度可通过比较流式细胞术分析中在抗cd22抗体结合之前和之后探针的荧光强度来评价。类似方法可用于评价其他siglecs的其他抗体。
[0186]
ii.结合人cd22的嵌合和框架搭接(人源化)抗体
[0187]
本发明提供了治疗其中抗siglec抗体的施用有益的病症的方法。在一些实施方式中，该抗siglec抗体是抗cd22抗体。这些方法包括施用分离的人抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分与特异性构象表位结合，所述特异性构象表位有效地破坏与cd22或与表达cd22配体的相邻分子的顺式cd22结合。在一些实施方式中，这些方法包括每两周一次静脉内施用分离的人抗体或其抗原结合部分。具体地，抗cd22抗体以高亲和力结合人cd22的结构域2，并且该抗cd22抗体可以是嵌合的、框架搭接的、cdr接枝的和/或全人源抗体。在一些实施方式中，除了结合cd22之外，该嵌合的、框架搭接的、cdr接枝的和/或全人源抗体还结合针对sm03和sm06的抗原结合位点(abs)的抗独特型抗体，其ec
50
在79.9
±
27.6ng/ml或更低的范围内(参见leung，s.o.等人(2015)mabs7(1):66
‑
76；zhao，q.等人(2014)plos one 9(5):e96697，并且如以下中所述：美国专利第us 9371396b2号，中国专利第zl201210286457.4号，上述专利通过引用并入本文)，并且能够诱导针对重组工程设计替代靶细胞系表达表面结合抗独特型结合片段(fab融合体)的cmc活性(参见，例如leung，s.o.等人(2015)mabs7(1)：66
‑
76，并且如以下中所述：美国专利第us 9371396b2号，中国专利第zl201210286457.4号，以上专利通过引用并入本文)。最优选的重组抗cd22抗体在本文
中被称为sm03(sm03 vl区的氨基酸序列如seq id no:001所示；sm03 vh的氨基酸序列如seq id no：005所示)和sm06(sm06 vl区的氨基酸序列如seq id no:009所示；sm06 vh的氨基酸序列如seq id no：010所示)。sm03的性质在以下中描述：yang等人(2006)(chinese j new drug 15(3)：186
‑
192)和中国专利第zl 031 23054.7号，以上通过引用并入本文；sm06的性质在以下中描述：leung等人(2006)(chinese j new drug 15(21):1832
‑
1836，和美国专利第7,321,026b2号和第7,338,659b2号，以上通过引用并入本文)。
[0188]
一方面，本发明提供了治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方法。这些治疗包括每两周一次静脉内注射sm03或sm06抗体和抗体部分，sm03或sm06相关的抗体和抗体部分，以及具有与sm03同等性质的其他嵌合的、人源化的和人抗体和抗体部分，所述同等性质例如与外源性cd22的高亲和力结合，所述外源性cd22针对具有高效应fc功能的抗原的结构域2内的特异性表位具有相对低的解离动力学，如同抗cd22抗体对sm03诱导针对具有抗独特型抗体表面表达的替代靶细胞的cmc和/或adcc的能力所揭示的。
[0189]
在一些实施方式中，sm03的等效性质还包括有效地破坏cd22同源多聚体结合或cd22与相邻糖蛋白顺式结合的能力，以及诱导抗体
‑
cd22复合物内化的能力。
[0190]
在一个实施方式中，本发明提供了用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分进行治疗，该抗体或其抗原结合部分以1.22x10
‑9m或更低的kd、0.0137ru s
‑1或更低的kd、0.82x109m
‑1或更高范围内的ka和1.13x107ru s
‑1或更高范围内的ka与外源性人cd22解离，以上均由表面等离子体共振测定，或与放射性标记的i
125
‑
sm03竞争结合ramos细胞(人burkitt淋巴瘤细胞系)上的天然cd22，其ic
50
在1.02
±
0.007μg/ml或更低的范围内，和/或结合抗原结合位点特异性抗独特型抗体(参见美国专利第9371396b2号，中国专利第zl201210286457.4号，以上通过引用并入本文中)，其ec
50
在79.9
±
27.6ng/ml或更低的范围内，并且诱导针对表达表面lrid结合部分的替代细胞系的cmc活性，其ec
50
在150.9
±
20.7ng/ml或更低的范围内(参见美国专利第9371396b2号，中国专利第zl201210286457.4号，其通过引用并入本文)。更优选地，分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分以0.0685ru s
‑1或更低的kd，或甚至更优选地以0.0137ru s
‑1或更低的kd与外源性人cd22解离。更优选地，分离的嵌合和/或框架搭接的(人源化的)抗体或其抗原结合部分在竞争结合试验中与同位素标记的i
125
‑
标记的sm03竞争结合ramos细胞(人burkitt淋巴瘤细胞系)上的人cd22，其ec
50
为5.01μg/ml或更低，甚至更优选ec
50
为1.02μg/ml或更低。更优选地，分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分特异性地结合针对sm03和sm06的抗原结合位点(abs)的抗独特型抗体，其ec
50
为0.3995μg/ml或更低，或者甚至更优选ec
50
为0.0799μg/ml。更优选地，分离的嵌合和/或框架搭接的(人源化的)抗体或其抗原结合部分诱导针对替代靶细胞的cmc杀伤，该替代靶细胞经工程设计在其表面结合部分上表达抗独特型抗体，其ec
50
为0.7545μg/ml或更低，甚至更优选ec
50
为0.1509μg/ml或更低。在优选实施方式中，抗体是分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)重组抗体或其抗原结合部分。
[0191]
靶向相同抗原但在不同表位处和具有不同亲和力的抗体将具有不同的生物反应[例如，i型抗cd20抗体如利妥昔单抗和奥法木单抗可诱导adcc、强cmc和弱非凋亡程序性细胞死亡，而ii型抗cd20抗体如奥滨尤妥珠单抗和托西莫单抗可诱导adcc、弱cmc和强非凋亡程序性细胞死亡](bears等人(2010)semin hematol47:107
‑
114)。
[0192]
因此，另一方面，本发明提供了通过静脉内施用抗cd22抗体来治疗其中抗cd22抗
体的施用有益的病症的方法。一些实施方式提供了通过静脉内施用抗cd22抗体来治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方法，所述抗cd22抗体破坏b细胞上的这些cd22的顺式配体结合，例如，靶向人cd22抗原的结构域2的抗体，特别是在包含序列
161
cllnfscygypiq
173
(seq id no：016)和
198
vftrselkfsqwshhgkivtc
219
(seq id no：017)的不连续构象表位处，亲和力(ka)在0.82x109m
‑1的范围内，同时结合针对抗cd22抗体的抗独特型抗体，ec
50
在79.9
±
27.6ng/ml的范围内。
[0193]
siglecs如人cd22是一种负性调节因子，其介导b细胞抗原受体诱导信号的抑制。这些siglecs，特别是cd22，识别各种细胞表面糖蛋白表达的内源性唾液酸。它们以其n
‑
末端免疫球蛋白样结构域与a2,6
‑
连接的唾液酸(2,6sia)结合(在同一细胞上顺式结合或在其他细胞上反式结合)。只有组成性地表达st6galⅰ(gal1b1
‑
4glcnac
‑
特异性a2
‑6‑
唾液酸转移酶)酶的细胞，主要是造血细胞，如t细胞、b细胞、抗原呈递细胞(apc)和肝细胞，才能在细胞表面产生2,6sia配体。在静息b细胞中，cd22是自身的显著顺式配体，形成cd22同源寡聚物。cd22对其2,6sia配体的亲和力中等偏低，但对细胞表面蛋白质的唾液酸化程度较高，导致自身配体的掩蔽效应，并使反式配体的可用性受到限制。
[0194]
反式配体结合是对靶细胞上唾液酸化结构的机械识别，导致cd22和siglec
‑
10连接到bcr，并最终抑制对该抗原的免疫应答(例如，b细胞抑制)。
[0195]
在小鼠中，通过缺失st6gal i基因或突变的cd22配体结合域(cd22 arg130glu)破坏cd22同源寡聚体，会导致cd22
‑
bcr缔合增加，并在抗igm刺激时增强ca
2
抑制。这种效应表明cd22在调节b细胞活化状态中具有重要的顺式配体结合功能。本发明中所述的抗体可破坏cd22同源寡聚体的顺式配体结合，从而释放未被占据的cd22配体结合位点用于反式配体结合，当靶细胞共同表达抗原和唾液酸时，诱导b细胞信号抑制。
[0196]
另一实施方式提供了具有以下一种或多种特性的siglecs的破坏性抗体：
[0197]
1.当顺式结合被破坏时，与靠近配体结合位点的结构域结合而不干扰其配体结合特性；
[0198]
2.当被破坏时，与将会在空间上阻碍顺式配体结合的重新接合的表位结合；
[0199]
3.以高亲和力结合特定表位，首先与顺式配体结合竞争(估计kd为～0.1
‑
0.3mm)，然后保持与表位的结合，并在空间上阻碍cd22同源寡聚体经由顺式结合再缔合。
[0200]
在示例性实施方式中，siglec是cd22。
[0201]
另一实施方式提供了针对能诱导内化的siglecs的抗体。在一些实施方式中，siglec特异性抗体通过网格蛋白包被的小窝以再循环的方式内化；即，与cd22结合的抗体在该过程中保持结合，同时在核内体的低ph下释放聚糖配体。
[0202]
cd22是能在b细胞的细胞表面和核内体隔室之间穿梭运货的再循环受体。从顺式连接释放出来的重新表面化的cd22可反式结合其他细胞上的聚糖配体，使b细胞通过bcr与自身抗原的接合而活化，这种接合更可能被反式连接的cd22减弱或调节。抗体以一定的亲和力与不同表位的不同结构域结合，但不能有效地破坏顺式配体结合，可能有一些但不充分的临床效果，因此较不理想，因为反式结合的程度可能不足以引起预期的免疫调节活性，从而产生令人满意的临床结果。
[0203]
抗体重链和轻链cdr3结构域在抗体与抗原的结合特异性/亲和力中起重要作用，特别是当抗体必须与siglec(例如cd22)同源寡聚物顺式结合竞争并且持续施加空间位阻
以阻止游离siglec(例如cd22)顺式重新接合时。因此，另一方面，本发明涉及通过静脉内施用抗cd22抗体来治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方法，其中所述抗cd22抗体具有适当的与人cd22的缔合/解离动力学并且具有结构上与sm03相同或相关的轻链和重链cdr3结构域。因此，包括以下氨基酸序列的sm03 vl cdr3的共有基序：q
‑
q
‑
g
‑
n
‑
t
‑
l
‑
p
‑
w
‑
t(seq id no:004)可通过以下方式进行修饰：取代一个或多个氨基酸以调节抗体亲和力而不改变其结合特异性，或者可替代地，用与sm03 vl cdr3具有充分相似性的不相关的人抗体的vl cdr3来置换，这使用如中国专利zl200880024788.2中所述的规则进行，该专利通过引用并入本文。类似地，包括以下氨基酸序列的sm03 vh cdr3的共有基序：h
‑
s
‑
g
‑
y
‑
g
‑
s
‑
s
‑
y
‑
g
‑
v
‑
l
‑
f
‑
a
‑
y(seq id no:004)可通过以下方式进行修饰：取代一个或多个氨基酸以调节抗体亲和力而不改变其结合特异性，或者可替代地，用与sm03 vh cdr3具有充分相似性的不相关的人抗体的vh cdr3来置换，这使用如中国专利zl200880024788.2中所述的规则进行，该专利通过引用并入本文。本领域技术人员将会意识到，在保持抗体的表位特异性的同时，可以置换cdr3结构域内的其他氨基酸，特别是用保守氨基酸置换。类似地，可以用来自人或灵长类动物抗体的cdr3置换cdr3，该抗体(1)在残基数量上与sm03 cdr3相同并且显示50％或更高的序列同源性，(2)包含至少一个，优选多个与sm03 cdr3中相应位置处的残基相同或保守相似的芳香性残基，(3)包含至少一个、优选多个与sm03 cdr3中相应位置处的残基相同或保守相似的带电残基，(4)包含至少一个，优选多个与sm03 cdr3中相应位置的残基相同或保守相似的氨基酸残基，这些位置被认为对维持抗cd22抗体的结合位点结构/接触具有重要性，如通过晶体结构和/或计算机数据文库分析确定的(参见中国专利zl200880024788.2，该专利通过引用并入本文。本文所用的“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被具有类似侧链的另一个氨基酸残基置换。本文所用的“保守相似”的氨基酸或残基是指具有相似侧链的不相同的氨基酸残基。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。优选地，对sm03 vl和/或vh cdr3结构域进行不超过1到5个保守氨基酸置换，或者使用来自不相关的灵长类或人抗体的包含不超过1到5个保守相似残基的vl和/或vh cdr3置换sm03或sm06的vl和/或vh cdr3。更优选地，在sm03 vl和/或vh cdr3结构域内进行不超过1到3个保守氨基酸置换，或者使用来自不相关的灵长类或人抗体的包含不超过1到3个保守相似残基的vl和/或vh cdr3置换sm03或sm06的vl和/或vh cdr3。
[0204]
因此，在另一实施方式中，本发明提供了通过每两周一次静脉内施用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方法。抗体或其抗原结合部分优选包含以下一个或多个特征：
[0205]
a)以构象方式结合人cd22的结构域2，具体地，与结构域2的以下两个序列中的至少一个相互作用：
161
cllnfscygypiq
173
(seq id no:016)或
198
vftrselkfspqwshhgkivtc
219
(seq id no:017)，或优选与以下两个不连续序列均相互作用：
161
cllnfscygypiq
173
(seq id no:016)和
198
vftrselkfspqwshhgkivtc
219
(seq id no:017)；
[0206]
b)以0.0137ru s
‑1或更低的kd与人cd22解离，该kd通过表面等离子体共振测定；
[0207]
c)当结合表面人cd22时诱导内化；
[0208]
d)与放射性同位素标记的i
125
‑
sm03竞争结合ramos细胞(人burkitt淋巴瘤细胞系)上的天然cd22，ic
50
在1.02
±
0.007μg/ml的范围内；
[0209]
e)结合对抗cd22抗体具有特异性的抗独特型抗体(参见美国专利us9,371,396b2)，ec
50
在79.9
±
2.76ng/ml的范围内；
[0210]
f)诱导针对替代靶细胞的cmc活性，该替代靶细胞表达对抗cd22抗体具有特异性的抗独特型抗体的表面结合部分，ec
50
在0.1509
±
20.7μg/ml的范围内(参见美国专利us 9,371,396 b2，其通过引用并入本文)；
[0211]
g)具有轻链cdr3结构域，该轻链cdr3结构域包含seq id no:004或从seq id no:004修饰得到的氨基酸序列；
[0212]
h)具有重链cdr3结构域，该重链cdr3结构域包含seq id no:008或从seq id no:008修饰得到的氨基酸序列。
[0213]
更优选地，抗体或其抗原结合部分以0.0685ru s
‑1或更低的kd与人cd22解离。甚至更优选地，抗体或其抗原结合部分以0.0137ru s
‑1或更低的kd与人cd22解离。
[0214]
在又一实施方式中，本发明提供了通过每两周一次静脉内施用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分来治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方法。抗体或其抗原结合部分优选包含轻链可变区(lcvr)和重链可变区(hcvr)，所述lcvr具有包含seq id no:004或从seq id no:004修饰得到的氨基酸序列的cdr3结构域，所述hcvr具有包含seq id no:008或从seq id no:008修饰得到的氨基酸序列的cdr3结构域。优选地，所述lcvr还具有包含seq id no:003的氨基酸序列的cdr2结构域，所述hcvr还具有包含seq id no:007的氨基酸序列的cdr2结构域。甚至更优选地，所述lcvr还具有包含seq id no:002的氨基酸序列的cdr1结构域，所述hcvr具有包含seq id no:006的氨基酸序列的cdr1结构域。vl的框架区优选来自vκ10小鼠种系家族，并且最优选来自中国专利zl03123054.7的图4a所示的sm03框架序列。vh的框架区优选来自vh5小鼠种系家族，并且最优选来自中国专利zl03123054.7的图4b所示的sm03 vh框架序列。更优选地，vl的框架1(fr1)区优选来自vκ10人种系家族，vl的框架2(fr2)区优选来自vκ1人种系家族，vl的框架3(fr3)区优选来自vκ1人种系家族，vl的框架4(fr4)区优选来自vκj1人种系家族，并且最优选地来自美国专利7321026b2的图3b所示的sm06框架序列。vh的框架1(fr1)区优选来自v
h
3人种系家族，vh的框架2(fr2)区优选来自v
h
3人种系家族，vh的框架3(fr3)区优选来自v
h
3人种系家族，vh的框架4(fr4)区优选来自v
h
j5人种系家族，并且最优选来自美国专利7,321,026b2的图3a中所示的sm06框架序列。
[0215]
在又一个实施方式中，本发明提供了通过每两周一次静脉内施用分离的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体或其抗原结合部分来治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方法。抗体或其抗原结合部分优选包含轻链可变区(lcvr)和重链可变区(hvcr)，所述lcvr包括seq id no:001(即sm03 vl)的氨基酸序列，所述hvcr包括seq id no:005(即sm03 vh)的氨基酸序列。在某些实施方式中，抗体包含重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区或者具有糖基化位点和/或在糖基化位点处修饰的糖型的任何上述恒定区。优选地，抗体包含κ轻链恒定区。或者，抗体部分可以是例如fab片段或单链fv片段。
[0216]
本发明的抗体或抗体部分可衍生或连接到另一功能分子(例如，另一肽或蛋白
质)。因此，本发明的抗体和抗体部分意图包括本文所述的人抗cd22抗体的衍生形式和其他修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，本发明的抗体或抗体部分可以功能性地连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或引入适用于位点特异性结合的人工氨基酸/官能团)到一个或多个其他分子实体，例如另一抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药物剂和/或可介导抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。
[0217]
一种类型的衍生抗体是通过交联两种或更多种抗体(相同类型或不同类型的，例如，为产生双特异性抗体)而产生的。合适的交联剂包括具有由合适间隔基(例如，间马来酰亚胺苯甲酰基
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯)隔开的两个反应性不同的基团的异双官能团交联剂或同双官能团交联剂(例如，二琥珀酰亚胺酯)。此类连接剂可得自thermo scientific，waltham，ma。
[0218]
可用以衍生本发明抗体或抗体部分的可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5
‑
二甲胺
‑1‑
萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体也可由可检测的酶衍生，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。当用可检测的酶来衍生抗体时，通过添加额外的试剂来检测抗体，酶使用这些试剂产生可检测的反应产物。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测的有色反应产物。也可用生物素衍生抗体，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉亲和素结合来检测。
[0219]
iii.可用其衍生本发明的抗体或抗体部分以轭合的细胞毒性剂包括化学治疗剂如炔烃。
[0220]
示例性化学治疗剂包括卡利他霉素、美登木素生物碱和奥利司坦等。也可用细胞毒性毒素衍生抗体，例如白喉毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素链、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、商陆毒蛋白等。与化疗药物或细胞毒素轭合的衍生抗体可用作治疗涉及人cd22抗原表达的自身免疫疾病或癌症的治疗药物。
[0221]
iv.抗体的表达
[0222]
本发明的抗体或抗体部分可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，用一个或多个携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的dna片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达，并且优选地，分泌到培养宿主细胞的培养基中，从培养基中可以回收抗体。标准重组dna技术用于获得抗体重链和轻链基因，将这些基因加入重组表达载体中，并将载体引入宿主细胞中，如以下中所述：sambrook，fritsch and maniais(eds)，molecular cloning:a laboratory manual，seond edition，cold spring harbor，n.y.，(1989)，ausubel，f.m.等人，(eds.)current protocols in molecular biology，greene publishing assoviates，(1989)以及美国专利第4,816,397号，boss等人。
[0223]
为表达sm03、sm06或sm03/sm06相关抗体，首先获得编码轻链和重链可变区的dna片段。这些dna可通过使用聚合酶链反应(pcr)扩增和修饰小鼠抗体轻链和重链可变序列的杂交瘤获得，或通过使用本领域技术人员已知的标准方法基于设计轻链和重链可变序列的编码氨基酸序列的寡合来获得。编码dna序列可进一步优化以促进所得抗体在哺乳动物中表达。
[0224]
一旦获得小鼠抗体的vh和vl片段，这些序列就可以被突变以编码sm03的框架搭接形式(即sm06)，其方法在以下中描述：中国专利zl 011zl 031 23054.7和美国专利7,321,026b2和7,338,659b2，以上专利通过引用以其整体并入本文。
[0225]
一旦获得编码sm03或sm06或sm03/sm06相关vh和vl片段的dna片段(如上所述，通过扩增和突变原始小鼠vh和vl基因)，这些dna片段可通过标准重组dna技术进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、fab片段基因或单链抗体基因。在这些操作中，编码vl或vh的dna片段可操作地连接到编码另一蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一dna片段。本文所用的术语“可操作地连接”意指两个dna片段接合在一起，使得由这两个dna片段编码的氨基酸序列保持在框架中。
[0226]
通过将编码vh的dna与编码重链恒定区(ch1、ch2和ch3)的另一dna分子可操作地连接，可将编码vh区的分离的dna转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的。(参见例如，kabat，e.a.等人(1991)sequences of proteins of immunological interest，fifth edition，u.s.department of health and human services，nih publication no.91
‑
3242)，并且包含这些区域的dna片段可通过标准pcr扩增获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、ig4、iga、ige、igm或igd恒定区，但最优选的是igg1或igg4恒定区。对于fab片段重链基因，编码vh的dna可以可操作地连接到另一个仅编码重链ch1恒定区的dna分子。
[0227]
可通过将编码vl的dna可操作地连接到编码轻链恒定区cl的另一dna分子而将编码vl区的分离的dna转化为全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域是已知的(参见例如kabat，e.a.等人(1991)sequences of proteins of immunological interest，fifth edition，u.s.department of health and human services，nih publication no.91
‑
3242)，包含这些区的dna片段可通过标准pcr扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选的是κ恒定区。
[0228]
为产生单链抗体(scfv)基因，编码vh和vl的dna片段可操作地连接到编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(gly4‑
ser)3)的另一片段，使得vh和vl序列可以表达为连续的单链蛋白，其中vl和vh区由柔性接头连接(参见例如，bird等人，(1988)science 242:423
‑
426；huston等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879
‑
5883；mccafferty等人，(1990)nature 348:552
‑
554)。
[0229]
为表达本发明的抗体或抗体部分，将编码如上所述获得的部分或全长轻链和重链的dna插入表达载体中，使得基因可操作地连接到转录和翻译控制序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”意指将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到单独的载体中，或者更典型地，两个基因都插入到相同的表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入表达载体(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，则进行钝端连接)。在插入sm03、sm06或sm03/sm06相关的轻链或重链序列之前，表达载体可能已经携带抗体恒定区序列。例如，将sm03或sm06或sm03/sm06相关vh和vl序列转换为全长抗体基因的一种方法是将它们分别插入已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得vh链段可操作地连接到载体内的ch链段，vl链段可操作地连接到载体内的cl链段。另外或替代地，重组表达
载体可编码促进从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。抗体链基因可以被克隆到载体中，使得信号肽在框架中连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0230]
除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意图包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。此类调控序列在例如goeddel；gene expression technology:methods in enzymology 185，academic press，san diego，calif.(1990)中描述。本领域技术人员将认识到，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等的因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自免疫球蛋白重链(igh)增强子的启动子和/或增强子(gillies等人，(1983)cell 33:717
‑
728)金属硫蛋白(mt)、巨细胞病毒(cmv)(如cmv启动子/增强子)、猴病毒40(sv40)(如sv40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(admlp))和多瘤病毒。
[0231]
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体可携带附加序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制(例如，复制起源)的序列和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已导入载体的宿主细胞。例如，选择标记基因通常会赋予已导入载体的宿主细胞对药物(例如g418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr
‑
宿主细胞)、谷氨酸合酶(gs)基因和neo基因(用于g418选择)。
[0232]
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图涵盖通常用于将外源dna导入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、deae
‑
葡聚糖转染、脂质体转染、原生质体融合等。尽管理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞中，最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为这样的真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，它们比原核细胞更有可能聚集并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。据报道，抗体基因的原核表达对产生高产量的活性抗体无效(boss，m.a.and wood c.r.(1985)immunology today 6:12
‑
13)。
[0233]
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括sp2/0骨髓瘤细胞、nso骨髓瘤细胞、cos细胞和中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括dfhr
‑
cho细胞，在以下中描述：urlaub and chasin，(1980)proc.natl.acad.sci.usa 77:4216
‑
4200，与dhfr选择标记一起使用，例如，如在以下中描述：r.j.kaufman and p.a.sharp(1982)jmol.biol.159：601
‑
621)。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养一段足以使抗体在宿主细胞中表达的时间来产生抗体，或者更优选地，将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。可使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
[0234]
也可使用宿主细胞产生完整抗体的部分，如fab片段或scfv分子。应理解上述程序的变型也在本发明的范围内。例如，理想的可以是用编码本发明的抗体的轻链或重链(但不是二者都用)的dna来转染宿主细胞。也可使用重组dna技术去除编码对结合cd22来说不必要的轻链和重链之一或二者的dna的一些或全部。由此类截短的dna分子表达的分子包含在本发明的抗体中。此外，可以通过标准化学交联方法将本发明的抗体与第二抗体交联来产
生双功能抗体，在该双功能抗体中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，而另一条重链和轻链对非cd22的抗原具有特异性。
[0235]
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的优选系统中，通过电穿孔将编码抗体重链和抗体轻链二者的重组表达载体导入sp2/0细胞中。在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的又一优选系统中，通过诸如脂质体转染的标准技术将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入cho细胞。
[0236]
在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与小鼠或人免疫球蛋白重链(igh)、cmv增强子、金属硫蛋白或admlp启动子调控元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带dhfr基因，该基因允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的sp2/0细胞。或者，可使用含有与小鼠或人igh、cmv增强子/admlp/金属硫蛋白启动子调控元件可操作地连接的抗体重链和轻链基因以及dhfr基因的重组表达载体转染sp2/0或cho细胞，这些细胞是dhfr
‑
。可选择用该载体转染的sp2/0或cho细胞，并通过增加培养物中甲氨蝶呤的水平来增强载体中的基因表达水平。培养选定的转化宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中回收完整的抗体。采用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，筛选转化子，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。
[0237]
v.重组人抗体的筛选
[0238]
可通过筛选重组组合抗体文库(优选使用从衍生自人淋巴细胞的mrna制备的人vl和vh cdna制备的scfv噬菌体展示文库)分离除了sm03、sm06或其抗原结合部分或者sm03相关抗体之外的本发明的重组人抗体，所述sm03相关抗体结合结构域2中的特异性人cd22不连续构象表位，如本文所公开的，其破坏人cd22同源多聚体顺式结合。在另一实施方式中，重组人抗体与抗独特型抗体(lrid)结合。本领域已知用于制备和筛选此类文库的方法。除了市售的用于生成噬菌体展示文库的试剂盒(例如，ge医疗生命科学重组抗体噬菌体系统(raps)；和新英格兰生物实验室博士噬菌体展示文库试剂盒，目录第e8100s号)之外，适合用于生成和筛选抗体展示文库的方法和试剂的示例可在例如以下中找到：fuchs等人，(1991)biotechnology 9:1369
‑
1372；hay等人，(1992)hum antibod hybridomas 3:81
‑
85；huse等人，(1989)science 246:1275
‑
1281；mccafferty等人，nature(1990)348:552
‑
554；griffiths等人，(1993)embo j 12:725
‑
734；hawkins等人，(1992)j mol biol 226:889
‑
896；clackson等人，(1991)nature 352:624
‑
628；gram等人，(1992)pnas 89：3579
‑
3580；garrard等人，(1991)biotechnology 9：1373
‑
1377；hoogenboom等人，(1991)nuc acid res 19:4133
‑
4137；以及barbas等人，(1991)pnas 88：7978
‑
7982.
[0239]
在优选实施方式中，为分离对人cd22具有高亲和力和低解离速率常数的鼠抗体、重组抗体或人抗体，首先使用对人cd22具有高亲和力和低解离速率常数的亲本鼠抗体或嵌合抗cd22抗体(例如，保藏于atcc中的鼠抗cd22抗体杂交瘤，保藏号：7621)，使用以下中所述的表位印迹方法：hoogenboom等人，pct公开第wo93/06213号，来选择具有与人cd22相似的结合活性的人重链和轻链序列。该方法中所用的抗体文库优选为如以下中所述制备和筛选的scfv文库：mccafferty等人，pct公开第wo 92/01047号，mccafferty等人，nature(1990)348:552
‑
554；和griffiths等人，(1993)embo j 12:725
‑
734。优选使用重组人cd22(2
‑
4结构域)和/或针对抗cd22抗体的抗原结合位点(abs)有特异性的抗独特型抗体(例如，如美国专利9371396b中所述的lrid)作为抗原来筛选scfv抗体文库。
[0240]
一旦选择了初始人vl和vh片段，就进行“混合匹配”实验，对初始选择的vl和vh片段进行不同对的筛选，用于与人cd22结合，以选择优选的vl/vh对组合。此外，为了进一步提高人cd22(或重组cd22(2
‑
4)结构域)结合的亲和力和/或降低失活速率常数，优选的vl/vh对的vl和vh片段可以在类似于自然免疫反应中负责抗体亲和力成熟的体内体细胞突变过程的过程中随机突变，优选在vh和/或vl的cdr3区中。这种体外亲和力成熟可通过使用分别与vh cdr3或vl cdr3互补的pcr引物扩增vh和vl区来完成，这些引物已在某些位置用四种核苷酸碱基的随机混合物“加标”，使得所得的pcr产物编码其中vh和/或vl cdr3区中已被引入随机突变的vh和vl链段。这些随机突变的vh和vl链段可重新筛选以与人cd22结合，优选与含有cd22的结构域2
‑
4的重组蛋白结合，和/或与抗cd22抗体的抗独特型抗体(例如lrid)结合；并且可选择对人cd22(优选重组cd22(2
‑
4)结构域和/或用于cd22(例如lrid)结合的抗独特型抗体)显示高亲和力和低解离率的序列。
[0241]
在从重组免疫球蛋白展示文库筛选和分离本发明的抗人cd22抗体之后，编码所选抗体的核酸可从展示包(例如，从噬菌体基因组)中回收，并通过标准重组dna技术亚克隆到其它表达载体中。如果需要，可进一步操纵核酸以产生本发明的其他抗体形式(例如，连接到编码额外的免疫球蛋白结构域(例如额外的恒定区)的核酸)。为表达通过筛选组合文库分离的重组人抗体，将编码该抗体的dna克隆到重组表达载体中并导入哺乳动物宿主细胞中，如上文第二节中进一步详细描述的。
[0242]
vi.药物组合物和药物施用
[0243]
本发明的抗体和抗体部分可被加入到适用于施用给本文所述方法的受试者的药物组合物中，例如，两个或三个周期(或多个周期)的每两周一次静脉内给药。通常，药物组合物包含本发明的抗体(或抗体部分)和/或甲氨蝶呤和药学上可接受的载体。如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其在生理上相容并且适合用于本文所述方法的受试者的施用。药学上可接受的载体的示例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其延长抗体或抗体部分的保质期或增强其有效性。
[0244]
本发明的组合物可以具有多种形式。例如，这些包括液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和不可注射的溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期的给药方式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式，例如类似于用其他抗体对人进行被动免疫的那些组合物。优选的施用方式是肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹腔内、肌内)。在优选实施方式中，通过静脉输注或注射施用抗体。在另一优选实施方式中，通过肌内注射施用抗体。在特别优选的实施方式中，通过皮下注射(例如，多个周期的每两周一次皮下注射)施用抗体。
[0245]
治疗组合物在制造和储存条件下通常必须是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物(即抗体或抗体部分)放入含有上述一种或多种成分的组合(视需要)的适当溶剂中，然后经过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将活性化合物加入到含有基本分散介质和上述所需其他成分的无菌载体中来制备。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而
52000；重组il
‑
10，抗炎性细胞因子；dnax/schering)；il
‑
4；il
‑
10和/或il
‑
4激动剂(例如，激动剂抗体)；il
‑
1ra(il
‑
1受体拮抗剂；synergen/amgen)；tnf
‑
bp/s
‑
tnfr(可溶性tnf结合蛋白；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s284；amer.j.physiol.heart and circulatory physiology(1995)vol.268，pp.37
‑
42)；r973401(磷酸二酯酶iv型抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s82)；(甲氨蝶呤；沙利度胺(参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)和沙利度胺相关药物(例如，celgen)；来氟米特(抗炎和细胞因子抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s131；inflammation research(1996)vol.39，no.9(增补)，s131；inflammation research(1996)vol.45，pp.103
‑
107)；传明酸(血纤维蛋白溶酶源活化抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s284)；janus kinase(jak1，jak2，jak3，tyk2)抑制剂(参见，例如，banerjee等人，(2017)drugs 77：521
‑
545)；t
‑
614(细胞因子抑制剂；参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)；前列腺素e1(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)；替尼达普(非甾体抗炎药；参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s280)；萘普生(非甾体抗炎药；参见例如，neuro report(1996)vol.7，pp.1209
‑
1213)；美洛昔康(非甾体抗炎药)；布洛芬(非甾体抗炎药)；吲哚美辛(非甾体抗炎药)；柳氮磺胺吡啶(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s281)；咪唑硫嘌呤(参加例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s281)；ice抑制剂(白介素
‑
1β转化酶抑制剂)；zap
‑
70和/或1ck抑制剂(酪氨酸激酶zap
‑
70或1ck的抑制剂)；vegf抑制剂和/或vegf
‑
r抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管生成抑制剂)；皮质类固醇抗炎药(例如sb203580)；tnf转化酶抑制剂；抗il12抗体；白介素
‑
11(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s296)；白介素
‑
13(参见arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s308)；白介素
‑
17抑制剂(参见arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s120)；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺，环孢霉素；全淋巴照射；抗胸腺细胞球蛋白；抗cd4抗体；cd5毒素；口服施用的肽和胶原；洛贝扎利二钠；细胞因子调节剂(cra)hp228和hp466(houghtenpharmaceuticals，inc.)；icam
‑
1反义硫代磷酸寡核苷酸(isis 2302；isis pharmaceuticals，inc.)；可溶性补体受体1(tp10；t cell sciences，inc.)；泼尼松；奥古蛋白；多硫酸糖胺聚糖；二甲胺四环素；抗il2r抗体；海洋和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如deluca等人，(1995)rheum.dis.clin.north am.21:759
‑
777)；金诺芬；苯丁氮酮；甲氯芬酸；氟苯那酸；静脉内施用免疫球蛋白；齐留通；麦考酚酸(rs
‑
61443)；他克莫司(fk
‑
506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(盐酸氨普立糖)；克拉屈滨(2
‑
氯脱氧腺苷)；和阿扎瑞宾。
[0250]
可与本发明的抗体或抗体部分结合的炎性肠病治疗剂的非限制性示例包括：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢霉素、柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6
‑
巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓素抑制剂；il
‑
1受体拮抗剂；抗il
‑
1β单克隆抗体；抗il
‑
6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基咪唑化合物；cdp
‑
571/bay
‑
10
‑
3356(人源化抗tnfα抗体；celltech/bayer)；ca2(嵌合抗tnfα抗体；centocor)；75kdtnfr
‑
igg(75dd tnf受体
‑
igg融合蛋白；immunex；参见例
如，arthritis&rheumatism(1994)vol.37，s295；j.invest.med.(1996)vol.44，235a)；55kd tnfr
‑
igg(55kd tnf受体
‑
igg融合蛋白；hoffmann
‑
laroche)：白介素
‑
10(sch 52000；schering plough)；il
‑
4；il
‑
10和/或il
‑4‑
激动剂(例如激动剂抗体)；白介素
‑
11；泼尼松龙、地塞米松或布地奈德的葡糖苷酸或葡聚糖轭合前药；icam
‑
1反义硫代磷酸寡核苷酸(isis 2302；isis pharmaceuticals，inc.)；可溶性补体受体1(tp10；t cell sciences，inc.)；缓释美沙拉秦；甲氨蝶呤；血小板活化因子(paf)拮抗剂；环丙沙星；和利多卡因。
[0251]
可与本发明的抗体或抗体部分结合的多发性硬化症治疗剂的非限制性示例包括：皮质类固醇；泼尼松龙；甲基泼尼松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢霉素；甲氨蝶呤；4
‑
氨基吡啶；替扎尼定；干扰素
‑
β1a(avonex
tm
；biogen)；干扰素
‑
β1b(betseron
tm
；chiron/berlex)；共聚物1(cop
‑
1；copaxone
tm
；teva pharmatical industries，inc.)；高压氧；静脉注射免疫球蛋白；克拉布滨；cdp
‑
571/bay
‑
10
‑
3356(人源化抗tnfα抗体；celltech/bayer)；ca2(嵌合抗tnfα抗体；centocor)；75
‑
kdtnfr igg(75
‑
dd
‑
tnf受体
‑
igg融合蛋白；immunex；例如，参见arthritis&rheumatism(1994)vol.37，s295；j.invest.med.(1996)vol.44，235a)；55kd tnfr
‑
igg(55kd tnf受体
‑
igg融合蛋白；hoffmann
‑
laroche)；il
‑
10；il
‑
4；以及il
‑
10和/或il
‑
4激动剂(例如，激动剂抗体)。
[0252]
可与本发明的抗体或抗体部分结合的用于舍格伦综合征的治疗剂的非限制性示例包括：细胞因子抑制性抗炎药(csaid)；cdp
‑
571/bay
‑
10
‑
3356(人源化抗tnfα抗体；celltech/bayer)；ca2(嵌合抗tnfα抗体；centocor)；75d2e7(全人抗tnfα抗体；cat/abbott)；cam3001(全人抗gmcsf受体抗体；cat/medimmune)；cnto148(全人抗tnfα抗体；centocor/janssen)；ain457(全人抗il17a抗体；novartis)；托珠单抗(人源化抗il6受体抗体；chugai/hoffman
‑
laroche)；75kdtnfr
‑
igg(75kd tnf受体
‑
igg融合蛋白；immunex；参见，例如，arthritis&rheumatism(1994)vol.37，s295；j.invest.med.(1996)vol.44，235a)；55kdtnfr
‑
igg(55kd tnf受体
‑
igg融合蛋白；hoffmann
‑
laroche):idec
‑
ce9.1/sb 210396(非消耗性灵长类抗cd4抗体；idec/smithkline；参见，例如，arthritis&rheumatism(1995)vol.38，s185)；dab 486
‑
il
‑
2和/或dab 389
‑
il
‑
2(il
‑
2融合蛋白；seragen；参见，例如，arthritis&rheumatism(1993)vol.36，1223)；抗tac(人源化抗il
‑
2rα；protein design labs/roche)；il
‑
3(抗炎性细胞因子；dnas/schering)；il
‑
10(sch 52000；重组il
‑
10，抗炎性细胞因子；dnax/schering)；il
‑
4；il
‑
10和/或il
‑
4激动剂(例如，激动剂抗体)；il
‑
1ra(il
‑
1受体拮抗剂；synergen/amgen)；tnf
‑
bp/s
‑
tnfr(可溶性tnf结合蛋白；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s284；amer.j.physiol.heart and circulatory physiology(1995)vol.268，pp.37
‑
42)；r973401(磷酸二酯酶iv型抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s82)；(甲氨蝶呤；沙利度胺(参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)和沙利度胺相关药物(例如，celgen)；来氟米特(抗炎和细胞因子抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s131；inflammation research(1996)vol.39，no.9(增补)，s131；inflammation research(1996)vol.45，pp.103
‑
107)；传明酸(血纤维蛋白溶酶源活化抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s284)；janus kinase(jak1，jak2，jak3，tyk2)抑制剂(参见，例如，banerjee等人，(2017)drugs 77:521
‑
545)；t
‑
614(细胞因子抑制剂；参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增
补)，s282)；前列腺素e1(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)；替尼达普(非甾体抗炎药；参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s280)；萘普生(非甾体抗炎药；参见例如，neuro report(1996)vol.7，pp.1209
‑
1213)；美洛昔康(非甾体抗炎药)；布洛芬(非甾体抗炎药)；吲哚美辛(非甾体抗炎药)；柳氮磺胺吡啶(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s281)；咪唑硫嘌呤(参见例如，athritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s281)；ice抑制剂(白介素
‑
1β转化酶抑制剂)；zap
‑
70和/或1ck抑制剂(酪氨酸激酶zap
‑
70或1ck的抑制剂)；vegf抑制剂和/或vegf
‑
r抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管生成抑制剂)；皮质类固醇抗炎药(例如sb203580)；tnf转化酶抑制剂；抗il12抗体；白介素
‑
11(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s296)；白介素
‑
13(参见arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s308)；白介素
‑
17抑制剂(参见arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s120)；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺，环孢霉素；全淋巴照射；抗胸腺细胞球蛋白；抗cd4抗体；cd5毒素；口服施用的肽和胶原；洛贝扎利二钠；细胞因子调节剂(cra)hp228和hp466(houghtenpharmaceuticals，inc.)；icam
‑
1反义硫代磷酸寡核苷酸(isis 2302；isis pharmaceuticals，inc.)；可溶性补体受体1(tp10；t cell sciences，inc.)；泼尼松；奥古蛋白；多硫酸糖胺聚糖；二甲胺四环素；抗il2r抗体；海洋和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如deluca等人，(1995)rheum.dis.clin.north am.21:759
‑
777)；金诺芬；苯丁氮酮；甲氯芬酸；氟苯那酸；静脉内施用免疫球蛋白；齐留通；麦考酚酸(rs
‑
61443)；他克莫司(fk
‑
506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(盐酸氨普立糖)；克拉屈滨(2
‑
氯脱氧腺苷)；和阿扎瑞宾。
[0253]
可与本发明的抗体或抗体部分结合的系统性红斑狼疮(sle)治疗剂的非限制性示例包括：皮质类固醇；泼尼松龙；甲基泼尼松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢霉素；甲氨蝶呤；4
‑
氨基吡啶；替扎尼定；干扰素
‑
β1a(avonex
tm
；biogen)；干扰素β1b(betseron
tm
；chiron/berlex)；共聚物1(cop
‑
1；copaxone
tm
；teva pharmatical industries，inc.)；高压氧；静脉注射免疫球蛋白；克拉布滨；cdp
‑
571/bay
‑
10
‑
3356(人源化抗tnfα抗体；celltech/bayer)；ca2(嵌合抗tnfα抗体；centocor)；75d2e7(全人抗tnfα抗体；cat/abbott)；cnto148(全人抗tnfα抗体；centocor/janssen)；cam3001(全人抗gmcsf受体抗体；cat/medimmune)；ain457(全人抗il17a抗体；novartis)；75
‑
kdtnfr igg(75
‑
dd
‑
tnf受体
‑
igg融合蛋白；immunex；例如，见arthritis&rheumatism(1994)vol.37，s295；j.invest.med.(1996)vol.44，235a)；55kdtnfr
‑
igg(55kd tnf受体
‑
igg融合蛋白；hoffmann
‑
laroche)；il
‑
10；il
‑
4；以及il
‑
10和/或il
‑
4激动剂(例如，激动剂抗体)；)；il
‑
1ra(il
‑
1受体拮抗剂；synergen/amgen)；tnf
‑
bp/s
‑
tnfr(可溶性tnf结合蛋白；参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s284；amer.j.physiol.heart and circulatory physiology(1995)vol.268，pp.37
‑
42)；r973401(磷酸二酯酶iv型抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s82)；(甲氨蝶呤；沙利度胺(参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)和沙利度胺相关药物(例如，celgen)；来氟米特(抗炎和细胞因子抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s131；inflammation research(1996)vol.39，no.9(增补)，s131；inflammation research(1996)
vol.45，pp.103
‑
107)；传明酸(血纤维蛋白溶酶源活化抑制剂；参见，例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s284)；janus kinase(jak1，jak2，jak3，tyk2)抑制剂(参见，例如，banerjee等人，(2017)drugs 77：521
‑
545)；t
‑
614(细胞因子抑制剂；参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)；前列腺素e1(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s282)；替尼达普(非甾体抗炎药；参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s280)；萘普生(非甾体抗炎药；参见例如，neuro report(1996)vol.7，pp.1209
‑
1213)；美洛昔康(非甾体抗炎药)；布洛芬(非甾体抗炎药)；吲哚美辛(非甾体抗炎药)；柳氮磺胺吡啶(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s281)；咪唑硫嘌呤(参见例如，athritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s281)；ice抑制剂(白介素
‑
1β转化酶抑制剂)；zap
‑
70和/或1ck抑制剂(酪氨酸激酶zap
‑
70或1ck的抑制剂)；vegf抑制剂和/或vegf
‑
r抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管生成抑制剂)；皮质类固醇抗炎药(例如sb203580)；tnf转化酶抑制剂；抗il12抗体；白介素
‑
11(参见例如，arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s296)；白介素
‑
13(参见arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s308)；白介素
‑
17抑制剂(参见arthritis&rheumatism(1996)vol.39，no.9(增补)，s120)；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺，环孢霉素；全淋巴照射；抗胸腺细胞球蛋白；抗cd4抗体；cd5毒素；口服施用的肽和胶原；洛贝扎利二钠；细胞因子调节剂(cra)hp228和hp466(houghtenpharmaceuticals，inc.)；icam
‑
1反义硫代磷酸寡核苷酸(isis 2302；isis pharmaceuticals，inc.)；可溶性补体受体1(tp10；t cell sciences，inc.)；泼尼松；奥古蛋白；多硫酸糖胺聚糖；二甲胺四环素；抗il2r抗体；海洋和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如deluca等人，(1995)rheum.dis.clin.north am.21：759
‑
777)；金诺芬；苯丁氮酮；甲氯芬酸；氟苯那酸；静脉内施用免疫球蛋白；齐留通；麦考酚酸(rs
‑
61443)；他克莫司(fk
‑
506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(盐酸氨普立糖)；克拉屈滨(2
‑
氯脱氧腺苷)；和阿扎瑞宾。
[0254]
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内达到预期治疗效果的有效量。抗体或抗体部分的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发期望反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内达到预期预防效果的有效量。通常，由于预防剂量用于疾病发生之前或早期阶段的受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。
[0255]
可调整剂量方案以提供最佳期望反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可施用单个丸剂，可随时间施用若干分剂量，或者根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。为方便施用和剂量的均匀性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其有利。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位包含预定量的活性化合物，经计算以产生与所需药物载体相关的期望治疗效果。本发明的剂量单位形式的说明书由以下因素决定并直接依赖于以下因素：(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗或预防效果，以及(b)配制这种活性化合物用于治疗个体敏感性的技术中固有的局限性。
[0256]
例如，出于说明目的，本发明抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的非限制性范围为100
‑
1000mg、更优选400
‑
800mg且最优选约600mg。应注意，剂量值可随待缓解病况的类型和严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定受试者而言，具体的剂量方案应根据个人需要和用药人或监督用药人的专业判断随时间而调整，并且本文所阐述的剂量范围仅是示例性的，并不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
[0257]
vii.本发明抗体的用途
[0258]
本发明的抗cd22抗体或其部分具有与人cd22结合的能力，特别是针对含有人cd22的结构域2
‑
4的重组蛋白，更具体地，针对结构域2，甚至更具体地，针对包含序列
161
cllnfscygypiq
173
(seq id no:016)和
198
vftrselkfsqwshhgkivtc
219
(seq id no:017)的不连续构象表位；及结合针对抗cd22抗体(具体地，lrid抗体)的抗独特型抗体的能力。因此，本发明的抗cd22抗体或其部分可用于使用常规免疫分析(例如流式细胞术分析、放射免疫分析(ria)、酶联免疫吸附分析(elisa)或组织免疫组织化学)检测人cd22阳性细胞或含有上述构象表位的可溶性人cd22(例如，在含有浸润淋巴细胞的生物样品中的)，或抗独特型抗体，或在细胞表面表达部分抗独特型抗体的细胞系。
[0259]
本发明提供了一种在生物样品中检测人cd22阳性细胞或可溶性人cd22，或针对抗cd22抗体的抗独特型抗体，或在细胞表面表达部分抗独特型抗体的细胞系的方法，所述方法包括将生物样品与本发明的抗体或抗体部分接触，检测与人cd22阳性细胞或可溶性人cd22结合的抗体(或抗体部分)，或针对抗cd22抗体的抗独特型抗体，或在细胞表面表达部分抗独特型抗体的细胞系，或未结合的抗体(或抗体部分)，由此检测样品中的人cd22阳性细胞或可溶性人cd22，或针对抗cd22抗体的抗独特型抗体，或在细胞表面表达部分抗独特型抗体的细胞系。抗体直接或间接地用可检测物质标记，以便于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β
‑
半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形花序酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的示例包括鲁米诺；合适的放射性材料的示例包括
125
i、
131
i、
35
s或3h。
[0260]
除了标记抗体之外，人cd22阳性细胞或可溶性人cd22或针对cd22抗体的抗独特型抗体或在细胞表面上表达部分抗独特型抗体的细胞系可通过竞争性免疫测定法在生物液体中测定，所述竞争性免疫测定法利用可检测物质标记的作为标准品的重组人cd22或重组人cd22结构域2
‑
4或包含含有序列
161
cllnfscygypiq
173
和
198
vftrselkfspqwshhgkivtc
219
的不连续构象表位的重组结构域或针对抗cd22抗体的抗独特型抗体或在细胞表面上表达部分抗独特型抗体的细胞系和未标记的抗cd22抗体。在本试验中，将生物样品、标记标准品(其可以是人cd22或含有不连续构象表位(包含
161
cllnfscygypiq
173
和
198
vftrselkfsqwshhgkivtc
219
)的序列片段或针对抗cd22抗体的抗独特型抗体，以及抗cd22抗体结合起来并测定与未标记抗体结合的标记标准品的量。生物样品中人cd22或针对抗cd22抗体的抗独特型抗体的量与抗cd22抗体所结合的标记标准品的量成反比。
[0261]
尽管抗人cd22抗体不与非灵长类cd22交叉反应，但本发明的抗体或抗体部分可用于人类受试者或非治疗目的的其他哺乳动物(例如灵长类动物)受试者。
[0262]
在优选实施方式中，本发明提供了治疗其中抗cd22抗体的施用有益的病症的方
法，包括以每两周一次的周期向受试者静脉内施用本发明的抗体或抗体部分以治疗该疾病。在特别优选的实施方式中，抗体以每两周一次以多个周期静脉内施用。在另一个特别优选实施方式中，在施用甲氨蝶呤之前、期间或之后静脉内施用抗体。优选地，受试者是人类受试者。或者，受试者可以是表达可与本发明抗体交叉反应的cd22的哺乳动物。更进一步地，受试者可以是哺乳动物，已经向该哺乳动物中引入人cd22(例如，通过施用人cd22或通过表达人cd22转基因)或针对抗cd22抗体的抗独特型抗体(例如，通过施用针对抗cd22抗体的抗独特型抗体或通过表达抗独特型抗体转基因)。可将本发明抗体施用于人类受试者以用于治疗目的(下文进一步讨论)。此外，本发明的抗体可被施用于表达交叉反应的cd22或替代抗原的非人哺乳动物(例如，在灵长类动物、猪或小鼠中)以用于兽医目的或作为人类疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可用于评估本发明抗体的治疗效果(例如，剂量和给药时间过程的测试)。
[0263]
本文所用的术语“其中抗cd22抗体的施用有益的病症”意图包含如下的疾病和其他病症：其中患有该病症的受试者中的特定细胞类型中或一组细胞中的cd22过度表达，或者患有该病症的受试者中表达cd22的细胞通过与本发明的抗体或抗体部分的相互作用进行的活性调节已被证明或被怀疑对该病症的病理生理学或导致病症的恶化(cd22阳性细胞的过度表达)或改善(cd22阳性细胞的调节)的因素有责任，或者已证实另一种抗cd22抗体或其生物活性部分已成功地用于治疗所述疾病。因此，其中cd22阳性细胞过度活跃或过度表达cd22的细胞有害的病症是这样的病症：其中预期调节cd22阳性细胞活性会减轻该病症的症状和/或进展。例如，可通过患有该病症的受试者的生物液体中的cd22阳性细胞群的增加(例如，受试者的循环、滑液、病变等部位中的cd22阳性细胞群的增加)来证明此类疾病，这种增加例如可使用如上所述的抗cd22抗体来检测。有多种其中cd22阳性细胞过度活跃有害的病症的示例。
[0264]
本发明的抗体或抗体部分在治疗特定病症中的用途在下文中进一步讨论:
[0265]
a.自身免疫疾病
[0266]
b细胞在多种自身免疫疾病的病理生理过程中起着重要作用。例如，b细胞存在于类风湿性关节炎(ra)患者的炎症滑膜组织中。在ra患者中，b细胞产生活化吞噬细胞和补体的自身抗体。b细胞还呈递自身抗原，并且向自身反应性t细胞提供共刺激信号，并产生进一步激活b细胞、t细胞和其他炎症细胞的细胞因子。b细胞还可用作t细胞的抗原提呈细胞，并为t细胞活化提供共刺激信号。嵌合和人源化的小鼠抗cd22抗体已经经历了用于治疗类风湿性关节炎和其他自身免疫病症的临床试验，其结果在本文中公开(参见实施例4和5)。
[0267]
本发明的嵌合和/或框架搭接(人源化)抗体和抗体部分可用于治疗自身免疫病症，特别是与炎症相关的病症，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊柱炎、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、舍格伦病、系统性红斑狼疮(sle)等。通常，抗体或抗体部分全身性地施用，尽管对于某些病症，在炎症部位局部施用抗体或抗体部分可能是有益的。
[0268]
b.移植
[0269]
实体器官移植的免疫抑制策略主要集中在去除t细胞或抑制其功能上。然而，人们对b细胞、浆细胞及其相关抗体在同种异体移植免疫反应中所起的作用越来越感兴趣，最初是因为需要重新探索抗体不相容移植的可行性。
[0270]
根据另一实施方式，本发明的抗体和抗体部分可用于抑制移植排斥反应(包括同种异体移植物和异种移植物的排斥反应)，以及抑制移植物抗宿主病(ghvd)。根据另一实施方式，抗体用于治疗急性细胞排斥或急性和慢性抗体介导的排斥。
[0271]
尽管抗体或抗体部分可单独使用，但更优选与抑制针对同种异体移植物的免疫应答或抑制gvhd的一种或多种其它药剂组合使用。例如，在一个实施方式中，本发明的抗体或抗体部分与okt3结合使用以抑制okt3诱导反应。在另一实施方式中，本发明的抗体或抗体部分与针对参与调节免疫应答的其他靶点的一种或多种抗体组合使用，所述一种或多种抗体例如细胞表面分子cd25(白介素
‑
2受体
‑
α)、cd11a(lfa
‑
1)、cd54(icam
‑
1)、cd4、cd45、cd28/ctla4、cd80(b7
‑
1)和/或cd86(b7
‑
2)。在又一实施方式中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种通用免疫抑制剂(例如环孢菌素a或fk506)组合使用。
[0272]
c.恶性肿瘤
[0273]
另一实施方式提供了用于治疗与cd22抗原过度表达相关的恶性肿瘤的抗体和抗体部分。与cd22抗原过度表达相关的恶性肿瘤包括但不限于b细胞淋巴瘤，例如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤。抗体或抗体部分可全身性地或局部地施用到肿瘤部位。
[0274]
以下实施例进一步说明了本发明，这些实施例不应被解释为限制性的。本申请通篇中引用的所有参考文件、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本申请。
[0275]
实施例1
[0276]
抗cd22抗体与cd22及替代抗原/抗独特型抗体结合的动力学分析
[0277]
根据标准程序，使用biacore(ge healthcare life sciences,piscataway,nj)检测抗cd22抗体对人cd22的亲和力。简单地说，将人重组cd22(20μg/ml，peprotech，rocky hill，nj)固定在羧甲基葡聚糖涂层的cm5传感器芯片上。首先用n
‑
乙基
‑
n
’‑
(3
‑
二乙氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)对芯片表面进行活化。以20μl/min的流速注入不同浓度的抗cd22抗体，在此情况下为在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的sm03(1.0625
‑
34nmol/ml)，持续3分钟。然后用1m乙醇胺(ph 8.5)阻断残余的羧基。用流动缓冲液洗涤3min以研究解离。随后通过注入50mm甘氨酸
‑
cl溶液并持续60s来再生芯片表面。使用bia评估软件估算动力学常数，包括ka(缔合速率常数)和kd(解离速率常数)等。通过减去对照曲线来对特异性结合曲线进行归一化。
[0278]
图1显示了与固定化重组人cd22抗原结合的抗cd22抗体sm03的动力学分析。叠加图显示了6种不同浓度的抗cd22抗体(sm03)与人cd22抗原结合的传感器图。结合反应在响应单元(ru)中显示。不同浓度的sm03(从上到下：最低浓度到最高浓度)与cd22结合的结果如图1所示。获得的亲和力参数为：ka＝1.13
×
107ru/s；kd＝0.0137ru/s；kd＝1.22
×
10
‑9m；ka＝0.82
×
109m
‑1。
[0279]
初步表位定位分析表明，用于抗cd22抗体sm03和sm06的表位存在于人cd22抗原的胞外结构域2
‑
4(seq id no:011)中。因此，根据分子生物学和细菌表达的标准程序，构建了包含这些结构域的重组人cd22(cd22d2
‑
4)并在细菌中表达为包涵体。重新折叠的包涵体被用作天然抗原的来源，其过程先前已被描述(zhang等人，2010.quantification of anti
‑
cd22 monoclonal antibody concentration by enzyme
‑
immunoassay.chinese j new drugs 2010；19:253
‑
7)。作为评估抗cd22抗体活性的替代抗原的替代性来源，利用噬菌体
展示文库开发了结合sm03和sm06抗原结合位点(abs)的抗独特型抗体(lrid)(zhao等人，2014.generation of anti
‑
idiotype scfvfor pharmacokinetic measurement in lymphoma patients treated with chimera anti
‑
cd22 antibody sm03.plos one 9(5)：e96697)。这些抗体也在以下中描述：中国专利zl201210286457.4和美国专利7,338,659b2(以上专利通过全文引用的方式并入本文)。简言之，使用本领域技术人员已知的技术从用sm03免疫的小鼠的噬菌体展示文库中获得对sm03和sm06的抗原结合位点有特异性的单链fv(scfv)。利用分子生物学中的标准技术，将所选择的单链抗体重组为小鼠igg抗体(lrid)。用lrid鼠源抗体作为cd22的替代抗原。为对重组cd22和替代抗原进行直接结合研究，在涂有5
‑
10μg/ml人cd22d2
‑
4或lrid的elisa板孔中加入浓度增加的sm03或sm06，并且在加入tmb底物(life technologies，carlsbad，ca)和停止溶液(h2so4)之后显示这些抗体在od
450
下与hrp轭合的山羊抗人fc特异性抗体的结合程度(jackson immunoresearch，west grove，pa)。图2显示了针对以下的抗cd22抗体(sm03和sm06)的elisa结合研究：(a)重组人cd22抗原结构域2
‑
4(cd22d2
‑
4)(seq id no：011)，和(b)对sm03的抗原结合位点(abs)有特异性的抗独特型抗体(lrid)。与cd22d2
‑
4或lrid结合的sm03和sm06的典型剂量反应曲线如图2所示。它们各自的ec
50
总结在表1中。
[0280]
表1针对cd22结构域2
‑
4(cd22d2
‑
4)和用于sm03的抗独特型抗体(lrid)的抗cd22抗体的ec
50
[0281]
ec
50
(μg/ml)sm03sm06cd22d2
‑
40.100
±
0.0930.140
±
0.102lrid0.080
±
0.0280.065
±
0.028
[0282]
实施例2
[0283]
针对替代靶细胞系的抗cd22抗体的功能活性，其中该替代靶细胞系在细胞表面上表达对抗cd22抗体有特异性的结合部分
[0284]
图3显示，用表达载体转染的小鼠骨髓瘤sp2/0细胞证明了高水平的lrid fab表面表达(图3a)，其中该表达载体编码针对sm03的抗独特型抗体的fab片段(lrid fab)，该fab片段融合到糖蛋白a的跨膜部分(fab
‑
glycoa)或来自衰变加速因子(daf)蛋白的糖磷脂酰肌醇(gpi)信号序列，并且这些细胞可用作用于通过抗cd22抗体sm03和sm06来诱导cmc抑制的替代靶细胞。图3b示出了针对fab
‑
glycoa和fab
‑
gpi替代靶细胞的示例性的sm03诱导的cmc杀伤。将表达内源性igβ的sp2/0鼠骨髓瘤细胞用含有lrid
‑
fab编码序列的载体转染，该lrid fab融合到糖蛋白a的跨膜部分或来自衰变加速因子(daf)蛋白的糖磷脂酰肌醇(gpi)信号序列。使用在其表面表达lrid fab(sm03和sm06结合部分)的细胞系作为替代靶细胞来评估抗cd22抗体(sm03和sm06)的功能活性。细胞系的构建及其用途已在之前进行了描述(leung等人(2015)mabs7(1)：66
‑
76；以及中国专利zl201210286457.4和美国专利7,338,659b2(以上专利通过引用以其整体并入本文)。在流式细胞术研究中，用lrid fab
’‑
糖蛋白a(fab
‑
glycoa)或lrid fab
’‑
daf(fab
‑
gpi)融合蛋白构建体转染的细胞显示出强烈的表面表达，表现为sm03的剂量依赖性结合(图3a)。
[0285]
抗cd22抗体可诱导针对fab
‑
glycoa和fab
‑
gpi细胞的cmc杀伤(图3b)；sm03和sm06表现出相似的cmc杀伤(数据未显示)。替代靶细胞可用于评估抗cd22抗体的fc功能。图4(a)和4(b)显示了经png酶去糖基化的sm03被证明在诱导(4a)cmc活性和(4b)针对替代靶细胞
fab
‑
gpi的adcc活性方面丧失了生物学功能。当抗cd22抗体(sm03)去糖基化时，该去糖基化的抗体无法诱导针对这些细胞的cmc(图4a)或adcc(图4b)，表明fab
‑
glycoa或fab
‑
gpi细胞可以用作用于评估抗cd22抗体的fc效应子功能的替代靶细胞。观察到显著的剂量依赖性cmc活性，最大杀灭率超过90％，ec
50
分别为0.13和0.22mg/ml(图3b)。
[0286]
实施例3
[0287]
抗cd22抗体的特异性结合表位定位
[0288]
通过在细菌中表达包含人cd22序列的不同胞外结构域组合来进行初步表位定位，并在elisa试验中检测重新折叠的重组蛋白与sm03的结合。只有包含结构域2
‑
4(cd22d2
‑
4)(seq id no：011)的重新折叠和纯化的人cd22显示有结合。通过还原sds
‑
page分析重组蛋白cd22d2
‑
4(图5a)，涂有cd22d2
‑
4的elisa平板显示与抗cd22抗体sm03的剂量反应结合(图5b)，表明表位位于人cd22蛋白的结构域2
‑
4区内。人cd22抗原有6个胞外结构域在成熟b细胞表面表达。通过表达人cd22的不同细胞外部分进行的初步定位研究表明，sm03在包含结构域2
‑
4(cd22d2
‑
4)的区域与人cd22的细胞外部分结合(图5)。简言之，编码人cd22的不同结构域区的dna序列被克隆到pet细菌表达载体中，其位于pelb序列之后(如ward等人(1989)nature341:544
‑
546所述)。使用分子生物学中的标准技术，将表达载体用于转化细菌宿主细胞bl21(de3)plyss(promega，madison，wi)，：通过添加1mm异丙基β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(iptg)诱导转染基因的表达。在37℃下以250rpm轨道振荡孵育4小时后，以6000rpm离心15分钟将细菌粒化。借助玻璃均质器，将细胞在裂解缓冲液(50mm tris
‑
hcl，ph 8，含0.1mm nacl、5mm edta、0.1％nan3、0.5％tritonx
‑
100、100μm pmsf和1mm dtt)裂解。在弗氏(french)压碎处理后，加入2.5mm mgcl2以螯合edta，加入0.1mg/ml溶菌酶和0.01mg/ml dna酶，混合物在室温下培养20分钟。将包涵体以6000rpm离心15分钟粒化，并洗涤三次。将粒化的包涵体溶于6m盐酸胍中。使用his标签将cd22d2
‑
4工程改造，根据制造商的说明书，使用负载ni
‑
sepharose6快速流动树脂(ge healthcare，chicargo，il)的金属螯合亲和层析对蛋白质进行重新折叠和纯化。在sds
‑
page下分析重新折叠的cd22d2
‑
4(图5a)，并证实其显示与sm03结合的剂量反应(图5b)。
[0289]
随后使用pepscan技术(pepscan，netherland)在人cd22的结构域2
‑
4(seq id no:011)内进行详细的表位定位。首先定位线性表位。简单地说，为重新构建人cd22的线性表位，利用固相fmoc合成了肽基表位模拟物文库。氨基官能化聚丙烯载体是通过以下方式获得的：用专有的亲水性聚合物配方(pepscan,netherland)接枝，然后使用二环己基碳二亚胺(dcc)和n
‑
羟基苯并三唑(hobt)与叔丁氧基羰基己二胺(bochmda)反应，随后使用三氟乙酸(tfa)裂解boc基团。采用标准fmoc肽合成方法，通过定制的改良janus液体处理站(perkin elmer，waltham，ma)在氨基功能化固体载体上合成肽。可通过自动elisa型读出对抗cd22抗体(例如sm03和sm06)与固体载体上重叠合成肽文库的结合进行定量。简单地说，肽阵列与抗cd22抗体如sm03或sm06溶液一起孵育(在4℃下过夜)。洗涤后，肽阵列与1/1000稀释的山羊抗人过氧化物酶(hrp)轭合物(southern biotech，birmingham，al)一起在25℃孵育1小时。洗涤后，添加过氧化物酶底物2.2
’‑
叠氮基
‑
二
‑3‑
乙基苯并噻唑啉磺酸盐(abts)和20μg/ml 3％h2o2。1小时后，测量显色情况。用电荷耦合器件(ccd)
‑
摄像机和图像处理系统对显色进行定量。使用盒须图(tukey 1977)、线性强度分布图和热图(一种数据的图形表示法，其中二维图中的变量值表示为数据可视化的颜色)对数据进行分析。在不同的
严格性条件下，筛选抗cd22抗体(sm03或sm06)没有产生可检测的结合(数据未显示)。结果表明，要么是抗cd22抗体不与人cd22结构域2
‑
4结合，要么是抗cd22抗体仅与不连续的构象表位结合。
[0290]
然后利用clips技术(pepscan，netherland)来阐明人cd22抗体上被抗cd22抗体(sm03或sm06)识别的可能的构象的或不连续的表位。clips技术将多肽结构固定到特定的3d结构中。clips反应发生在clips支架的溴基和被引入模拟构象的和不连续的结合位点的一系列肽结构中的半胱氨酸的巯基侧链之间。clips肽库可以模拟二级结构元素，如环、α螺旋和β链。基于人cd22序列(seq id no：011)的肽在微型卡(minicard)上合成，并化学转化为空间限定的clips构建体(pepscan,netherland)。使用自动elisa型读出以对这些构象文库上的抗cd22抗体的结合进行定量。仅有包含正确构象的正确氨基酸序列的构建体能最佳地结合抗cd22抗体。clips库包含多达10000个重叠的肽构建体，它们展示正确构象的不连续表位的两部分；呈现不完整表位的构建体将以较低的亲和力结合抗cd22抗体，而不包含表位的构建体将根本不结合。
[0291]
利用pepscan的支架上的化学连接肽(clips)技术(pepscan,netherland)合成结构模拟物，将肽结构化为单环、双环、三环、片状折叠、螺旋状折叠及其组合。clips模板与半胱氨酸残基偶联。多肽中多个半胱氨酸的侧链与一个或两个clips模板偶联。例如，将0.5mm p2 clips(2,6
‑
双(溴甲基)吡啶)溶液溶解于碳酸氢铵(20mm，ph 7.8)/乙腈(1∶3(v/v))中。将该溶液添加到肽阵列上。clips模板将结合两个半胱氨酸的侧链，如肽阵列(带有3μl孔的455孔板)的固相结合肽中所存在的。将肽阵列在溶液中轻轻摇动30至60分钟，同时完全覆盖在溶液中。最后，用过量h2o彻底洗涤肽阵列，并在含有1％sds/0.1％2,2
’‑
(亚乙基二氧基)二乙硫醇/pbs(ph 7.2)的中断缓冲液中于70℃超声30分钟，然后在h2o中再超声45分钟。
[0292]
图6(b)显示了使用坐标文件5vkj识别的不连续表位的透视图。肽链
161
cllnfscygypiq
173
以红色突出显示，肽链
198
vftrselkfsqwshhgkivtc
219
以蓝色突出显示。使用如前所述的方法，通过自动elisa型读出，对clips文库中与抗cd22抗体(sm03和sm06)的结合进行定量。使用来自pepsican(荷兰)的clip技术定位抗cd22抗体的结构域2
‑
4内的精确的cd22表位。发现抗体(sm03和sm06)与人cd22抗原的结构域2内的不连续构象表位结合，该不连续构象表位包含序列
161
cllnfscygypiq
173
和
198
vftrselkfsqwshhgkivtc
219
。(图6a)所示为在具有二硫键模拟物的严格条件下记录抗cd22抗体sm03的强度曲线。高信号用红色表示，背景信号用黑色表示。根据uniprot，每个正方形代表两个肽序列的特定组合，其包含一对形成二硫键的cys。空白表示在人cd22的天然状态下不形成二硫键的cys配对；用组合表位模拟物(不连续和二硫键模拟物)记录的强度曲线表明，抗cd22抗体(sm03或sm06)识别由肽链
161
cllnfscygypiq
173
和
198
vftrselkfspqwshhgkivtc
219
组成的不连续表位(图6a)。图6b中显示了人cd22结构域2
‑
4的示意图，其中肽链
161
cllnfscygypiq
173
以红色突出显示，肽链
198
vftrselkfsqwshhgkivtc
219
以蓝色突出显示。
[0293]
实施例4a：
[0294]
抗cd22抗体的破坏性结合
[0295]
人cd22细胞外结构域(结构域1
‑
7：cd22d1
‑
7)在基因上融合到糖蛋白a跨膜区和胞质区(cd22d1
‑
7glyco)(seq id no：14)和/或从延迟加速因子(daf)蛋白分离的糖磷脂酰肌
醇信号序列(cd22d1
‑
7gpi)(seq id no:15)。融合结构域和序列的方法如先前所述(leung等人，2015。surrogate target cells expressing surface anti
‑
idiotype antibody for the clinical evaluation of an internalizing cd22
‑
specific antibody.mabs 7:66
‑
76)。编码融合蛋白的cdna经基因合成(genescript，piscataway，nj)，并使用先前描述的方法克隆到扩增表达载体中(leung等人，2015.mabs 7:66
‑
76)。
[0296]
该表达载体可用于转染多种哺乳动物宿主细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(cho)细胞、鼠骨髓瘤sp2/0或ns0、幼仓鼠肾(bhk)细胞、人胚肾293(hek 293)细胞、非洲绿猴肾cos细胞系等。具体来说，按照标准程序用电穿孔法将表达载体转染sp2/0细胞和dg44
‑
cho细胞(悬浮型)。使用sm03为探针，采用基于细胞的酶联免疫吸附试验(elisa)，然后采用验证性流式细胞术来检测甲氨蝶呤(mtx)选择后存活的克隆对人cd22表面表达的影响。简言之，向1x106转染细胞(用pbs洗涤3次)中加入50ml 10mg/ml的sm03。将混合物在4℃下孵育1小时，并用pbs洗涤3次。将1∶1000稀释的50ml hrp轭合的山羊抗人fc特异性抗体(jackson immunoresearch)加入细胞中，并于4℃孵育1小时。用pbs洗涤细胞一次，通过加入50ml tmb溶液(invitrogen)揭示存在人cd22的表面表达。在室温孵育10分钟后，通过添加50ml 0.18m h2so4停止反应。将细胞混合并离心，收集上清液，用elisa酶标仪(sunrise)在od
450 nm处进行评估。
[0297]
将显示最高水平elisa读数的细胞克隆进行扩增，以便使用流式细胞术研究进行进一步分析：sm03用作一抗，fitc轭合的山羊抗人fc特异性抗体用作检测抗体(二抗)。简言之，将5x105转染细胞与1mg sm03在100ml最终体积的pbd中培养，该pbd中补充以1％fcs和0.01％(w/v)叠氮化钠(pbs
‑
fa)。将混合物在4℃下孵育30分钟，并用pbs洗涤三次以去除未结合的抗体。通过在pbs
‑
fa中添加最终体积为100ml的20倍稀释的fitc标记的山羊抗人igg1(fc片段特异性抗体(jackson immunoresearch))并在4℃孵育30分钟来评估sm03与转染细胞的结合水平。用pbs将混合物洗涤三次，并用facscan分析(becton
‑
dickinson)测量荧光强度。显示最高水平荧光强度的细胞克隆进行扩增以供进一步测试。
[0298]
实施例4b：
[0299]
用于鉴定具有最佳生物活性的抗cd22抗体和评估这些抗体的生物活性的基于细胞的生物测定法的确立
[0300]
cho和cos细胞都表达低水平(如果有的话)的st6gali(galb1
‑
4glcnac
‑
特异性a2
‑6‑
唾液酸转移酶)，并且cho细胞中转染的cd22被证明缺乏形成cd22
‑
cd22顺式配体结合所需的a2
‑6‑
连接的唾液酸(sia)残基。表达cd22d1
‑
7与糖蛋白a的跨膜和胞质部分的融合体(cd22d1
‑
7glyco)的cho细胞的表面cd22(cho
‑
cd22)不与其配体顺式结合，并且不会内化(因为cd22d1
‑
7缺少启动内吞作用所需的胞质部分)。换句话说，cho表达的cd22d1
‑
7的配体结合位点可与外源性配体自由结合，而cd22d1
‑
7glyco或cd22d1
‑7‑
gpi转染的sp2/0细胞(sp2/0
‑
cd22)中的st6gali将允许2,6sia形成和cd22d1
‑
7的顺式同源多聚体结合，从而限制了自由配体结合位点的可用性。
[0301]
用a2
‑6‑
唾液酸乳糖(6’ppa
‑
b或称为“探针”)取代的生物素轭合的聚丙烯酰胺从glycotech(rockville，md)获得，并用作评价cho
‑
cd22和sp2/0
‑
cd22中用于反式连接的可用cd22配体结合位点的变化的外源探针。该探针是用siaa2
‑
6galb1
‑
4glcb1(6’paa
‑
b)的多个拷贝取代的生物素化聚丙烯酰胺的市售合成轭合物。简单地说，用含有0.02％叠氮化钠
和1％bsa(染色缓冲液)的冰冷pbs洗涤三次的细胞(0.2
‑
1x106)，在100ml相同缓冲液中，在存在或不存在0.1mg的不同抗cd22抗体和含有1
‑
1.5mg 6’paa
‑
b探针的情况下，在冰上孵育1h。在用0.5ml染色缓冲液洗涤一次后，将细胞与pe轭合的链霉亲和素孵育30分钟，以检测生物素化探针在细胞表面的结合。
[0302]
由于在cho内缺乏st6gal i酶，表达融合到糖蛋白a的跨膜和胞质部分的人cd22胞外结构域的cho细胞(cho
‑
cd22)将不具有2,6sia聚糖结构。在流式细胞术研究中，虽然6’paa
‑
b没有显示任何与未转染cho的结合，但探针有效地结合到表达表面cd22的cho细胞(cho
‑
cd22)(图7a)，并且这种结合不受sm03存在的影响，表明抗cd22抗体不阻断cd22的配体结合位点。图7a显示了cho上的人cd22的胞外结构域与具有多个2,6sia结构的探针(用a2
‑6‑
唾液酸乳糖取代的生物素轭合的聚丙烯酰胺)(6’paa
‑
b)(cho
‑
cd22 探针)结合，在1mg/ml sm03的存在下(sm03 cho
‑
cd22 探针)与探针的结合程度不受影响。然而，6’paa
‑
b探针与表达表面cd22的鼠sp2/0细胞(sp2/0
‑
cd22)的结合仅略好于探针与未转染的sp2/0的结合；当用1mg/ml sm03预处理sp2/0
‑
cd22时，观察到与经处理的cd22
‑
sp2/0的结合显著增加(图7b)，表明sm03在位于cd22的结构域2处的包含肽链
161
cllnfscygypiq
173
和
198
vftrselkfsqwshhgkivtc
219
的不连续表位上的结合有效地打破了cd22的顺式连接同源多聚体结构，并使cd22的自由配体结合位点可用于反式结合。图7b显示了融合到在sp2/0细胞(sp2/0
‑
cd22)上表达的糖蛋白a的跨膜和胞质部分的人cd22的胞外结构域包含2,6sia聚糖，并且主要作为同源多聚体顺式连接，并且不显著地结合到6’paa
‑
b探针(sp2/0
‑
cd22 探针)。sp2/0
‑
cd22与1mg/ml的sm03一起孵育可有效破坏人cd22顺式结合，并使游离的cd22配体结合位点反式连接到6’paa
‑
b探针(sm03 sp2/0
‑
cd22 探针)。图8示出了在存在和不存在不同抗cd22抗体的情况下cd22与其配体顺式和反式相互作用的不同场景的示意图。图8a显示，在人cd22与2,6sia反式结合时，bcr与自身抗原接合引起的免疫活化将受到负调节，从而导致对自身抗原的耐受。图8b显示，在人cd22与2,6sia顺式结合时，经由bcr与自身抗原接合所致的免疫刺激将不受调节，导致针对自身抗原的自身免疫。图8c显示，在抗cd22抗体以足够高的亲和力结合到充分靠近n
‑
末端结构域的人cd22的适当结构域的适当表位时，人cd22抗原将被空间隔开，破坏顺式结合构型；释放的人cd22结合位点将可用于反式结合另一个细胞上的2,6sia配体，减轻对通过bcr识别的自身抗原的免疫反应。图8d显示了当抗cd22抗体在远离n末端结构域处，或在无效表位，或亲和力不足的情况下结合人cd22结构域时，人cd22顺式连接将不会被充分地破坏，使特定的抗cd22在调节自身免疫方面效果较差。
[0303]
实施例5
[0304]
burkitt淋巴瘤细胞中sm03对cd22的结合导致内化
[0305]
如通过将5x106/ml用最终浓度为1mg/ml的sm03在冰上孵育之后的相差荧光显微镜所揭示的那样(图9a)，人cd22抗原在人burkitt淋巴瘤细胞系daud和raji的表面上高度表达。采用共焦荧光显微镜监测结合sm03在raji细胞上的分布，根据pirker的方法做轻微修改(pirker等人，1987.characterization of immunotoxin active against ovarian cancer cell line.j.clin.invest.76:1261
‑
1267)。简言之，将100ml在rpmi1640(invitrogen,gaithersburg,md)中的浓度为5x106/ml的raji细胞与100ml浓度为40mg/ml的sm03混合，分别在37℃下培养0分钟、10分钟和20分钟。用含有1％fbs的pbs洗涤细胞三次，并在4℃下用3.7％甲醛固定15分钟。在共聚焦显微镜下，fitc轭合的山羊抗人fc特异性
抗体揭示了raji细胞上和细胞内(内化)的sm03的分布(图9b)。如共聚焦荧光显微镜所揭示的，表面结合的sm03内化到淋巴瘤细胞系的细胞内室(图9b)。在10分钟时，超过50％的表面结合sm03被内化，在20分钟时，被内化的sm03似乎再循环到细胞表面，因为与10分钟时间点相比，表面强度有所增加(图9b)。
[0306]
实施例6
[0307]
用抗cd22抗体治疗
[0308]
静脉内施用之后的sm03疗效
[0309]
在这项开放标签研究中，8名活动期类风湿性关节炎患者在第0天和第15天接受了sm03的两次注射，每个剂量为600mg(大致相当于360mg/m2)，此外，他们还在继续接受(甲氨蝶呤)mtx治疗。参与本研究的患者平均病程为5.8年，病症活动评分(das28)为5.78，反映出相当高的病症活动性。
[0310]
在8名接受sm03治疗的患者中，有4名患者在12周内达到了基于das28的eular反应和acr20，最早的反应出现在第4周；其中一名患者达到了acr70(见下表2)。
[0311]
表2在开放标签i期研究中，两次注射sm03(600mg)后acr应答者的百分比
[0312]
acr第4周第8周第12周acr202(25％)3(37.5％)4(50％)acr50001(12.5％)acr70001(12.5％)
[0313]
在第28天，两名应答者开始观察到acr改善，其余应答者分别在第56天和第84天之后实现acr应答。与其他靶向tnfα的抗体不同，那些抗体早在抗体施用后的首周就能显示acr应答，这表明针对ra的抗cd22应答可能是延迟作用的。
[0314]
与acr评分一致，入选患者的das28评分随时间呈下降趋势，尽管缓慢，但在sm03给药后第84天，das28评分达到最低值(下降约0.6)。8例患者中有4例在第84天达到das
‑
eular反应，其中1例被认为是良好的eular反应。对于平均基线值超过5.1的高活动性ra患者，观察到的das28评分变化并不反映对sm03治疗的反应。
[0315]
如果个别患者的das28评分降低超过0.6
‑
1.2被视为反映了“中度反应”，则两名接受sm03治疗的患者可被视为达到中度反应。尽管另外两名患者在第28天和第56天的das28降低了1.2以上，但在随后的随访中，得分回升。无论如何，结果表明两次静脉注射600mg sm03对治疗ra有效，具有良好的安全性和耐受性。
[0316]
实施例7
[0317]
静脉内注射抗cd22抗体的全身剂量
[0318]
在两个周期中每两周一次静脉内注射sm03
[0319]
通过两个周期内每两周一次静脉内(i.v.)注射两次累积剂量水平的安慰剂或sm03(各自注射两次或三次)并持续进行mtx治疗，研究对mtx反应不足的ra患者的临床疗效、安全性、免疫原性和耐受性。
[0320]
对甲氨蝶呤反应或耐受性不足的类风湿性关节炎患者进行了安慰剂对照、双盲、随机、多中心研究。在试验过程中，患者继续服用稳定剂量的甲氨蝶呤，剂量范围见下文所述纳入标准。
[0321]
研究包括两部分：1)第一次用药之前的四周“清洗期”，在此期间停用dmard(甲氨
蝶呤除外)；和2)“安慰剂对照期”，在此期间，患者被随机分为三组，每组52名患者，其中的一组接受安慰剂，或在两个周期内接受2x600mg sm03，或在两个周期内每隔一周给予3x600mg sm03，第一个周期从第0周开始，第二个周期从第12周开始。
[0322]
在研究的第0周(服用sm03前)、第2周、第4周、第8周、第12周、第16周和第24周对患者进行了连续检查，联合检查由盲法医生(研究者)进行。
[0323]
本研究纳入了156例ra患者。研究人群代表了中国北部、西南部和东部的中度至重度ra人群：约86％为女性，年龄主要在44岁以上。使用预定的纳入和排除标准(本领域技术人员已知)选择人群，例如，患者必须接受了1987年修订的美国风湿病学会(acr)标准定义的ra诊断(见附录a：arnett f.c.等人(1988)the american rheumatism association 1987revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.arthritis rheum.31：314
‑
324)。
[0324]
结果：
[0325]
图8
‑
11表明，在两个周期内每两周一次静脉内注射sm03治疗，进行两次每两周一次施用或三次每两周一次施用，当与甲氨蝶呤联合使用时，在24周时减少ra的体征和症状方面明显优于安慰剂(图11(b))。有趣的是，即使是在第12周，当使用acr20反应进行评估时，sm03的所有给药方案都明显比按照治疗组相同给药方案给予的安慰剂更有效(图11(a))。此外，当使用不同的疗效变量进行评估时，如使用关节压痛和肿胀计数(图13(a)和13(b))或健康评估问卷残疾指数(haq
‑
di)(图14)进行评估时，三次每两周一次施用600mg sm03的治疗周期比两次每两周一次施用600mg sm03的治疗周期有更好的疗效。
[0326]
具体来说，在第24周，用2x600mg sm03治疗的约57％的患者和用3x600mg sm03治疗的65％的患者达到acr20，而安慰剂组只有34％达到acr20；此外，分别用2x600mg和3x600mg sm03治疗的约30％和45％的患者达到acr50(相比之下安慰剂组有17％的患者有acr50应答)；并且分别用2x600mg和3x600mg sm03治疗的约10％和18.4％的患者达到acr70(相比之下安慰剂组有4％的患者有acr70应答)。
[0327]
实施例8:
[0328]
抗cd22抗体的安全性曲线
[0329]
表3：安全性曲线：sm03对比利妥昔单抗对比英利昔单抗
[0330][0331]
*利妥昔单抗临床总结报告，方案编号：wa17045,01/08/2012
[0332]
**remsima评估报告。关键三期研究ct
‑
13 3.1.ema/chmp/589317/2013表3显示了在实施例7中进行的试验中sm03的安全性数据，特别是与其他抗tnfα抗体和抗cd20抗体相比，严重感染的不良事件发生率。
[0333]
其显示，sm03的不良反应明显低于利妥昔单抗或英夫利昔单抗，因为sm03结合促进顺式构型向反式构型的转化不会干扰b细胞对细菌和病毒等传染源的正常免疫调节功能(因为它们不具备与cd22结合所需的2,6唾液酸配体，即使在反式构型中也是如此)。相反，抗cd20抗体通过完全切断循环b细胞来抑制对自身细胞的免疫反应。这将导致b细胞免疫调节功能的丧失，并且可能是用抗cd20的利妥昔单抗治疗导致不良事件，特别是机会性感染的发生率高的主要原因(表3)。
[0334]
同样，tnfα的中和作用也消除了tnfα的正常抗感染功能，其证据是不良事件，尤其是在用抗tnfα抗体英利昔单抗治疗的患者的严重感染的高发生率(表3)。
[0335]
等效范围：
[0336]
本领域技术人员将认识到，或者能够使用超出常规的实验来确定与本文所描述的本发明的具体实施方式的许多等效物。这些等价物旨在被包含在所附权利要求中。
[0337]
本文中引用的所有专利、专利申请和公开通过引用以其整体并入本文。
[0338]
尽管已参考其具体实施方式详细描述了本发明，应理解前述说明在本质上是示例性和解释性的，旨在举例说明本发明及其优选实施方式。通过常规试验，本领域技术人员将容易地意识到，可在本文中做出许多变化和修改而不会背离本发明的精神和范围。因此，本发明不由以上说明书定义，而是由所附权利要求及其等效范围来定义。

技术特征：
1.一种在有需要的受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的抗cd22抗体，其中(a)所述抗cd22抗体在至少两个周期中施用；(b)每个周期包括两个或更多个剂量；并且(c)每个剂量每隔两周施用一次。2.如权利要求1所述的方法，其中每个周期为6
‑
12周长并且包括两个或三个剂量。3.如权利要求2所述的方法，其中每个周期为12周长。4.如权利要求3所述的方法，其中每个周期的第一个剂量在所述周期的第0日施用。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中每个剂量为约500mg
‑
750mg。6.如权利要求5所述的方法，其中每个剂量为600mg。7.如权利要求6所述的方法，其中每个周期包括至少两个剂量，每个剂量为600mg，总计1200mg，在4周内施用。8.如权利要求6所述的方法，其中每个周期包括至少三个剂量，每个剂量为600mg，总计1800mg，在6周内施用。9.如权利要求1所述的方法，其中所述抗cd22抗体经静脉内或经皮下施用。10.如权利要求1所述的方法，其中每隔两周为每9
‑
19天、每11
‑
17天、每13
‑
15天或每14天。11.如权利要求10所述的方法，其中每隔两周为每14天。12.如权利要求1所述的方法，其中每个周期的时间长度相同，并且每个周期施用相同量的抗cd22抗体。13.如权利要求12所述的方法，其中所述抗cd22抗体在两个周期中施用，其中每个周期长12周，并且每个周期施用的抗cd22抗体的量为1200mg或1800mg。14.如权利要求13所述的方法，其中每个周期施用的抗cd22抗体的量为两个或三个剂量。15.如权利要求14所述的方法，其中第一周期在第0周开始，第二周期在第12周开始。16.如权利要求1所述的方法，其中所述抗cd22抗体结合cd22抗原的表位的两个不连续序列，所述两个不连续序列位于所述cd22抗原的结构域2中。17.如权利要求16所述的方法，其中所述两个不连续序列包括cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。18.如权利要求1所述的方法，其中所述抗cd22抗体包括igg重链的恒定区和κ轻链的恒定区。19.如权利要求1所述的方法，其中所述抗cd22抗体结合抗独特型抗体的独特位，所述抗独特型抗体具有包含seq id no:012的氨基酸序列的轻链可变区和包含seq id no:013的氨基酸序列的重链可变区。20.如权利要求1所述的方法，其中所述抗cd22抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:002的氨基酸序列，seq id no:003的氨基酸序列和seq id no:004的氨基酸序列；并且其中所述抗cd22抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:006的氨基酸序列、seq id no:007的氨基酸序列和seq id no:008的氨基酸序列。21.如权利要求1所述的方法，其中所述抗cd22抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区
包含seq id no:001的氨基酸序列，并且其中所述抗cd22抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:005的氨基酸序列。22.如权利要求1所述的方法，其中所述抗cd22抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:009的氨基酸序列，并且其中所述抗cd22抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:010的氨基酸序列。23.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。24.如权利要求1所述的方法，其中所述人抗cd22抗体选自由以下组成的组：sm03、sm06及其组合。25.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有类风湿性关节炎，但对甲氨蝶呤的应答或耐受性不足。26.如权利要求1
‑
25中任一项所述的方法，还包括施用用于治疗类风湿性关节炎的其他治疗剂。27.一种在有需要的受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的抗cd22抗体。28.如权利要求27所述的方法，其中所述有效量为约1200mg
‑
1800mg。29.如权利要求27所述的方法，其中所述抗cd22抗体经静脉内或经皮下施用给所述受试者。30.如权利要求27所述的方法，其中所述抗cd22抗体结合cd22抗原的表位的两个不连续序列，所述两个不连续序列位于所述cd22抗原的结构域2中。31.如权利要求30所述的方法，其中所述两个不连续序列包括cllnfscygypiq和vftrselkfspqwshhgkivtc。32.如权利要求27所述的方法，其中所述抗cd22抗体选自由以下组成的组：sm03、sm06及其组合。33.如权利要求27
‑
32中任一项所述的方法，还包括施用用于治疗类风湿性关节炎的其他治疗剂。34.如权利要求33所述的方法，其中所述其他治疗剂选自免疫系统抑制剂、针对免疫细胞抗原的药剂、抗炎剂、类固醇或激酶抑制剂。35.如权利要求34所述的方法，其中所述免疫系统抑制剂选自甲氨蝶呤；所述抗炎剂选自抗tnf剂，抗il17剂，抗il1、抗il12、抗il23或抗il6剂；所述激酶抑制剂选自抑制jak、btk的药剂，所述针对免疫细胞抗原的药剂是抗cd20抗体、抗blys抗体、抗april抗体、抗cd40l(cd154)、抗gmcsf或抗gmcsf受体。36.如权利要求35所述的方法，其中所述病症选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(ra)、类风湿性脊椎炎、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、自身免疫糖尿病、舍格伦(sjogren’s)综合征或舍格伦(sjogren’s)病、牛皮癣、炎性肠病、格雷夫斯病、1型糖尿病、乳糜泻、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、自身免疫性葡萄膜炎、肾病综合征、寻常型天胞疮、阿尔茨海默病、白塞病(bd)和b细胞性恶性肿瘤。37.一种用于治疗类风湿性关节炎的试剂盒，包括：包含治疗有效量的抗cd22抗体的药物组合物和多个使用说明，所述使用说明陈述了(a)所述抗cd22抗体在至少两个周期中施用；
(b)每个周期包括两个或更多个剂量；并且(c)每个剂量每隔两周施用一次。38.一种预装填注射器，包含治疗有效量的抗cd22抗体。
技术总结
本发明描述了在有需要的受试者中治疗类风湿性关节炎的方法。该方法包括对受试者施用治疗有效量的抗CD22抗体，其中所述抗CD22抗体在至少两个周期中施用；每个周期包含两次或更多次给药；并且每个剂量每两周施用一次。本文中还公开了包含药物组合物和给药说明的试剂盒以及包含药物组合物的预装填注射器。盒以及包含药物组合物的预装填注射器。


技术研发人员：梁瑞安
受保护的技术使用者：中国抗体制药有限公司
技术研发日：2019.10.18
技术公布日：2021/6/25