一种基于LFD-RMA法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组的制作方法

一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组
技术领域
1.本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组。


背景技术：

2.人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,hiv)又称艾滋病病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种逆转录病毒，属逆转录病科慢病毒亚科，有包膜，核心为两条正链rna并与衣壳蛋白结合成双体结构。这一病毒会攻击并逐渐破坏人类的免疫系统，从而引起严重随机感染或继发肿瘤并致命，而艾滋病(获得性免疫缺陷综合征，aids)是人类免疫缺陷病毒感染的最后阶段。hiv根据基因结构、免疫学和流行病学的特征可分为hiv
‑
1和hiv
‑
2两种类型，目前世界范围的aids主要有hiv
‑
1所致，约占95％。目前还没有能够有效预防aids的疫苗和特效的治疗方法，因此通过hiv检测，可以尽早发现、及时治疗hiv感染并预防hiv的传播。
3.目前hiv的检测方法主要包括抗体检测及核酸检测等。其中，抗体检测方法如酶联免疫吸附法(elisa)存在以下问题：感染可能还处于窗口期，因此血清还没有形成典型的抗体反应；艾滋病进展到终末期时抗体水平下降；其他非病毒蛋白抗体的交叉反应与hiv p24核心蛋白抗体引起的反应很相似。常用的hiv核酸检测方法包括逆转录pcr实验(rt
‑
pcr)、分支dna杂交实验(bdna)以及实时荧光定量pcr技术等。但这些方法都需要相关的昂贵仪器设备且需要有专业技术人员操作，因此在基层和现场的检测应用受到很大限制。
4.重组酶介导扩增(recombinase mediated amplification,rma)技术，作为一种等温核酸扩增技术，主要依赖重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶三种酶。rma反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平；且rma可以与侧流层析技术(lfd)结合，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅使用侧流层析试纸就可以通过肉眼观察结果，因此可实现hiv的快速检测。
5.本发明采用lfd
‑
rma法建立快速检测人类免疫缺陷病毒hiv
‑
1的方法，为人类免疫缺陷病毒hiv
‑
1的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法


技术实现要素：

6.为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：
7.一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，包括检测人类免疫缺陷病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
8.hiv
‑1‑
f：
[0009]5’‑
tactgggacagctacaaccatcccttcagacag
‑3’
；
[0010]
hiv
‑1‑
r：
[0011]5’‑
[biotin]tgggtatcacttctgggctgaaagccttctctt
‑3’
；
[0012]
hiv
‑1‑
p：
[0013]5’‑
[fam]agcagcagctgacacaggacacagcaatcagg[dspacer]cagccaaaattacc[c3
‑
spacer]
‑3’
。
[0014]
优选的，所述下游引物的5’端用biotin标记；探针的5’端用fam标记，第33个碱基替换为thf(dspacer)，3’末端被阻断基团c3
‑
spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
[0015]
一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，该试剂盒中包括有：核酸提取释放剂、含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性质控品、阴性质控品、侧流层析检测试纸条。
[0016]
所述核酸提取释放剂包括：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐mes、交联聚维酮pvpp、氢氧化钠、tris
‑
hcl、海藻糖、dmso。
[0017]
优选的，所述醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐mes的浓度为2％；所述交联聚维酮pvpp的浓度为1％；所述氢氧化钠的浓度为20mg/ml；所述tris
‑
hcl的浓度为50mm；所述海藻糖的浓度为5％；所述dmso的浓度为4％。
[0018]
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括hiv
‑
1引物对及检测探针、大肠杆菌reca蛋白、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、m
‑
mlv逆转录酶、核酸内切酶iv。
[0019]
所述缓冲液含有tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸。
[0020]
优选的，所述引物对及检测探针在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述m
‑
mlv逆转录酶的终浓度为200ng/μl；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸内切酶iv的终浓度为80ng/μl。
[0021]
所述阳性质控品为含有hiv
‑
1基因片段的重组质粒，所述阴性质控品为不含有hiv
‑
1的血清或血浆。
[0022]
所述待测样本为血清或血浆。
[0023]
此外，本发明还提供了一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的方法，包括以下步骤：
[0024]
(1)设计用于hiv
‑
1检测的引物对及探针；
[0025]
(2)用核酸提取释放剂提取待测样本的rna，提取方法为：将待测样本与核酸提取释放剂以体积比1:1
‑
4的比例混合均匀，在56℃加热10
‑
20min即可将核酸释放出来；
[0026]
(3)以提取的待测样本rna作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行rma扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；
[0027]
(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有hiv
‑
1；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有hiv
‑
1；
[0028]
有益效果：相较于传统的离心柱法、萃取法、磁珠法等核酸提取方法，本发明无需
复杂的样本处理过程，无需特殊的仪器和操作设备，一步法即可对样本进行核酸提取并用于下游的恒温扩增，过程中全程闭管操作，避免了样本处理过程的样品交叉污染和环境污染，同时大大提高了检测效率，可实现野外的实时核酸检测过程；
[0029]
本发明使用冻干粉试剂，能够提高试剂稳定性，实现常温储存及运输，减少企业生产成本及客户使用成本；
[0030]
本发明提供的基于lfd
‑
rma法快速检测hiv
‑
1的试剂盒，与普通pcr方法相比，仅需在恒温水浴锅中37
‑
42℃、30min内即可完成反应，对仪器设备要求低，无需热循环仪器，操作更加简单快速，同时可实现检测结果的可视化。
附图说明
[0031]
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]
图1 lfd
‑
rma法检测hiv
‑
1的灵敏性试验；
[0033]
图2 lfd
‑
rma法检测hiv
‑
1的特异性试验。
[0034]
图中序号代表：1：1
×
105copies/μl；2：1
×
104copies/μl；3：1
×
103copies/μl；4：1
×
102copies/μl；5：1
×
101copies/μl。
具体实施方式
[0035]
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
[0036]
实施例1
[0037]
1、待测样本的采集和处理
[0038]
血浆：将采集的抗凝全血1500
‑
3000r/min离心15min，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。
[0039]
血清：用一次性注射器(或真空采血管)抽取5
‑
10ml静脉血，室温下自然放置1
‑
2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500
‑
3000r/min离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。
[0040]
2、核酸的提取
[0041]
取100μl待测样本，加入100μl核酸提取释放剂，混合均匀，在56℃加热10
‑
20min即可将核酸释放出来。
[0042]
所述核酸提取释放剂包括醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐mes、交联聚维酮pvpp、氢氧化钠、tris
‑
hcl、海藻糖、dmso。
[0043]
优选的，所述醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐mes的浓度为2％；所述交联聚维酮pvpp的浓度为1％；所述氢氧化钠的浓度为20mg/ml；所述tris
‑
hcl的浓度为50mm；所述海藻糖的浓度为5％；所述dmso的浓度为4％。
[0044]
3、阳性质控品的制备
[0045]
以hiv
‑
1的核酸作为模板，对hiv
‑
1的特异性基因进行pcr扩增，pcr扩增产物经1％
琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pmd18
‑
t载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落pcr验证，将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒dna，获得质控品。
[0046]
4、rma引物与探针的设计
[0047]
根据hiv
‑
1的gag基因设计了特异性rma引物与探针，具体如表1所示：
[0048]
表1引物与探针序列
[0049][0050]
5、rma反应体系的建立
[0051]
将42.5μl缓冲液和5μl提取的待测样本核酸加入到含有扩增反应试剂的检测管中，混匀，最后向管中加入2.5μl的280mm醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于恒温水浴锅中进行rma反应，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；每次反应均以阳性质控品作为阳性对照，以阴性质控品为阴性对照。
[0052]
其中，所述恒温扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括hiv
‑
1引物对及检测探针、大肠杆菌reca蛋白、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、m
‑
mlv逆转录酶、核酸内切酶iv；
[0053]
所述缓冲液含有tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸；
[0054]
所述引物对及检测探针在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述m
‑
mlv逆转录酶的终浓度为200ng/μl；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸内切酶iv的终浓度为80ng/μl。
[0055]
所述阳性质控品为含有hiv
‑
1基因片段的重组质粒；所述阴性质控品为不含有hiv
‑
1的血清或血浆。
[0056]
6、侧流层析试纸条检测方法的操作及结果判读
[0057]
在rma扩增结束后，将反应管放到含有侧流层析试纸条的一次性核酸检测装置中，5min后，通过试纸条的显色进行判读。若质控线(c)和检测线(t)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。
[0058]
7、lfd
‑
rma法检测hiv
‑
1的灵敏度分析
[0059]
将阳性质控品经pbs进行10倍系列稀释(包括5
×
105、5
×
104、5
×
103、5
×
102、5
×
101copies/ml)，以阴性质控品作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行lfd
‑
rma反应，每个浓度重复3次试验。根据图1可知，lfd
‑
rma检测方法的最低检测限为5
×
103copies/ml。即，lfd
‑
rma法检测试剂盒的灵敏度达到5
×
103copies/ml。
[0060]
8、lfd
‑
rma法检测hiv
‑
1的特异性分析
[0061]
为了检验lfd
‑
rma检测方法的特异性，选择hiv
‑
1、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、梅毒螺旋体(tp)、eb病毒(ebv)等病原体核酸样本，用lfd
‑
rma方法进行检测，以阴性质控品作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，只有hiv
‑
1阳性模板呈现质控线(c)和检测线(t)两条线，检测结果是阳性，其他病毒均只有质控线(c)一条线，检测结果是阴性。该结果表明所建立的lfd
‑
rma检测方法具有良好的特异性。
[0062]
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，其特征在于，包括检测人类免疫缺陷病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：hiv
‑1‑
f：5
’‑
tactgggacagctacaaccatcccttcagacag
‑3’
；hiv
‑1‑
r：5
’‑
[biotin]tgggtatcacttctgggctgaaagccttctctt
‑3’
；hiv
‑1‑
p：5
’‑
[fam]agcagcagctgacacaggacacagcaatcagg[dspacer]cagccaaaattacc[c3
‑
spacer]
‑3’
。2.如权利要求1所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5’端用biotin标记；探针的5’端用fam标记，第33个碱基替换为thf(dspacer)，3’末端被阻断基团c3
‑
spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。3.如权利要求1所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括有：核酸提取释放剂、含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性质控品、阴性质控品、侧流层析检测试纸条；所述核酸提取释放剂包括：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐mes、交联聚维酮pvpp、氢氧化钠、tris
‑
hcl、海藻糖、dmso。4.如权利要求3所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐mes的浓度为2％；所述交联聚维酮pvpp的浓度为1％；所述氢氧化钠的浓度为20mg/ml；所述tris
‑
hcl的浓度为50mm；所述海藻糖的浓度为5％；所述dmso的浓度为4％。5.如权利要求4所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括hiv
‑
1引物对及检测探针、大肠杆菌reca蛋白、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、m
‑
mlv逆转录酶、核酸内切酶iv。6.如权利要求5所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液含有tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸。7.如权利要求6所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物对及检测探针在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述m
‑
mlv逆转录酶的终浓度为200ng/μl；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸内切酶iv的终浓度为80ng/μl。8.如权利要求7所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有hiv
‑
1基因片段的重组质粒，所述阴性质控品为不含有hiv
‑
1的血清或血浆。9.如权利要求8所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可以检测的样品为血清或血浆。10.如权利要求9所述的一种基于lfd
‑
rma法检测人类免疫缺陷病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计用于hiv
‑
1检测的引物对及探针；(2)用核酸提取释放剂提取待测样本的rna，提取方法为：将待测样本与核酸提取释放剂以体积比1:1
‑
4的比例混合均匀，在56℃加热10
‑
20min即可将核酸释放出来；(3)以提取的待测样本rna作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行rma扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有hiv
‑
1；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有hiv
‑
1。
技术总结
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD


技术研发人员：陈大为 陈龙 张瑶
受保护的技术使用者：济南国益生物科技有限公司
技术研发日：2021.04.26
技术公布日：2021/6/29