一种清除细菌生物被膜的组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于制糖领域，具体涉及一种清除细菌生物被膜的组合物及其应用。


背景技术：

2.在制糖过程中(包括甘蔗制糖和甜菜制糖)，提汁是制糖生产的第一个工序。提汁过程就是将甘蔗或甜菜通过压榨或者渗出等手段将糖料作物中富含蔗糖的汁液提取出来。糖料在进行提汁前，一般被收割后在田间或堆放点存放了一段时间。糖料被收割后失去了免疫力，且存在大量刀砍或火烧的伤口，糖料中富有营养的汁液会暴露出来，再加上收割过程中夹杂着含有大量微生物的泥土等，使微生物迅速繁殖。进行提汁时，糖料含有大量微生物，车间缺乏消杀微生物的手段且生产环境非常适合微生物生长，导致微生物进一步繁殖。由于长期大量存在微生物和营养物质，所以设备和管道的表面会形成细菌生物被膜，使微生物固定在设备和管道的表面，像一个催化中心一样，持续地利用营养物质繁殖，造成蔗糖损失。
3.细菌生物被膜广泛存在于各种含水的潮湿表面上，是由附着于惰性或活性实体表面的细菌细胞和包裹细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落，一般由多菌种构成。细菌在生物被膜中只占不足1/3，其余部分均是细菌分泌的粘性物质和胞外多糖，这是使细菌生物被膜能粘附于物体表面的关键。
4.肠膜状明串珠菌是一种在制糖过程中常见的细菌，常存在于空气、土壤、植物体表等，能发酵蔗糖生成高粘度的右旋糖酐。右旋糖酐是构成制糖设备中细菌生物被膜的重要成分，主要作用是使微生物和物体表面或微生物间粘附在一起。所以，肠膜状明串珠菌及其分泌的右旋糖酐是构成制糖设备表面细菌生物被膜的重要因素。
5.目前，在实际生产中，车间工作人员对制糖设备的清洁仅用水流冲洗，无法有效清除细菌生物被膜。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有技术中的不足，提供一种清除细菌生物被膜的组合物及其应用。
7.本发明的第一个目的是提供一种清除细菌生物被膜的组合物，包含a)右旋糖酐酶，b)抗右旋糖酐单克隆抗体，以及c)缓冲液。
8.优选，所述的右旋糖酐酶浓度为0.1～0.3u/ml。
9.优选，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体的浓度为1～3mg/ml。
10.优选，所述的右旋糖酐酶浓度为0.2～0.3u/ml，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体的浓度为1～3mg/ml。进一步优选，所述的右旋糖酐酶浓度为0.3u/ml，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体的浓度为2mg/ml。
11.优选，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。进一步优选，所述的缓冲液为ph6.5、0.2mol/l的磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钠缓冲液。
12.优选，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体为抗右旋糖酐单克隆抗体d24，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24是由保藏编号为cgmcc no.21002的葡聚糖杂交瘤细胞株d24产生。
13.本发明的第二个目的是提供所述的清除细菌生物被膜的组合物在清除细菌生物被膜中的应用。
14.优选，所述的细菌生物被膜为制糖工业设备表面细菌生物被膜。
15.优选，所述的细菌生物被膜为肠膜明串珠菌生物被膜。
16.本发明的微量细菌被膜检测试验结果表明：单独添加浓度为0.1～0.3u/ml的右旋糖酐酶时，其对肠膜明串珠菌生物被膜清除率为10.1％～28.3％；单独添加浓度为1～3mg/ml的抗右旋糖酐单克隆抗体d24时，其对肠膜明串珠菌生物被膜几乎没有清除作用；组合添加浓度为0.2～0.3u/ml的右旋糖酐酶和浓度为1～3mg/ml的抗右旋糖酐单克隆抗体d24时，其对肠膜明串珠菌生物被膜清除率为32.7％～69.6％。相对于单独添加，组合添加右旋糖酐酶和抗右旋糖酐单克隆抗体d24对肠膜明串珠菌生物被膜清除率有显著的协同增效作用。因此，本发明的清除细菌生物被膜的组合物能有效清除细菌生物被膜，尤其是能有效清除制糖工业设备表面细菌生物被膜。
17.本发明的葡聚糖杂交瘤细胞株d24于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmcc no：21002。
具体实施方式
18.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
19.实施例1：组合物对肠膜状明串珠菌生物被膜的清除作用
20.1.实验用试剂及菌株
21.右旋糖酐酶：购自中诺生物科技发展江苏有限公司。
22.抗右旋糖酐单克隆抗体d24：由保藏编号为cgmcc no.21002的葡聚糖杂交瘤细胞株d24产生。
23.磷酸氢二钠
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磷酸二氢钠缓冲液(0.2mol/l，ph6.5)：购自上海邦景实业有限公司。
24.肠膜明串珠菌：购自广东省微生物菌种保藏中心，gim编号1.473。
25.液体培养基：蔗糖130.0g、蛋白胨2.0g、kh2po
4 0.3g、na2hpo
4 1.4g，加水溶解，定容到1l，121℃灭菌20min。
26.固体培养基：蔗糖130.0g、蛋白胨2.0g、kh2po
4 0.3g、na2hpo
4 1.4g、琼脂15g，加水溶解，定容到1l，121℃灭菌20min，趁热倒入培养皿，冷却备用。
27.2.抗右旋糖酐单克隆抗体d24的制备
28.将体格强健、生长状况良好的6～8周龄balb/c小鼠(购自南方医科大学实验动物中心)腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5ml，两周后，腹腔接种用无血清培养基(购自thermo fisher scientific)稀释的葡聚糖杂交瘤细胞株d24(保藏编号为：cgmcc no.21002)，每只小鼠5
×
105个/0.2ml。间隔8天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡时，处死小鼠，无菌条件下将腹水吸出。室温静止30min，10000rpm离心10min，收集上清，得到预处理过的腹水，
‑
70℃冻存备用。
29.纯化方案为辛酸
‑
硫酸铵沉淀法。取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/l ph4.0醋
酸缓冲液，用1mol/l hcl调ph至4.5；按每毫升稀释腹水加11μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h，取出12000rpm离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(尼龙筛直径125μm)，加入1/10体积的0.1mol/l ph7.2 pbs缓冲液，用1mol/l naoh调ph至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1h；12000rpm离心30min，弃上清；沉淀溶于50～100倍体积的pbs缓冲液中，用50～100倍体积的pbs透析，4℃过夜；取出12000rpm离心30min，除去不溶性沉淀，冷冻干燥，得到冻干粉，命名为抗右旋糖酐单克隆抗体d24冻干粉，备用。
30.3.组合物的配制：按照下表1试验组1～16对应的组合物中的右旋糖酐酶和抗右旋糖酐单克隆抗体d24的配比，将右旋糖酐酶和抗右旋糖酐单克隆抗体d24(步骤2制备的抗右旋糖酐单克隆抗体d24冻干粉)溶于ph6.5、0.2mol/l的磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钠缓冲液中。
31.4.微量细菌被膜检测试验
32.采用微量细菌被膜检测试验(96孔板生物被膜形成试验)检测组合物对肠膜明串珠菌生物被膜的清除程度。
33.具体试验方法如下：
①
将肠膜明串珠菌冻干粉溶解到液体培养基，37℃培养24h后，在固体培养基上划板活化，37℃培养48h；
②
挑取单菌落接种于50ml液体培养基，37℃培养48h，得到培养液；
③
将培养液用液体培养基稀释200倍后接种于96孔板聚苯乙烯微板，每孔200μl，37℃静置培养48h；
④
弃菌液，用pbs洗板3次，晾干；
⑤
加入各浓度组合物(成分具体见下表1)，每孔200μl，常温作用15min；
⑥
弃溶液，用pbs洗板3次，晾干；
⑦
每孔加200μl 2％结晶紫溶液室温染色5min；
⑧
弃染液，用水洗板，晾干；向各孔加入100μl 33％乙酸溶液，37℃放置30min；
⑨
用酶标仪测定590nm处od值(以33％乙酸溶液调零)，每个试验组读取三复孔的od值；
⑩
用如下公式计算组合物对肠膜明串珠菌生物被膜清除率：(试验组1的od值
‑
该组的od值)
÷
试验组1的od值
×
100％。
34.表1试验组1～16的组合物成分及对肠膜明串珠菌生物被膜清除率
35.[0036][0037]
注：经显著性检验(t检验，字母标记法)，各均值间存在相同字母表示差异不显著，无相同字母表示差异显著。
[0038]
从上表1可知，单独添加右旋糖酐酶浓度为0.1～0.3u/ml时，其对肠膜明串珠菌生物被膜清除率为10.1％～28.3％；单独添加抗右旋糖酐单克隆抗体d24浓度为1～3mg/ml时，其对肠膜明串珠菌生物被膜几乎没有清除作用；组合添加右旋糖酐酶浓度为0.2～0.3u/ml和抗右旋糖酐单克隆抗体d24浓度为1～3mg/ml时，其对肠膜明串珠菌生物被膜清除率为32.7％～69.6％。相对于单独添加右旋糖酐酶和抗右旋糖酐单克隆抗体d24，组合添加右旋糖酐酶和抗右旋糖酐单克隆抗体d24对肠膜明串珠菌生物被膜清除率有显著的协同增效作用。因此，组合添加右旋糖酐酶和抗右旋糖酐单克隆抗体d24能有效清除肠膜明串珠菌生物被膜，尤其是能有效清除制糖工业设备表面细菌生物被膜。
[0039]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种清除细菌生物被膜的组合物，其特征在于，包含a)右旋糖酐酶，b)抗右旋糖酐单克隆抗体，以及c)缓冲液。2.根据权利要求1所述的清除细菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的右旋糖酐酶浓度为0.1～0.3u/ml。3.根据权利要求1或2所述的清除细菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体的浓度为1～3mg/ml。4.根据权利要求3所述的清除细菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的右旋糖酐酶浓度为0.2～0.3u/ml，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体的浓度为1～3mg/ml。5.根据权利要求1所述的清除细菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。6.根据权利要求5所述的清除细菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的缓冲液为ph6.5、0.2mol/l的磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钠缓冲液。7.根据权利要求1所述的清除细菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体为抗右旋糖酐单克隆抗体d24，所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24是由保藏编号为cgmcc no.21002的葡聚糖杂交瘤细胞株d24产生。8.权利要求1
‑
7任一项所述的清除细菌生物被膜的组合物在清除细菌生物被膜中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的细菌生物被膜为制糖工业设备表面细菌生物被膜。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的细菌生物被膜为肠膜明串珠菌生物被膜。
技术总结
本发明公开了一种清除细菌生物被膜的组合物及其应用。本发明的清除细菌生物被膜的组合物，包含右旋糖酐酶，抗右旋糖酐单克隆抗体，以及缓冲液。本发明的微量细菌被膜检测试验结果表明：组合添加浓度为0.2～0.3U/mL的右旋糖酐酶和浓度为1～3mg/mL的抗右旋糖酐单克隆抗体D24时，其对肠膜明串珠菌生物被膜清除率为32.7％～69.6％；相对于单独添加，组合添加右旋糖酐酶和抗右旋糖酐单克隆抗体D24对肠膜明串珠菌生物被膜清除率有显著的协同增效作用。因此，本发明的清除细菌生物被膜的组合物能有效清除细菌生物被膜，尤其是能有效清除制糖工业设备表面细菌生物被膜。业设备表面细菌生物被膜。


技术研发人员：常国炜 梁达奉 刘桂云 黄曾慰 张九花 黎志德
受保护的技术使用者：广东省科学院生物工程研究所
技术研发日：2021.02.05
技术公布日：2021/6/25