一种快速定量检测BPA的荧光方法与流程

一种快速定量检测bpa的荧光方法
技术领域
1.本发明属于双酚a类物质残留检测领域，具体公开了一种快速定量检测bpa的荧光方法。


背景技术：

2.bpa，即双酚a，是一种有机化合物，分子式为c
15
h
16
o2是一种重要的工艺原料，用来合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料，其被广泛应用于日常生物的塑料材料中。60年代以来就被用于制造塑料（奶）瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料（奶粉）罐内侧涂层。bpa无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械到及食品包装的内里，都有它的身影。bpa很难降解，并且会从容器中浸出到食品和饮料中。近年来，有研究表明bpa具有模仿雌激素的活性，在严重的情况下会导致性早熟，代谢紊乱甚至癌症。因此，bpa含量的测定具有积极的意义。目前，用于检测bpa的方法主要有色谱、质谱、化学发光、电化学法等。但是上述检测方法或者需要昂贵的大型仪器，对操作人员要求较高，比如色谱和质谱法；或者检测特异性不高，检测方法繁琐，费事费力，需要使用有毒化学试剂等等。因此，目前急需开发一种灵敏度较好，操作简便的方法。


技术实现要素：

3.针对上述情况，本发明的目的是提供一种快速准确、灵敏度较高的bpa的检测方法，本发明设计了荧光探针标记的适配体， 通过荧光信号检测bpa。
4.本发明的技术方案如下：一种快速定量检测bpa的荧光方法，包括以下步骤s1.针对bpa的结构，合成5
′
端具有fam标记的富含c和g的适配体序列；所述序列长度为50
‑
70bp之间；所述适配体序列保存于tris溶液中，为溶液a；s2.在上述溶液a中加入不同质量的bpa，放置10
‑
60min，形成不同浓度的溶液b；s3.配置氧化石墨烯溶液，与等体积聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，静置10
‑
60min，为溶液c；s4.混合溶液b和c，静置20
‑
80min，得到溶液d，开始检测含有不同浓度bpa的溶液d的荧光信号；s5.根据检测结果绘制标准曲线，随后进行未知样品的浓度检测，未知样品的浓度根据荧光信号值由标准曲线求出。
5.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s1中的适配体序列为seq id no.1=
‑
fam
‑5′
ccg gtg ggt ggt cag gtg gga tag cgt tcc gcg tat ggc cca gcg cat cac ggg ttc gca cca
‑3′
。
6.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s1中的溶液a为适配体序列浓度为1mm、 ph 7.4的tris溶液。
7.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s2中的溶液a的体积范围为50
‑
200ul。
8.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s3中的氧化石墨烯溶液的浓度为50
‑
200ug/ml。
9.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s3中的聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10
‑
40ug/ml。
10.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s4中的溶液b的体积为800ul，所述溶液c的体积为200ul。
11.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s5中的标准曲线的回归方程为y=2.640 1.156x。
12.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，所述步骤s4和s5中的荧光信号的峰值波长在515nm。
13.进一步的，上述一种快速定量检测bpa的荧光方法，具体包括如下步骤：s1.合成bpa的适配体，其序列=seq id no.1=fam
‑5′
ccg gtg ggt ggt cag gtg gga tag cgt tcc gcg tat ggc cca gcg cat cac ggg ttc gca cca
‑3′
；配制含1μm该适配体的1mm ph 7.4的tris溶液；s2.取100
µ
l上述适配体溶液，与不同浓度的bpa混合，放置30min；s3.制备氧化石墨烯，使用前用蒸馏水配制成50ug / ml，与等体积 20
µ
g/ml的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，并静置30min；s4.在s2中制备的溶液中加入 90
µ
l10mm ph 7.4的tris溶液，并加适量蒸馏水至总体积为800
µꢀ
l；再加入200
µꢀ
l步骤s3制备的溶液，静置50min后开始检测；s5.根据检测结果绘制标准曲线，随后进行未知样品的浓度检测，未知样品的浓度根据荧光信号值由标准曲线求出。
14.从上述技术方案可以得出，本发明具有如下有益效果本发明通过适配体对bpa特异性识别，实现了对bpa的快速检测，方法特异性较高，所需样品量较小，灵敏度较好，操作简便，对仪器和操作人员要求不高，检测耗时短，应用性较好。
附图说明
15.附图1为本发明实施例3中不同浓度bpa的荧光光谱图；附图2为本发明实施例3中bpa的标准曲线。
具体实施方式
16.下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
17.实施例1一种快速定量检测bpa的荧光方法，包括以下步骤：s1.合成bpa的适配体，其序列=seq id no.1=fam
‑5′
ccg gtg ggt ggt cag gtg gga tag cgt tcc gcg tat ggc cca gcg cat cac ggg ttc gca cca
‑3′
；配制含1μm该适配体的1mm ph 7.4的tris溶液；s2.取50
µ
l上述适配体溶液，与不同浓度的bpa混合，放置30min；
s3.制备氧化石墨烯，使用前用蒸馏水配制成100ug / ml，与等体积 10
µ
g/ml的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，并静置10min；s4.在s2中制备的溶液中加入 90
µ
l10mm ph 7.4的tris溶液（含0mm cacl2），并加适量蒸馏水至总体积为800
µꢀ
l；再加入200
µꢀ
l步骤s3制备的溶液，静置20min后开始检测；s5.根据检测结果绘制标准曲线，随后进行未知样品的浓度检测，未知样品的浓度根据荧光信号值由标准曲线求出。
18.实施例2一种快速定量检测bpa的荧光方法，包括以下步骤：s1.合成bpa的适配体，其序列=seq id no.1=fam
‑5′
ccg gtg ggt ggt cag gtg gga tag cgt tcc gcg tat ggc cca gcg cat cac ggg ttc gca cca
‑3′
；配制含1μm该适配体的1mm ph 7.4的tris溶液；s2.取100
µ
l上述适配体溶液，与不同浓度的bpa混合，放置60min；s3.制备氧化石墨烯，使用前用蒸馏水配制成200ug / ml，与等体积 40
µ
g/ml的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，并静置60min；s4.在s2中制备的溶液中加入 90ul 10mm ph 7.4的tris溶液（含200mm cacl2），并加适量蒸馏水至总体积为800
µ
l；再加入200
µ
l步骤s3制备的溶液，静置80min后开始检测；s5.根据检测结果绘制标准曲线，随后进行未知样品的浓度检测，未知样品的浓度根据荧光信号值由标准曲线求出。
19.实施例3一种快速定量检测bpa的荧光方法，包括以下步骤：s1.合成bpa的适配体，其序列=seq id no.1=fam
‑5′
ccg gtg ggt ggt cag gtg gga tag cgt tcc gcg tat ggc cca gcg cat cac ggg ttc gca cca
‑3′
；配制含1μm该适配体的1mm ph 7.4的tris溶液；s2.取100
µ
l上述适配体溶液，与不同浓度的bpa混合，放置30min；s3.制备氧化石墨烯，使用前用蒸馏水配制成50ug / ml，与等体积 20
µ
g/ml的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，并静置30min；s4.在s2中制备的溶液中加入 90
µ
l 10mm ph 7.4的tris溶液(含0mm cacl2)，并加适量蒸馏水至总体积为800
µ
l；再加入200
µ
l步骤s3制备的溶液，静置50min后开始检测，不同bpa浓度下的荧光光谱曲线如附图1所示，由下往上bpa浓度依次为10ug/ml，20ug/ml和50ug/ml，对应的荧光强度a.u分别为16.84、29.52 、和57.55，发现峰值波长在515nm附近。
20.s5.根据检测结果绘制标准曲线，所述曲线见附图2所示，bpa浓度依次为0ug/ml，5ug/ml,10ug/ml，20ug/ml和50ug/ml, 对应的荧光强度a.u分别为2.38、8.38、16.84、29.52 和57.55，曲线的回归方程为y=2.640 1.156x，r2大于0.95，拟合效果好；随后进行未知样品的浓度检测，未知样品的浓度根据荧光信号值，对比标准曲线即可求出。
21.由上述实施例可知，本发明通过适配体对bpa特异性识别，实现了对bpa的快速检测，方法特异性较高，所需样品量较小，灵敏度较好，操作简便，对仪器和操作人员要求不高，检测耗时短，应用性较好。
22.以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依
本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

技术特征：
1.一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，包括以下步骤s1.针对bpa的结构，合成5
′
端具有fam标记的富含c和g的适配体序列；所述序列长度为50
‑
70bp之间；所述适配体序列保存于tris溶液中，为溶液a；s2.在上述溶液a中加入不同质量的bpa，放置10
‑
60min，形成不同浓度的溶液b；s3.配置氧化石墨烯溶液，与等体积聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，静置10
‑
60min，为溶液c；s4.混合溶液b和c，静置20
‑
80min，得到溶液d，开始检测含有不同浓度bpa的溶液d的荧光信号；s5.根据检测结果绘制标准曲线，随后进行未知样品的浓度检测，未知样品的浓度根据荧光信号值由标准曲线求出。2.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s1中的适配体序列为seq id no.1=fam
‑5′
ccg gtg ggt ggt cag gtg gga tag cgt tcc gcg tat ggc cca gcg cat cac ggg ttc gca cca
‑3′
。3.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s1中的溶液a为适配体序列浓度为1mm、 ph 7.4的tris溶液。4.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s2中的溶液a的体积范围为50
‑
200ul。5.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s3中的氧化石墨烯溶液的浓度为50
‑
200ug/ml。6.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s3中的聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10
‑
40ug/ml。7.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s4中的溶液b的体积为800ul，所述溶液c的体积为200ul。8.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s5中的标准曲线的回归方程为y=2.640 1.156x。9.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，所述步骤s4和s5中的荧光信号的峰值波长在515nm。10.根据权利要求1所述的一种快速定量检测bpa的荧光方法，其特征在于，具体包括如下步骤：s1.合成bpa的适配体，其序列=seq id no.1=fam
‑5′
ccg gtg ggt ggt cag gtg gga tag cgt tcc gcg tat ggc cca gcg cat cac ggg ttc gca cca
‑3′
；配制含1μm该适配体的1mm ph 7.4的tris溶液；s2.取100
µ
l上述适配体溶液，与不同浓度的bpa混合，放置30min；s3.制备氧化石墨烯，使用前用蒸馏水配制成50ug / ml，与等体积 20
µ
g/ml的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，并静置30min；s4.在s2中制备的溶液中加入 90
µ
l10mm ph 7.4的tris溶液，并加适量蒸馏水至总体积为800
µꢀ
l；再加入200
µꢀ
l步骤s3制备的溶液，静置50min后开始检测；s5.根据检测结果绘制标准曲线，随后进行未知样品的浓度检测，未知样品的浓度根据荧光信号值由标准曲线求出。
技术总结
本发明公开了一种快速定量检测BPA的方法，使用BPA适配体的特异性来实现对样品中BPA快速定量检测；具体包括针对BPA的结构合成5


技术研发人员：姚骅珊 徐菁菁 潘晴晴 马晨瑶 徐进洋
受保护的技术使用者：苏州健雄职业技术学院
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29