一种基于LFD-RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组的制作方法

一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的引物探针组
技术领域
1.本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的引物探针组。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种革兰氏阴性杆菌，其生存能力极强，能够在胃中强酸性环境中生存，是目前发现的唯一能够在胃里面生存的细菌，人是它的唯一宿主和传染源。hp是消化性溃疡发生和治疗后复发的主要原因，它在十二指肠溃疡患者中检出率高达95％
‑
100％，胃溃疡患者中的检出率在70％以上。同时，hp可以引起胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生，被世界卫生组织明确列为ⅰ类致癌物。hp在全世界各地的感染率各异，主要取决于人种差异、居住环境、卫生条件、经济状况、受教育程度、高危职业(医护人员)等因素，但总体感染人数庞大。我国成人感染率统计数字不一，但普遍认为在50％以上。大部分感染者是无症状的，只有在体检时做相关检查才能发现；少部分人会表现为消化不良的症状；10％
‑
20％的感染者会发生消化性溃疡；更少一些人会发生胃癌或胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤。因此快速准确地检测hp感染对大众健康具有重要意义。
3.目前幽门螺杆菌的检查主要有血清hp抗体检测、尿素呼气实验、粪便幽门螺杆菌抗原检测和荧光定量pcr检测。其中血清抗体检验由于无法区分是既往感染还是正在感染，一般用于人群感染率的流行病学调查；粪便hp抗原检测的普及度还不是很高；尿素呼气实验目前广泛用于临床上判断感染和治疗后的复查，但要检查前4周内停用或禁用抗生素、铋剂和抑酸药物，且易出现假阳性；荧光定量pcr方法灵敏高效，但费用高昂，不适合在基层医院推广普及。
4.而重组酶介导扩增(recombinase mediated amplification,rma)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代pcr的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶三种酶。rma反应可以在37
‑
42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现核酸的快速扩增。rma技术可以与侧流免疫层析技术(lfd)相结合进行扩增产物的检测，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅使用侧流层析试纸就可以通过肉眼观察结果，因此可实现幽门螺杆菌的快速检测。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：
6.一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的引物探针组，包括检测幽门螺杆菌的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
7.hp
‑
f：
[0008]5’‑
ggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgatgaa
‑3’
；
[0009]
hp
‑
r：
[0010]5’‑
[biotin]attgagcaatattccctactgctgcctcccgta
‑3’
；
[0011]
hp
‑
p：
[0012]5’‑
[fam]aggctatgacgggtatccggcctgagaggg[dspacer]gaacggacacactgga[c3
‑
spacer]
‑3’
。
[0013]
优选的，所述下游引物的5’端用biotin标记；探针的5’端用fam标记，第31个碱基t替换为thf(dspacer)，3’末端被阻断基团c3
‑
spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
[0014]
一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。
[0015]
优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括终浓度各10μm的rma引物对及检测探针组、100ng/μl的大肠杆菌reca蛋白、40ng/μl的uvsy蛋白、800ng/μl的单链结合蛋白gp32、60ng/μl的bst聚合酶、80ng/μl的核酸内切酶iv。
[0016]
优选的，所述醋酸镁的终浓度为100mm。
[0017]
优选的，所述缓冲液包括下述组分：50mm的tris、10％w/v的聚环氧乙烷、2mm的海藻糖、2.5mm的甘露醇、10mm的atp、2mm的dntps、1000ng/ml的肌酸激酶和25mm的磷酸肌酸。
[0018]
优选的，所述标准阳性质粒为含有hp基因片段的重组质粒，用于hp核酸检测的阳性对照。
[0019]
优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
[0020]
优选的，所述试剂盒可以检测的样品为唾液、牙斑、胃粘膜组织、胃液、肠液、粪便等。
[0021]
一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的方法，包括以下步骤：
[0022]
(1)提取待测样本的dna；
[0023]
(2)设计用于hp检测的引物对及探针；
[0024]
(3)以提取的待测样本dna作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行rma扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；
[0025]
(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有hp；当试纸条只有质控区出现一条色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有hp。
[0026]
有益效果：(1)操作方便，检测时间短，rma扩增反应只需在30
‑
42℃下30min内即可完成，可用于hp感染的快速诊断；
[0027]
(2)将rma和lfd技术相结合，既可以实现hp核酸的等温体外快速扩增，又可以实现检测结果的可视化，在无需特殊仪器设备下即可实现hp的快速检测；
[0028]
(3)检测样本可为唾液或粪便，样品采集无创且无痛，避免了胃镜等有创采样方法，因而能减少取样难度和取样痛苦，并且能节约检测时间和检测成本；
[0029]
(4)闭管检测，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。
附图说明
[0030]
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]
图1 lfd
‑
rma法检测hp的灵敏性试验；
[0032]
图2 lfd
‑
rma法检测hp的特异性试验。
[0033]
图中序号，1：2
×
104copies/μl；2：2
×
103copies/μl；3：2
×
102copies/μl；4：2
×
101copies/μl；5：2copies/μl
具体实施方式
[0034]
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
[0035]
实施例1
[0036]
1、阳性标准质粒的制备
[0037]
提取hp的核酸作为模板，对hp的特异性基因进行pcr扩增，pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pmd18
‑
t载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落pcr验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒dna，获得阳性质粒。
[0038]
2、rma引物与探针的设计
[0039]
根据hp的16s rrna基因基因设计了特异性rma引物与探针，具体如表1所示：
[0040]
表1引物与探针序列
[0041][0042]
3、rma反应体系的建立
[0043]
将42.5μl缓冲液和5μl提取的待测样本核酸加入到含有扩增反应试剂的检测管中，混匀。最后向管中加入2.5μl的280mm醋酸镁溶液并混匀。将上述反应管放置于恒温水浴锅中进行rma反应，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照。
[0044]
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括终浓度各10μm的rma引物对及检测探针组、100ng/μl的大肠杆菌reca蛋白、40ng/μl的uvsy蛋白、800ng/μl的单链结合蛋白gp32、60ng/μl的bst聚合酶、80ng/μl的核酸内切酶iv。
[0045]
所述醋酸镁的终浓度为100mm。
[0046]
所述缓冲液包括下述组分：50mm的tris、10％w/v的聚环氧乙烷、2mm的海藻糖、2.5mm的甘露醇、10mm的atp、2mm的dntps、1000ng/ml的肌酸激酶和25mm的磷酸肌酸。
[0047]
所述标准阳性质粒为含有hp基因片段的重组质粒，用于hp核酸检测的阳性对照。
[0048]
所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
[0049]
所述试剂盒可以检测的样品为唾液、牙斑、胃粘膜组织、胃液、肠液、粪便。
[0050]
4、侧流层析试纸条检测方法的操作及结果判读
[0051]
在rma扩增结束后，将反应管放到含有侧流层析试纸条的一次性核酸检测装置中，5min后，通过试纸条的显色进行判读。若质控线(c)和检测线(t)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。
[0052]
5、lfd
‑
rma法检测hp的灵敏度分析
[0053]
将标准阳性质粒经pbs进行10倍系列稀释(包括2
×
104、2
×
103、2
×
102、2
×
101、2copies/μl)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行lfd
‑
rma反应，每个浓度重复3次试验。根据图1可知，lfd
‑
rma检测方法的最低检测限为2
×
101copies/μl。即，lfd
‑
rma法检测试剂盒的灵敏度达到2
×
101copies/μl。
[0054]
6、lfd
‑
rma法检测hp的特异性分析
[0055]
为了检验lfd
‑
rma检测方法的特异性，选择幽门螺杆菌hp、大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等病原体核酸样本，用lfd
‑
rma方法进行检测，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，只有hp阳性模板呈现质控线(c)和检测线(t)两条线，检测结果是阳性，其他病毒均只有质控线(c)一条线，检测结果是阴性。该结果表明所建立的lfd
‑
rma检测方法具有良好的特异性。
[0056]
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的引物探针组，其特征在于，包括检测幽门螺杆菌的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：hp
‑
f：5
’‑
ggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgatgaa
‑3’
；hp
‑
r：5
’‑
[biotin]attgagcaatattccctactgctgcctcccgta
‑3’
；hp
‑
p：5
’‑
[fam]aggctatgacgggtatccggcctgagaggg[dspacer]gaacggacacactgga[c3
‑
spacer]
‑3’
。2.如权利要求1所述的一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5’端用biotin标记；探针的5’端用fam标记，第31个碱基t替换为thf(dspacer)，3’末端被阻断基团c3
‑
spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。3.如权利要求1所述的一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。4.如权利要求3所述的一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括终浓度各10μm的rma引物对及检测探针组、100ng/μl的大肠杆菌reca蛋白、40ng/μl的uvsy蛋白、800ng/μl的单链结合蛋白gp32、60ng/μl的bst聚合酶、80ng/μl的核酸内切酶iv。5.如权利要求4所述的一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括下述组分：50mm的tris、10％w/v的聚环氧乙烷、2mm的海藻糖、2.5mm的甘露醇、10mm的atp、2mm的dntps、1000ng/ml的肌酸激酶和25mm的磷酸肌酸。6.如权利要求5所述的一种基于lfd
‑
rma法检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可以检测的样品为唾液、牙斑、胃粘膜组织、胃液、肠液、粪便等。
技术总结
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD


技术研发人员：陈龙 陈大为 张瑶
受保护的技术使用者：济南国益生物科技有限公司
技术研发日：2021.04.26
技术公布日：2021/6/29