基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌，还涉及利用重组菌生产2
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岩藻糖基乳糖的方法和应用。
背景技术：2.婴儿配方奶粉是除母乳喂养外为婴儿提供或补充营养的最佳选择，为了缩小与母乳之间的营养成分差距，近年来关于母乳寡糖的研究越来越多。人乳中包含了众多的寡糖成分，约50％是岩藻糖基化的寡糖，其中2
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岩藻糖基乳糖((2
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fl))最为丰富。已被美国食品和药物管理局(fda)批准为gras级别的hmos，可作为高档婴配奶粉的营养补充剂，是目前最具商业价值的一种岩藻糖基乳糖。
3.而生产2
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岩藻糖基乳糖的方式主要包括了化学合成法、酶法合成、全细胞催化以及生物发酵法。生物发酵法生产2
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岩藻糖基乳糖是未来生产2
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岩藻糖基乳糖的主要方法之一，利用微生物自身代谢途径合成供体gdp
‑
l
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fuc，进一步在α
‑
1,2
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岩藻糖基转移酶的作用下催化合成2
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fl。目前，研究人员已在多种工业菌株中，包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等，构建了2
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fl的合成途径。大肠杆菌具有产量高的优点，但是大肠肝会产生毒素，安全性差。且需要在大肠杆菌中同时重组表达多个基因，外源基因表达过多稳定性差且对宿主菌的代谢造成一定负担。因此，急需寻找一种新的宿主作为2
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岩藻糖基乳糖的底盘菌株。
4.kosakonia sp.cctcc m2018092菌株是在中国西南重庆地区的温泉水分离得到，菌株能够高产富含岩藻糖组分的岩藻多糖(fucopol)，充分说明底盘菌株内gdp
‑
fucose池的巨大潜力，这为2
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岩藻糖基乳糖的产生提供了强大的岩藻糖基供体池。
技术实现要素：5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌；本发明的目的之二在于提供利用kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的方法；本发明的目的之三在于提供所述重组菌在合成2
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岩藻糖基乳糖中的应用。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌，所述工程菌是在kosakonia sp. 菌株中敲除wcaj基因阻断gdp
‑
fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy使代谢流向2
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岩藻糖基乳糖。
8.优选的，所述岩藻糖基转移酶futc的序列经密码子优化，其核苷酸序列如seq id no.9 所示的第1171位至2073位所示。
9.优选的，所述岩藻糖基转移酶futc的5’端融合有麦芽糖结合蛋白mbp；所述麦芽糖结合蛋白mbp的核苷酸序列如seq id no.9所示的第1～1170位。
10.优选的，所述乳糖透过酶lacy的核酸序列如seq id no.10所示。
11.优选的，所述敲除wcaj基因的方法是基于crispr
‑
cas9的wcaj基因敲除。
12.优选的，基于crispr
‑
cas9的wcaj基因敲除具体方法是将含cas9基因的质粒以及质粒 pcb003
‑
wcaj
‑
lra转入kosakonia sp.菌中，所述pcb003
‑
wcaj
‑
lra构建过程如下：分别以seqid no.1与seq id no.2和seq id no.3和seq id no.4为引物对扩增敲除所需的上下游同源臂，并将上下游同源臂以重叠pcr的方法进行连接得到片段记为wcaj
‑
lra，以seq idno.5和seq id no.6为引物，pcb003为模板反向扩增获得pcb003
‑
wcaj
‑
n20，然后通过salⅰ和hindⅲ酶切位点将wcaj
‑
lra片段连入pcb003
‑
wcaj
‑
n20，得到pcb003
‑
wcaj
‑
lra。
13.优选的，异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy的方法，将含有岩藻糖基转移酶futc和乳糖透过酶lacy的表达载体转入kosakonia sp.菌中表达，所述表达载体构建过程如下：将seq id no.9所示序列通过ndeⅰ和ecorⅰ酶切位点连入质粒 pet28a
‑
tac，得到质粒pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc；再将seq id no.10所示序列通过ecorⅰ和sacⅰ酶切位点连入质粒pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc，得到含有岩藻糖基转移酶futc和乳糖透过酶lacy的表达载体；所述pet28a
‑
tac质粒为pet28a质粒上t7启动子替换为tac启动子。
14.2、利用kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，通过将kosakonia sp.菌株中敲除 wcaj基因阻断gdp
‑
fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc 和过表达乳糖透过酶lacy发酵合成2
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岩藻糖基乳糖，所述岩藻糖基转移酶futc的序列经密码子优化，其核苷酸序列如seq id no.9所示的第1171位至2073位所示；所述乳糖透过酶 lacy的核酸序列如seq id no.10所示。
15.优选的，所述发酵条件如下：在发酵培养基中，通过流加甘油和乳糖，通气量1.5m3/h，将溶氧控制在10％以上，发酵培养；所述发酵培养基各组分质量分数如下：4％甘油，0.8％胰蛋白胨，1.6％酵母浸粉，0.2％磷酸二氢钾，1.3％磷酸氢二钾。
16.3、所述重组菌在合成2
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岩藻糖基乳糖中的应用。
17.本发明的有益效果在于：本发明公开了基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌，该工程菌是在kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断gdp
‑
fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy；kosakonia sp.菌自身具有合成富含岩藻糖组分的岩藻多糖(fucopol)，菌株内gdp
‑
fucose池潜力巨大，为2
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岩藻糖基乳糖的产生提供了强大的岩藻糖基供体池，构建的工程菌稳定性好，合成的2
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岩藻糖基乳糖安全性好，能够用于食品和医药品的原料。
附图说明
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
19.图1为基于kosakonia sp.菌株的2
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岩藻糖基乳糖合成途径。
20.图2为wcaj敲除质粒图(a:pcb003
‑
wcaj
‑
n20；b:pcb003
‑
wcaj
‑
lra)；
21.图3为wcaj敲除验证图；
22.图4为异源通路搭建的质粒图谱(a：pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc；b：pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc
‑
lacy)。
23.图5为岩藻糖基转移酶的蛋白表达结果。
24.图6为kosakonia sp.底盘菌株的岩藻糖基乳糖的发酵验证。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
26.实施例1、基于kosakonia sp.菌株的2
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岩藻糖基乳糖合成新型底盘设计
27.kosakonia sp.cctcc m2018092菌株内具有完整的gdp
‑
fucose从头合成途径全基因，因此通过敲除wcaj基因从而阻断gdp
‑
fucose流向岩藻多糖途径，并通过异源表达来自幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc，过表达乳糖透过酶lacy以增强乳糖转运，从而生产2
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岩藻糖基乳糖(图1)。
28.实施利2、基于crispr
‑
cas9的wcaj基因敲除
29.利用kosakonia sp.cctcc m2018092基因组为模板，分别以引物wcaj
‑
la
‑
f/r， wcaj
‑
ra
‑
f/r(附表1)扩增敲除所需的上下游同源臂，并将上下游同源臂以重叠pcr的方法进行连接得到片段记为wcaj
‑
lra；以引物wcaj
‑
n20
‑
f，sgrna
‑
r(附表1)反向扩增pcb003 (applied and environmental microbiology,2015,2506
‑
2514:81)以突变敲除wcaj所需的n20 序列，构建带有wcaj
‑
n20的质粒记为pcb003
‑
wcaj
‑
n20(图2，a)；将salⅰ，hindⅲ双酶切的质粒pcb003
‑
wcaj
‑
n20与wcaj
‑
lra片段进行一步克隆重组，得到最终带有敲除wcaj基因所需n20序列以及上下游同源臂的质粒记为pcb003
‑
wcaj
‑
lra(图2，b)。
30.表1、wcaj基因敲除引物
[0031][0032][0033]
将带有cas9蛋白的质粒pcas(kan*)以及质粒pcb003
‑
wcaj
‑
lra(spc*)经电转化导入kosakonia sp.cctcc m2018092菌株中，并以壮观霉素、卡那霉素双抗平板进行转化子筛选。以引物wcaj
‑
yan
‑
f/r(附表对转化子进行验证，与对照条带相比更短说明是成功敲除转化子(图3)，经培养后送测序用于再次敲除验证。
[0034]
实施例3、基于岩藻糖基转移酶futc以及乳糖转运蛋白lacy的异源通路搭建
[0035]
通过敲除基因wcaj阻断了gdp
‑
fucose的下游利用途径，通过搭建新的gdp
‑
fucose转化途径可以达到生产岩藻糖基乳糖的目的。选择来自幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc(进行密码子优化后由金唯智公司进行全基因合成)，并融合表达来自大肠杆菌的麦芽
糖结合蛋白 (mbp)以增加异源蛋白的可溶性表达，密码子优化后mbp
‑
futc序列如(seq id no.9所示，第1～1170位为麦芽糖结合蛋白mbp，第1171位至2073位为岩藻糖基转移酶futc。以引物futc
‑
f/r(表2)扩增mbp
‑
futc，得到的片段与ndeⅰ，ecorⅰ双酶切的质粒pet28a
‑
tac 进行一步克隆连接(pet28a
‑
tac质粒为pet28a质粒上t7启动子替换为tac启动子，其他序列与pet28a一致)，构建的质粒标记为pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc(图4，a)。
[0036]
为了增强底盘菌株对底物乳糖的摄取能力，通过过表达菌株内源的乳糖转运蛋白lacy (seq id no.10)，以引物lacy
‑
f/r(表2)从kosakonia sp.基因组上扩增基因lacy片段，将得到的片段与ecorⅰ，sacⅰ双酶切的质粒pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc进行一步克隆连接，得到的最终质粒标记为pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc
‑
lacy(图4，b)。
[0037]
将pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc
‑
lacy质粒通过电转化的方法导入kosakonia sp.cctcc m2018092 菌株内。挑选单菌落于30℃，220rpm过夜培养。第二天以1％的接种量转接到30ml tb培养基中，30℃，220rpm培养至od600＝0.6左右时，冰上静止10
‑
15min后加入终浓度为0.1mm 的iptg，置于25℃，220rpm培养条件下，检测基因的蛋白表达水平。sds
‑
page表明异源表达的岩藻糖基转移酶在底盘宿主中有很好的可溶性表达水平(图5)。
[0038]
表2、岩藻糖基转移酶futc以及乳糖转运蛋白lacy通路构建引物
[0039][0040][0041]
实施利4、基于kosakonia sp.cctcc m2018092菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的发酵验证
[0042]
挑取上述构建成功的单菌落接种到tb培养基30℃，220rpm过夜培养。以1％接种量接种含有2％甘油以及0.6％乳糖的tb培养基，30℃，220rpm培养培养至od
600
＝0.6左右，冰上静止10
‑
15min，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导目的基因的表达，在25℃摇床发酵2 d，hplc检测2
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岩藻糖基乳糖的含量，结果显示kosakonia sp.cctcc m2018092菌株产生1.2 g/l的2
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fl(图6)；5l发酵罐上为以优化的发酵培养基(4％甘油，0.8％胰蛋白胨，1.6％酵母浸粉，0.2％磷酸二氢钾，1.3％磷酸氢二钾)，通过流加甘油和乳糖控制浓度分别为4％和0.6％乳糖，通气量1.5m3/h，通过转速联动自动调节转速在300～550rpm范围将溶氧控制在10％以上，2
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fl发酵产量达到20g/l以上。
[0043]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此，也适合以gdp
‑
fucose为供体的3
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fl的合成。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
技术特征：1.基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述工程菌是在kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断gdp
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fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy使代谢流向2
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岩藻糖基乳糖。2.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述岩藻糖基转移酶futc的序列经密码子优化，其核苷酸序列如seq id no.9所示的第1171位至2073位所示。3.根据权利要求2所述基于kosakonia sp.菌株生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述岩藻糖基转移酶futc的5’端融合有麦芽糖结合蛋白mbp；所述麦芽糖结合蛋白mbp的核苷酸序列如seq id no.9所示的第1～1170位。4.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述乳糖透过酶lacy的核酸序列如seq id no.10所示。5.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：所述敲除wcaj基因的方法是基于crispr
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cas9的wcaj基因敲除。6.根据权利要求5所述基于kosakonia sp.菌株生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：基于crispr
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cas9的wcaj基因敲除具体方法是将含cas9基因的质粒以及质粒pcb003
‑
wcaj
‑
lra转入kosakonia sp.菌中，所述pcb003
‑
wcaj
‑
lra构建过程如下：分别以seq id no.1与seq id no.2和seq id no.3和seq id no.4为引物对扩增敲除所需的上下游同源臂，并将上下游同源臂以重叠pcr的方法进行连接得到片段记为wcaj
‑
lra，以seq id no.5和seq id no.6为引物，pcb003为模板反向扩增获得pcb003
‑
wcaj
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n20，然后通过salⅰ和hindⅲ酶切位点将wcaj
‑
lra片段连入pcb003
‑
wcaj
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n20，得到pcb003
‑
wcaj
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lra。7.根据权利要求1所述基于kosakonia sp.菌株生产2
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岩藻糖基乳糖的重组菌，其特征在于：异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy的方法，将含有岩藻糖基转移酶futc和乳糖透过酶lacy的表达载体转入kosakonia sp.菌中表达，所述表达载体构建过程如下：将seq id no.9所示序列通过ndeⅰ和ecorⅰ酶切位点连入质粒pet28a
‑
tac，得到质粒pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc；再将seq id no.10所示序列通过ecorⅰ和sacⅰ酶切位点连入质粒pet28a
‑
tac
‑
mbpfutc，得到含有岩藻糖基转移酶futc和乳糖透过酶lacy的表达载体；所述pet28a
‑
tac质粒为pet28a质粒上t7启动子替换为tac启动子。8.利用kosakonia sp.菌株生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于：通过将kosakonia sp.菌株中敲除wcaj基因阻断gdp
‑
fucose流向岩藻多糖，同时异源表达幽门螺旋杆菌的岩藻糖基转移酶futc和过表达乳糖透过酶lacy发酵合成2
’‑
岩藻糖基乳糖，所述岩藻糖基转移酶futc的序列经密码子优化，其核苷酸序列如seq id no.9所示的第1171位至2073位所示；所述乳糖透过酶lacy的核酸序列如seq id no.10所示。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵条件如下：在发酵培养基中，通过流加甘油和乳糖，通气量1.5m3/h，将溶氧控制在10％以上，发酵培养；所述发酵培养基各组分质量分数如下：4％甘油，0.8％胰蛋白胨，1.6％酵母浸粉，0.2％磷酸二氢钾，1.3％磷酸氢二钾。10.权利要求1～7任一项所述重组菌在合成2
’‑
岩藻糖基乳糖中的应用。
技术总结本发明公开了基于kosakonia sp.菌株生产2
技术研发人员：邹祥 马巍 牛松峰
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2021.04.08
技术公布日：2021/6/25
