1.本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种从蚯蚓中提取血红蛋白的方法。
背景技术：2.蚯蚓血红蛋白，也称为蚯蚓胞外巨大血红蛋白，是广泛存在于蚯蚓体内的一种氧载体蛋白。根据目前的研究得知，其单体结构与人血血红蛋白的单体结构非常相似，且具有更强的氧气的携带运输能力。因此，作为一种重要的、潜在的新型血液替代品受到科学界的关注。
3.传统的大分子蛋白的提取中，双水相方法是一种常用的方法。当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐在特定的浓度比例下，或者是在一个特定的温度条件下，就会形成双水相系统。采用双水相分离的物质，会因为酸碱性、温度等条件的改变，自然分成互不相容的两相，从而达到分离的目的。但是传统的双水相方法，在用于蚯蚓血红蛋白的提取过程时，会发生提取不彻底、后续脱盐困难、条件控制难度较高、无法大规模生产等问题，因此，亟需开发一种适于蚯蚓血红蛋白提取的新方法。
技术实现要素：4.针对上述技术问题，本发明通过在双水相试验的基础上，探索出的适用于蚯蚓血红蛋白的提取的新方法，即开发了闪式提取技术和硫铵—聚乙二醇相结合的方法来提取蚯蚓血红蛋白。
5.本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
6.一种提取蚯蚓血红蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
7.(1)取保存于
‑
70℃冰箱中的吐沙洗净后的蚯蚓，置于冷水浴中隔水解冻；
8.(2)待蚯蚓块解冻至软化时，将其用剪刀预先剪碎成小块，装入不锈钢容器中；
9.(3)容器中加入预冷的二蒸水，调节蚯蚓与二蒸水的质量比例为1：1～3；
10.(4)将不锈钢容器放置在闪式提取仪的指定部位，开动机器进行闪式提取，得到粗提蚯蚓液；
11.(5)将粗提蚯蚓液置于高速离心机中，以10000rpm的转速，4℃的温度，离心30min，取上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；
12.(6)取粗提蚯蚓液的上清液，按一定比例加入预先调配好的聚乙二醇溶液与硫酸铵溶液，涡旋振荡，得到有絮状沉淀的混合液；
13.(7)将混合液置于离心机中，以5000rpm的转速，4℃的温度，离心10min，去除上清液，用二蒸水小心清洗沉淀上的残留的液体；
14.(8)将沉淀用与步骤(6)中混合液中加入的蚯蚓上清液等体积的二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；
15.(9)将蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥12
‑
24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。
16.在具体实施方案中，所述步骤(3)中蚯蚓与二蒸水的质量比例为1：1.5。
17.在具体实施方案中，所述步骤(4)中闪式提取共进行1～3次，每次提取持续25～40s，每次提取间隔为5～15s；优选地，闪式提取进行2次，每次提取持续30s，每次提取间隔为10s。
18.在具体实施方案中，所述步骤(6)中预先调配好的聚乙二醇溶液的质量分数为40％，硫酸铵溶液的质量分数为40％。
19.在具体实施方案中，进一步地，所述步骤(6)中与粗提蚯蚓上清液混合后聚乙二醇的终质量分数范围为11～19％，硫酸铵的终质量分数范围为4～8％。
20.优选地，所述聚乙二醇的终质量分数范围为14～16％，硫酸铵的终质量分数范围为5～7％。
21.更优选地，所述聚乙二醇的终质量分数范围为15％，硫酸铵的终质量分数范围为6％。
22.在具体实施方案中，所述步骤(6)中，聚乙二醇的聚合度可为2000或4000或6000，优选地，聚合度为4000。
23.本发明的有益效果：
24.1.本发明创造性的改变了双水相方法的条件，开发了闪式提取技术和硫铵—聚乙二醇相结合的方法来提取蚯蚓血红蛋白，并寻找到了能够使蚯蚓血红蛋白特定沉降的区间，即粗提蚯蚓上清液混合后聚乙二醇的终质量分数范围为11～19％，硫酸铵的终质量分数范围为4～8％，实现了高聚物盐法提取蚯蚓蚯蚓血红蛋白，具有方法简便、成本低和效率高的特点。
25.2.采用本发明提供的方法获得的蚯蚓血红蛋白的血红素质量占比为3.0％(理论值为3.1％)，提取的血红蛋白相对纯度为95％以上，能够最大程度保留蚯蚓血红蛋白的化学性质和物理性质，便于后续的进一步利用。
附图说明
26.图1为三种提取方法的对比，a：实施例1，6％的硫酸铵b：实施例2，15％的聚乙二醇c：实施例3，15％的聚乙二醇加6％的硫酸铵。
具体实施方式
27.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.按如下工艺流程进行蚯蚓血红蛋白提取：
29.(1)取保存于
‑
70℃冰箱中的吐沙洗净后的蚯蚓，置于冷水浴中隔水解冻；
30.(2)待蚯蚓块解冻至软化时，将其用剪刀预先剪碎成小块，装入不锈钢容器中；
31.(3)容器中加入预冷的二蒸水，调节蚯蚓与二蒸水的质量比例为1：1.5；
32.(4)将不锈钢容器放置在闪式提取仪的指定部位，开动机器进行闪式提取，提取两次，每次30s，每次间隔10s，得到无任何可见大块固体的粗提蚯蚓液；
33.(5)将粗提蚯蚓液置于高速离心机中，以10000rpm的转速，4℃的温度，离心30min，取上清液，上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；
34.(6)取粗提蚯蚓液的上清液，加入预先调配好的质量分数各为40％的聚乙二醇4000溶液与硫酸铵溶液，涡旋振荡器上振荡10s，得到有絮状沉淀的混合液；
35.(7)将混合液置于离心机中，以5000rpm的转速，4℃的温度，离心10min，去除上清液，用二蒸水小心清洗沉淀上的残留的液体；
36.(8)将沉淀用与步骤(6)中混合液中加入的蚯蚓上清液等体积的二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；
37.(9)将蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。
38.实施例1：蚯蚓血红蛋白的提取
39.冷冻蚯蚓隔水解冻，剪成小块，用闪式提取器以蚯蚓和二蒸水质量比例为1：1.5的料液比在110v提取两次，每次30s，每次间隔10s；将粗提蚯蚓液以10000rpm的转速，4℃离心30min，取上清液，上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；取粗提蚯蚓液的上清液，加入硫酸铵溶液至终质量分数为6％，涡旋振荡，以5000rpm的转速，4℃离心10min，去除上清液，用二蒸水清洗沉淀；将沉淀用二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。
40.实施例2：蚯蚓血红蛋白的提取
41.冷冻蚯蚓隔水解冻，剪成小块，用闪式提取器以蚯蚓和二蒸水质量比例为1：1.5的料液比在110v提取两次，每次30s，每次间隔10s；将粗提蚯蚓液以10000rpm的转速，4℃离心30min，取上清液，上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；取粗提蚯蚓液的上清液，加入聚乙二醇4000溶液至终质量分数为15％的，涡旋振荡，以5000rpm的转速，4℃离心10min，去除上清液，用二蒸水清洗沉淀；将沉淀用二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。
42.实施例3：蚯蚓血红蛋白的提取
43.冷冻蚯蚓隔水解冻，剪成小块，用闪式提取器以蚯蚓和二蒸水质量比例为1：1.5的料液比在110v提取两次，每次30s，每次间隔10s；将粗提蚯蚓液以10000rpm的转速，4℃离心30min，取上清液，上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；取粗提蚯蚓液的上清液，加入聚乙二醇4000溶液与硫酸铵溶液，使其终质量分数分别为15％与6％，涡旋振荡，以5000rpm的转速，4℃离心10min，去除上清液，用二蒸水清洗沉淀；将沉淀用二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。
44.结果分析：
45.实施例1，2和3中提取蚯蚓血红蛋白的状态如图1，实施例3可以看到形成了紧密的红色蛋白质沉淀，实施例2中虽也有沉淀，但沉淀为浮絮状，难以与液体完全分离，实施例1未能达到提取的效果。
46.实施例4：蚯蚓血红蛋白的提取
47.冷冻蚯蚓隔水解冻，剪成小块，用闪式提取器以蚯蚓和二蒸水质量比例为1：1.5的
料液比在110v提取两次，每次30s，每次间隔10s；将粗提蚯蚓液以10000rpm的转速，4℃离心30min，取上清液，上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；取粗提蚯蚓液的上清液，加入聚乙二醇4000溶液与硫酸铵溶液，至聚乙二醇4000终质量分数为15％，硫酸铵溶液终质量分数分别为4％、5％、6％、7％、8％，涡旋振荡，以5000rpm的转速，4℃离心10min，去除上清液，用二蒸水清洗沉淀；将沉淀用二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。
48.结果分析：
49.选取硫酸铵质量分数进行单因素实验，以提取后的考马斯亮蓝法测定的吸光度也即蛋白质浓度作为指标，来判断不同条件对蚯蚓血红蛋白的提取效果，实验结果见表1。吸光度值越低，证明杂蛋白含量越少，提取效果越好。可见质量分数为15％的聚乙二醇4000溶液与6％的硫酸铵溶液提取效果最好。
50.实施例5：蚯蚓血红蛋白的提取
51.冷冻蚯蚓隔水解冻，剪成小块，用闪式提取器以蚯蚓和二蒸水质量比例为1：1.5的料液比在110v提取两次，每次30s，每次间隔10s；将粗提蚯蚓液以10000rpm的转速，4℃离心30min，取上清液，上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；取粗提蚯蚓液的上清液，分别加入聚乙二醇4000溶液与聚乙二醇4000溶液，使其聚乙二醇4000终质量分数分别为11％、13％、15％、17％、19％，硫酸铵溶液的终质量分数为6％，涡旋振荡，以5000rpm的转速，4℃离心10min，去除上清液，用二蒸水清洗沉淀；将沉淀用二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。
52.结果分析：
53.选取聚乙二醇质量分数进行单因素实验，以提取后的考马斯亮蓝法测定的吸光度也即蛋白质浓度作为指标，来判断不同条件对蚯蚓血红蛋白的提取效果，实验结果见表2。吸光度值越低，证明杂蛋白含量越少，提取效果越好。可见质量分数为15％的聚乙二醇4000溶液与6％的硫酸铵溶液提取效果最好。
54.实施例6：蚯蚓血红蛋白的提取
55.取质量分数为15％的聚乙二醇4000溶液与质量分数为6％的硫酸铵溶液提取得到的蚯蚓血红蛋白，加入与粗提液量同体积的二蒸水进行沉淀的复溶，在涡旋振荡器上振荡使其充分溶解。取100ml的丙酮溶液加入3ml的浓盐酸配制为酸性丙酮溶液，低温4℃保存。以1：4的比例加入蚯蚓血红蛋白液与酸性丙酮溶液，振荡摇匀，可见有明显的白色沉淀的产生，溶液变为淡红色。此时，蚯蚓血红蛋白中的蛋白质成分被丙酮完全沉淀，蚯蚓血红素溶解入酸性丙酮溶液中。之后可以将蚯蚓血红素额酸性丙酮溶液进行旋转蒸发，挥发出里面的丙酮、盐酸成分，通过干燥获得蚯蚓血红素样品。
56.标准曲线建立：以氯化血红素为标准样品，称取5mg氯化血红素，加入100ml的酸性丙酮溶液中，获得50mg/l的血红素母液，以母液配制出1、2、3、4、5、6、7、8mg/l的血红素标准溶液，分别在385nm的波长下测量吸光度的值，绘制标准曲线。
57.测量方法：取样品溶液，稀释至合适的倍数，取取3ml左右放入石英比色皿中，以酸性丙酮溶液参比溶液，测量385nm波长下的吸光度，代入标准曲线中得到血红素的浓度，乘以稀释倍数就可以得到样品溶液中血红素的浓度，血红素吸光度为0.378。
58.通过稀释倍数计算，所提取的蚯蚓血红蛋白中血红素的质量占总蛋白质量的2.95％。与文献中的蚯蚓血红蛋白内血红素的占比为3.1％对比进行计算(文献zhu h,hargrove m,xie q,et al.stoichiometry of subunits and heme content of hemoglobin from the earthworm lumbricus terrestris.j biol chem,1996,271(47):29999
‑
30006.)，最终得到的蚯蚓血红蛋白的相对纯度为95％。
59.表1：硫酸铵终质量分数单因素实验结果
[0060][0061][0062]
表2：聚乙二醇终质量分数单因素实验结果
[0063]
技术特征：1.一种提取蚯蚓血红蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)取保存于
‑
70℃冰箱中的吐沙洗净后的蚯蚓，置于冷水浴中隔水解冻；(2)待蚯蚓块解冻至软化时，将其用剪刀预先剪碎成小块，装入不锈钢容器中；(3)容器中加入预冷的二蒸水，调节蚯蚓与二蒸水的质量比例为1：1～3；(4)将不锈钢容器放置在闪式提取仪的指定部位，开动机器进行闪式提取，得到粗提蚯蚓液；(5)将粗提蚯蚓液置于高速离心机中，以10000rpm的转速，4℃的温度，离心30min，取上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；(6)取粗提蚯蚓液的上清液，按一定比例加入预先调配好的聚乙二醇溶液与硫酸铵溶液，涡旋振荡，得到有絮状沉淀的混合液；(7)将混合液置于离心机中，以5000rpm的转速，4℃的温度，离心10min，去除上清液，用二蒸水小心清洗沉淀上的残留的液体；(8)将沉淀用与步骤(6)中混合液中加入的蚯蚓上清液等体积的二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；(9)将蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥12
‑
24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中蚯蚓与二蒸水的质量比例为1：1.5。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中闪式提取共进行1～3次，每次提取持续25～40s，每次提取间隔为5～15s；优选地，闪式提取进行2次，每次提取持续30s，每次提取间隔为10s。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中预先调配好的聚乙二醇溶液的质量分数为40％，硫酸铵溶液的质量分数为40％。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中与粗提蚯蚓上清液混合后聚乙二醇的终质量分数范围为11～19％，硫酸铵的终质量分数范围为4～8％。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇的终质量分数范围为14～16％，硫酸铵的终质量分数范围为5～7％。7.根据权利要求5
‑
6任一所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇的终质量分数范围为15％，硫酸铵的终质量分数范围为6％。8.根据权利要求1
‑
7任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，聚乙二醇的聚合度可为2000或4000或6000，优选地，聚合度为4000。
技术总结本发明公开了一种从蚯蚓中提取蚯蚓血红蛋白的工艺方法，用于生物制药领域。该工艺主要包括蚯蚓的前处理、蚯蚓血红蛋白的提取等主要流程。所描述的蚯蚓前处理主要使用闪式提取仪进行蚯蚓血红蛋白的粗提取；所描述的蚯蚓血红蛋白的提取的工艺流程使用的方法为高聚物盐法，将蚯蚓血红蛋白从混合物中分离纯化。本工艺流程相较于传统的工艺流程，具有操作流程简便、成本较低、提取效率高、提取效果好的特点，且产出的蚯蚓血红蛋白性状保持较好，可以用作后续的进一步开发。用作后续的进一步开发。用作后续的进一步开发。
技术研发人员：荣龙 余春红 逄冠翔
受保护的技术使用者：北京航空航天大学
技术研发日：2021.03.22
技术公布日：2021/6/25
