靶向抗生素敏感性测试的方法与流程

靶向抗生素敏感性测试的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求标题为“靶向抗生素敏感性测试的方法”并于2013年7月3日提交的美国临时申请第61/842827号的优先权，通过引用将其整体内容并入本文。
3.背景
4.本公开涉及确定样品中微生物细胞的抗生素敏感性的方法。本公开还涉及测量微生物细胞中的rna的方法。
5.耐药性病原体的出现是一种全球性医疗危机，其迫使医生使用更昂贵、更有效，有时是毒性更强的抗生素来治疗常见的传染病。不幸的是，新抗生素的药物开发已迅速减缓，从而导致缺乏新的药剂来治疗某些具有多重耐药性的生物体。主流的临床微生物学是缓慢且昂贵的，这是因为其仍依赖于细菌在琼脂板上生长形成菌落，这一耗时且劳动密集型方法需要熟练的技术人员，而这些技术人员正日益供不应求。样本采集后2
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3天通常无法获得抗生素敏感性数据，这已太晚而切实影响了抗生素的选择。迫切需要新的快速临床微生物学方法，其能够直接对临床标本中所发现的病原体进行鉴定并进行抗生素敏感性测试(ast)，这为临床医生提供了实时信息来应对传染病。
6.在没有迅速的微生物学诊断时，临床医生通常启用“经验性”抗生素治疗，即基于潜在的生物体的知识及其抗生素耐受模式来选择抗生素。用于菌血症的经验性抗生素通常是广谱抗生素以治疗多种可能的细菌病原体。广谱抗生素的过度使用通过向患者的微生物群施加选择性压力，并促进耐受生物体的定植而导致抗生素耐受性的出现。例如，将共同使用万古霉素(vancomycin)和哌拉西林
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他佐巴坦(piperacillin
‑
tazobactam)作为经验疗法已直接导致广泛出现耐受万古霉素的肠球菌(vre)以及产生广谱β
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内酰胺酶(esbl)的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)生物体。相比之下，真菌血症并不经常被怀疑或被治疗，直至接受抗菌剂的患者没有反应或经历临床恶化。有证据表明，使用早期且有效的抗生素疗法会改善患者的疗效并缩短住院时间。因此，快速鉴定致病生物体并施用适当的抗生素疗法的能力应导致改善患者的疗效，并降低医疗系统的整体成本。
7.概述
8.提供了基于检测来自暴露于抗生素之后的微生物细胞中的rna(如核糖体rna或转运信使rna)来进行抗生素敏感性测试的方法。在一些实施方案中，从样品中获得等分试样，其中之一含有所选择的抗生素。将含有生长培养基的等分试样在适合于微生物生长的条件下孵育，并将各个等分试样中的微生物细胞移出并裂解，将裂解物逆转录并扩增来推断所选择的抗生素对微生物细胞的效果。在一个实施方案中，在存在所选择的抗生素的情况下孵育含有微生物细胞的样品并提供刺激以诱导微生物细胞产生mrna。随后裂解微生物细胞，在裂解物中的mrna基本不降解，并且检测mrna以确定抗生素对微生物细胞的效果。
9.因此，在第一个方面中，提供了进行快速抗生素敏感性测试的方法，所述方法包括：
10.在第一裂解物上进行多重鉴定测试组，第一裂解物获自怀疑含有微生物细胞的第一样品；
11.从怀疑含有微生物细胞的第二样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样，其中主等分试样和参考等分试样含有生长培养基，并且其中第一样品和第二样品来自共同的受试者；
12.向主等分试样加入至少一种所选择的抗生素，所选择的抗生素至少部分地基于多重鉴定测试组的结果而选择；
13.在适合于促进微生物生长的条件下孵育主等分试样和参考等分试样，以测试所选择的抗生素的效力；
14.从主等分试样中分离微生物细胞并将所分离的微生物细胞重悬，以获得主悬浮物；
15.从参考等分试样中分离微生物细胞并将所分离的微生物细胞重悬，以获得参考悬浮物；
16.裂解主悬浮物和参考悬浮物中的微生物细胞，从而获得主裂解物和参考裂解物；
17.对主裂解物进行逆转录和扩增，以检测与通过多重鉴定测试组可检测的微生物细胞相关的核酸，从而获得主分析信号；
18.对参考裂解物进行逆转录和扩增，以检测与通过多重鉴定测试组可检测的微生物细胞相关的核酸，从而获得参考分析信号；
19.比较主分析信号和参考分析信号，以获得所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度。
20.在另一个方面中，提供了进行快速抗生素敏感性测试的方法，所述方法包括：
21.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样，其中主等分试样和参考等分试样含有生长培养基；
22.向主等分试样加入至少一种所选择的抗生素；
23.在适合于促进微生物生长的条件下孵育主等分试样和参考等分试样，以测试所选择的抗生素的效力；
24.从主等分试样中分离微生物细胞并将所分离的微生物细胞重悬，以获得主浓缩悬浮物；
25.从参考等分试样中分离微生物细胞并将所分离的微生物细胞重悬，以获得参考浓缩悬浮物；
26.裂解主浓缩悬浮物和参考浓缩悬浮物中的微生物细胞，从而获得主裂解物和参考裂解物；
27.对主裂解物和参考裂解物进行逆转录和扩增，以检测与微生物测试组成员相关的核酸，从而获得主分析信号和参考分析信号；
28.比较主分析信号和参考分析信号，以获得所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度。
29.在另一个方面中，提供了进行快速抗生素敏感性测试的方法，所述方法包括：
30.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得多个主等分试样和参考等分试样，其中主等分试样和参考等分试样含有生长培养基；
31.向各个主等分试样加入至少一种所选择的抗生素，使得至少两个主等分试样含有不同的所选择的抗生素；
32.在适合于促进微生物生长的条件下孵育主等分试样和参考等分试样，以测试所选择的抗生素的效力；
33.从主等分试样中分离微生物细胞并将所分离的微生物细胞重悬，以获得多个主悬浮物；
34.从参考等分试样中分离微生物细胞并将所分离的微生物细胞重悬，以获得参考悬浮物；
35.裂解主悬浮物和参考悬浮物中的微生物细胞，从而获得多个主裂解物和参考裂解物；
36.对主裂解物和参考裂解物进行逆转录和扩增，以检测与微生物组成员相关的核酸，从而获得多个主分析信号和参考分析信号；
37.比较主分析信号和参考分析信号，以获得所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度。
38.在另一个方面中，提供了进行快速抗生素敏感性测试的方法，所述方法包括：
39.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样，其中主等分试样和参考等分试样含有生长培养基；
40.向主等分试样加入至少一种所选择的抗生素；
41.在适合于促进微生物生长的条件下孵育主等分试样和参考等分试样，以测试所选择的抗生素的效力；
42.使主等分试样和参考等分试样中的微生物细胞接受经配置以诱导产生靶mrna的刺激，其中选择刺激使得敏感的和/或耐受的微生物细胞的mrna产生由于微生物细胞暴露于所选择的抗生素而改变；
43.裂解主等分试样和参考等分试样中的微生物细胞，获得主裂解物和次裂解物，其中以适合于避免各裂解物中的mrna大量降解的方式进行裂解，并且其中在与微生物细胞中响应刺激所产生的mrna的寿命相关的时间段进行裂解；
44.对主裂解物和参考裂解物进行逆转录和扩增以检测与微生物测试组成员相关的mrna，从而获得主分析信号和参考分析信号；
45.比较主分析信号和参考分析信号，以获得所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度。
46.在另一个方面中，提供了进行抗生素敏感性测试的方法，所述方法包括：
47.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样；
48.向主等分试样加入至少一种所选择的抗生素；
49.裂解获自主等分试样和参考等分试样的微生物细胞，从而获得主裂解物和参考裂解物；
50.对主裂解物进行逆转录和扩增，以检测与测试组成员相关的tmrna，从而获得主分析信号；
51.对参考裂解物进行逆转录和扩增以检测与测试组成员相关的核酸，从而获得参考分析信号；
52.比较主分析信号和参考分析信号，以获得所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度。
53.可以通过参考以下详述和附图来进一步理解本公开的功能和优势。
附图说明
54.现仅通过示例的方式，并参考附图描述实施方案，其中：
55.图1a是流程图，其示出了用于确定样品中的微生物细胞的抗生素敏感性的方法的实施例，其中微生物细胞的身份最初是基于鉴定组确定的，之后，将样品等分试样暴露于一种或多种抗生素，其中所述一种或多种抗生素是基于先前所确定的微生物细胞的身份选择的。在从等分试样中分离微生物细胞并裂解所分离的微生物细胞之后，进行逆转录和扩增分析，并将分析信号与获自参考等分试样的参考分析信号相比较来确定抗生素的效力。
56.图1b是流程图，其示出了用于确定样品中的微生物细胞的抗生素敏感性的方法的另一实施例，其中用于进行抗生素敏感性测试的样品最初在鉴定测试期间用生长培养基预孵育。
57.图1c是流程图，其示出了用于确定样品的抗生素敏感性的方法的实施例，其中用于进行抗生素敏感性测试的样品最初用抗生素吸收剂预孵育以去除最初存在于样品中的抗生素。
58.图1d是流程图，其示出了用于确定全血样品的抗生素敏感性的方法的实施例，其中最初去除悬浮有微生物细胞的液体中的至少一部分，以降低最初存在于样品中的抗生素的浓度。
59.图1e是流程图，其示出了用于确定全血样品的抗生素敏感性的方法的实施例，其中用于进行抗生素敏感性测试的样品最初用抗生素吸收剂预孵育以去除最初存在于样品中的抗生素。
60.图2a是流程图，其示出了用于确定样品中的微生物细胞的抗生素敏感性的方法的实施例，其中在一种或多种抗生素以及生长培养基存在的情况下，孵育样品等分试样，以及其中随后将微生物细胞分离、裂解并进行逆转录和扩增。通过比较分析信号和从参考等分试样获得的参考分析信号，确定抗生素的效力。
61.图2b是流程图，其示出了用于确定样品中的微生物细胞的抗生素敏感性的方法的实施例，其中在一种或多种抗生素以及生长培养基存在的情况下，孵育样品等分试样，以及其中随后将微生物细胞裂解并进行逆转录和扩增以检测转运信使rna(tmrna)。通过比较分析信号和从参考等分试样获得的参考分析信号，确定抗生素的效力。
62.图2c是流程图，其示出了基于将微生物细胞体内暴露于一种或多种抗生素进行抗生素敏感性测试的示例方法。
63.图3提供了流程图，其示出了用于确定样品中的微生物细胞的抗生素敏感性的快速mrna分析方法的实施例，其中mrna的产生与暴露于抗生素之后所施加的刺激相关。
64.图4a和4b示意性地描述了在存在相应的基因组dna(gdna)的情况下优先扩增mrna的方法。
65.图5是鉴定测试组，其中鉴定组的成员具有一种或多种对应的与其相关的抗生素。在一些实施方案中，此类鉴定
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抗生素对应信息(任选地还根据样品类型、感染类型(医院或社区所获得的)和医院病房来源来进行分类)可以用于选择一种或多种用于抗生素敏感性测试(作为反应测试)的抗生素而不需要医生来提供信息。
66.图6绘制了通过处理全血样品所获得的肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)的核糖体rna(rrna)和tmrna检测的实时逆转录pcr(实时rt
‑
pcr)信号，此方法包括裂解血细胞并添加生长培养基，并随后预孵育2小时。
67.图7示出了通过处理全血样品所获得的肺炎克雷伯菌rrna和tmrna的实时rt
‑
pcr的ct值的表，此方法包括裂解血细胞并添加生长培养基，并随后预孵育2小时。
68.图8绘制了通过处理全血样品所获得的肺炎克雷伯菌rrna检测的实时rt
‑
pcr信号，此方法包括裂解血细胞并添加生长培养基，并随后预孵育2小时，之后在暴露于或没有暴露于8μg/ml诺氟沙星或四环素的条件下孵育2小时。
69.图9示出了通过处理全血样品所获得的肺炎克雷伯菌rrna检测的实时rt
‑
pcr的ct值的表，此方法包括裂解血细胞并添加生长培养基，并随后预孵育2小时，之后在暴露于或没有暴露于8μg/ml诺氟沙星或四环素的条件下孵育2小时。
70.图10绘制了用不同探针对dnak mrna进行检测时所对应的实时rt
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pcr和pcr信号。
71.图11绘制了将微生物细胞暴露于不同剂量的抗生素2小时之后所对应的实时rt
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pcr和pcr信号。
72.详细描述
73.参考下述讨论的细节对本发明的各种实施方案和方面进行描述。下述描述和附图是说明性的，不应理解为限制本发明。在此描述了许多具体细节以提供对本发明的各种实施方案的透彻理解。然而，在某些情况下，为了提供本发明的实施方案的简洁描述，本发明并未提及公知常识或常规细节。
74.如本文所用，术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被解释为包括性的和开放式的，而不是排他的。具体而言，在本说明书和权利要求中使用时，术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”及其变型意味着包括指定的特征、步骤或组分。这些术语不应被解释为排除了其它特征、步骤或组分的存在。
75.如本文所用，术语“示例性”意味着“作为实例、例子或说明”，且不应被解释为优于或胜过本文所公开的其它配置。
76.如本文所用，术语“约”和“大约”意味着涵盖可能存在于数值范围的上限和下限中的变化，如在性质、参数和尺寸中的变化。除非另有规定，术语“约”和“大约”是指加或减25％或以下。
77.应当理解的是，除非另有说明，任何指定的范围或组都是所提及的单独的范围或组中的每个成员，以及其中所涵盖的每个可能的子范围或子组和与其中的任意子范围或子组相类似的情况的简略形式。除非另有规定，本公开涉及且明确包含子范围或子组的各个和每个特定成员和组合。
78.如本文所用，当与数量或参数一起使用时，术语“大约”是指跨越规定数量或参数约十分之一至十倍的范围。
79.如本文所用，术语“抗生素敏感性测试”是指测试抗生素对微生物细胞的效果，这是为了提供可以用于估计或确定涉及抗生素的体内疗法的成功的可能性的量度。
80.本公开提供了多种对基于微生物细胞鉴定而选择的抗生素进行快速抗生素敏感性测试的示例方法。本公开的一些示例性实施方案支持在培养结果可用之前于短时间内直接从患者样品中估计或确定敏感性或耐受性，从而切实影响在常规鉴定和抗生素敏感性结
果可用之前的抗微生物疗法。
81.根据一些实施方案，抗生素敏感性测试可以在首先获得与样品中微生物细胞的鉴定相关的信息之后进行(例如界、属、科、种、株，革兰氏染色状态或另一种鉴定特征，如属于微生物细胞的dna或rna的分子序列)，以使得可以选择一种或多种候选抗生素。
82.图1a示出了一个对基于初始多重鉴定测试组结果而选择的抗生素的效力进行此类快速评估的示例性方法。如图1a中的100所示，进行初始多重检测步骤，以鉴定第一样品中的微生物细胞，使得基于多重鉴定测试组的结果来鉴定微生物细胞。
83.测试组可以包括多种水平的鉴定，这包括例如用于界(例如真菌对细菌)、属、种、革兰氏染色状态(例如基于属于临床相关细菌种类的子集的核酸序列，组可以包括用于革兰氏阴性微生物物种和革兰氏阳性微生物物种的单独的测试)以及任选的株的多重测试。图5中示出了此类测试组的实例。因此，在一些实施方案中，当在含有给定类型的微生物细胞的样品中进行测试时，可以通过多重鉴定测试组提供多种形式的信息，例如革兰氏染色状态、属和种。例如，如图5所示，当分析给定的微生物细胞类型时，多重鉴定测试组的多项测试可以是阳性的，如关于界(例如细菌)的测试、基于革兰氏染色状态(例如革兰氏阳性)的测试、基于属(例如葡萄球菌(staphylococcus))的测试和基于种的测试(例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus))。因此，多重鉴定测试组不必提供直接的鉴定，而是可以按类似于革兰氏染色结果和形态测试结果的方式，提供一个或多个缩小可能的微生物细胞类型的范围的测试结果。
84.在一些实施方案中，初始测试可以是进行培养后的测试，这涉及需要更多数量的微生物细胞的测试模式。例如，如果样品是阳性血培养样品，可以采用如常规表型测试、荧光原位杂交和基于maldi的检测的方法(在某些情况下，可能有必要首先通过传代培养获得分离物)。
85.在本示例性实施方案中，进行初始多重鉴定测试和初始抗生素敏感性测试，使得鉴定结果和抗生素敏感性结果两者在常规培养结果之前可用。例如，在一些示例性实施方案中，可以基于直接的、未培养的样品进行本发明的方法。在其它示例性实施方案中，可以基于已经初始暴露于生长培养基并孵育的样品(但尚未通过常规培养如血培养或板基集落生长产生阳性培养结果)进行本发明的方法。
86.在其中样品是具有低计数的微生物细胞的未培养样品的实施方案中，可以根据各种各样的快速多重方法进行初始的多重鉴定测试，其中所选择的方法可取决于样品的性质。直接样品鉴定方法的实例包括分子方法如septifast test mgrade、sepsitest
tm
和方案。可以理解的是，也可以任选地使用非扩增方法，只要所采用的样品制备方法具有足够高的回收和/或如果样品中的微生物细胞计数足够高(例如，非扩增方法可用于尿液样品，其通常具有约>104cfu/ml的微生物细胞计数)。
87.在另一个实施例中，可以根据公开于美国专利公开第20140154687号(标题为“用于微生物样品预处理的装置和方法”，提交于2013年3月15日，通过引用将其整体并入本文)中的样品制备、裂解和/或检测方法进行未培养样品中的微生物细胞的鉴定。
88.简言之，根据美国专利公开第20140154687号的实施例，可以通过在样品预处理容器中任选的非微生物细胞(如血细胞)的初始选择性裂解以及随后离心样品以去除所产生
的碎片并浓缩微生物细胞来进行未培养样品的预处理。可以包括不混溶且浓稠的缓冲剂溶液以用于收集经预处理容器离心后由缓冲剂溶液形成的液体界面附近的微生物细胞。去除相当数量的上清液后，将所收集的微生物细胞重悬，并重新建立液体界面，去除至少部分的剩余悬浮物，而基本上不去除缓冲剂溶液和所收集的微生物细胞。可以进行一个或多个中间洗涤循环，之后提取经处理的样品，这即提供了“预处理的”样品。
89.然后将微生物细胞的提取的悬浮物进行裂解过程，之后通过多重核酸扩增进行鉴定。一个示例性裂解方法可包括去除细胞悬浮物中的潜在的pcr抑制剂和核酸酶，之后在可包括核酸酶抑制剂的裂解缓冲液中进行快速裂解方案，如存在或不存在超声波照射的珠击。这些方法涉及多个步骤和试剂，并且通常在进行pcr之前需要后续的纯化步骤。
90.在一个实施例中，可以采用电裂解法，如公开于美国专利公开第20140004501号(标题为“用于电样品制备的方法和设备”，提交于2013年1月25日)的电裂解法。这种方法涉及使细胞悬浮物经受微流体通道中的一连串脉冲电场。由薄的绝缘垫片隔开通道的上电极和下电极，以限定通道间隙。通道可以在入口和出口通道中使用阀门以协助在电裂解和处理过程中控制液体蒸发，从而维持处理过程中的通道内的适当压力，并控制流体暴露于电场和热效应。在两个电极上应用双极电脉冲序列，这在电室中建立了电场，产生液体的离子电流和焦耳热。在一个实施方案中，选择脉冲的振幅和数量，使得微生物细胞经受超过5kv/cm的电场并且在低于50ms内，通道温度达到至少120℃。已发现这样的条件适合于宽范围的微生物细胞类型的快速裂解。由于电脉冲序列的持续时间，以及因此伴随的焦耳热是短暂的，这一加热机制被称为“快速加热”。作用于细胞的电场和液体的快速加热的耦合效应导致微生物细胞裂解并且胞内分子(如蛋白质和核酸)从细胞中释放(“e
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裂解”)成为裂解物。此外，细胞的一些大分子内容物在电场应用和液体冷却之间的时段内可遭受转换。已发现这个过程(本文中鉴定为电处理(“e
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处理”))使得核酸(如rrna和gdna)更易被酶接近，从而提高了随后的核酸扩增过程的效率。此外，已发现e
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处理法使蛋白质和酶(如核酸酶和其它pcr抑制污染物)变性和/或失活。从而，可以采用组合的e
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裂解和e
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处理过程以产生现成的且适合于基于核酸的分析的裂解物。
91.在获得第一样品的裂解物后，进行多重核酸检测步骤以鉴定样品中的微生物细胞。在一个实例中，检测步骤可使用gdna，例如，如上所述的septifast test mgrade、sepsitesttm和方案所采用的扩增方法。在另一个示例性实施方案中，可以经逆转录和rrna的多重扩增来实现多重检测(如美国专利公开第20140154687号和美国专利公开第20140004501号公开的)。
92.再次参考图1a，在根据鉴定组鉴定了微生物细胞之后，可以根据步骤105
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135选择并使用一种或多种合适的抗生素用于抗生素敏感性测试。
93.在一个实施例中，基于所鉴定的微生物细胞，可以由医生来选择一种或多种所选择的抗生素。在此情况下，医生可以(至少)基于多重鉴定测试组和抗菌谱的结果来选择一种或多种所选择的抗生素。在此类实施方案中，因此，所选择的抗生素是基于医生所做的医嘱向患者开出的抗生素。此类实施方案可以涉及相当长的时间延迟，这是由于涉及鉴定结果与医生之间沟通的时间延迟以及涉及接收所选择的抗生素的选择的时间延迟。
94.在另一个示例性实施方案中，可以选择所选择的抗生素，而不需要医生的会诊或
提供信息(即不向医生提供鉴定结果并等待医生的抗生素选择)，并随后可以进行抗生素敏感性测试作为反应测试。在此类实施方案中，抗生素的选择可以基于将多重鉴定测试结果的多种组合与一种或多种抗生素关联起来的鉴定
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抗生素对应信息。此类关联的实例示于图5，其中多重鉴定测试组的结果的不同组合与一种或多种所选择的抗生素关联。
95.因此，可以理解的是，本发明的基于反应的实施方案不需要涉及用于处方/治疗目的的抗生素的选择，而是涉及可能由医生来选择的抗生素的确定。因此，可以开展所选择的抗生素的效力的评估(例如，根据步骤105
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130或根据本文所公开的其它方法或其变型)，而无需等待医生的反馈，这样可以快速评估抗生素的效力并将可行的信息与医生进行快速沟通。
96.在一些实施方案中，进一步根据样品类型、感染类型(医院或社区所获得的)和医院病房来源，或其它可能影响抗生素的选择的分类的一种或多种对鉴定
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抗生素对应信息进行分类。例如，图5所示的信息提供了测试结果的各个相关组合的相关抗生素，这可以提供为一系列的表格或作为复合表、决策树、电子表格，或例如作为数据集(包括可以被电子查询的数据库信息)，其中根据样品类型、感染类型(医院或社区所获得的)和/或医院病房来源来进一步划分相关的抗生素。这一与多重鉴定测试组的测试结果的给定组合相关的抗生素的进一步划分，可利于提供与医生所指定抗生素具有更高匹配可能性的抗生素选择。这一信息可以更新，例如周期性更新，以确保鉴定
‑
抗生素对应信息代表了当前的抗菌谱数据以及任选的当前医院爆发(或存在爆发风险)的耐受性微生物。
97.再次参考图1，在选择了一种或多种所选择的抗生素之后，在步骤105获得样品的至少两个等分试样，等分试样在以后被称为主等分试样和参考等分试样。如下所述，随后主等分试样用以暴露于所选择的抗生素且参考等分试样用作对照。在将所选择的抗生素添加到主等分试样之后，随后将主等分试样和参考等分试样孵育，并对分离自主等分试样和参考等分试样的微生物细胞进行逆转录和扩增，以确定所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度。进行此方法的步骤详述如下。
98.主等分试样和参考等分试样两者都含有生长培养基，其中生长培养基可以被添加到等分试样中，或可以在将样品分成等分试样之前添加到样品中。在测试组包括需氧和厌氧微生物细胞的情况下，可以提供至少两个主等分试样，且至少一个主等分试样提供以用于需氧生长，至少一个主等分试样提供以用于厌氧生长。
99.如步骤105所示，从第二样品获得主等分试样和参考等分试样，其中第一样品和第二样品两者同属于同一受试者或患者。第二样品和第一样品可以是单独的样品。例如，在全血样品的情况下，第二样品可以作为附加管(例如，另一个vacutainer
tm
管)而获得。在其它实施方案中，第二样品可获自第一样品，例如，作为第一样品的等分试样，或反之亦然。
100.如果在将样品分成等分试样之前将生长培养基添加到样品中时，样品可在适合于促进微生物生长(例如，合适的温度和环境)的条件下进行预孵育。类似地，如步骤105所示，等分试样可以在适合于促进微生物生长(例如，合适的温度和环境，且如果需要初始时间延迟，则持续时间超过至少一次微生物细胞倍增时间，例如至少0.5小时或至少1小时或2小时，以使微生物细胞达到对数期生长)的条件下进行预孵育。
101.此初始预孵育阶段非常适合于包含低数量的微生物细胞的未培养样品的抗生素敏感性测试。例如，在一些实例中，本文所述的预孵育步骤可以用于具有非常低数量微生物
细胞的样品的抗生素敏感性测试。例如，当患者是脓毒性状态时，样品如全血样品通常含有非常少的微生物细胞，如在一些情况下小于10个微生物细胞。在这样具有非常低计数的微生物细胞的情况下，将样品细分成多个等分试样的要求会产生问题，这是由于在采样过程中可能会出现统计误差，这可能会损害随后的等分试样之间的比较的准确性和数值(其中进行比较以确定添加到主等分试样中的一种或多种抗生素的效力，如下所述)。因此，可以采用预孵育阶段以在将样品分成等分试样之前增加微生物细胞的数量，使得各个等分试样中的微生物细胞的数量不容易出现统计采样变异。
102.图1b示出了一个示例性的可替换的进行预孵育的方法，其可以有利于在进行本方法的抗生素敏感性测试部分之前为微生物细胞的生长提供额外的时间。如步骤101所示，在步骤101中获得第一和第二样品，之后进行多重鉴定测试组。如上所述，第二样品可以是独立获得的(相对于第一样品)或可以是从第一样品中获得的(例如，作为第一样本的等分试样)。在步骤102中，将生长培养基添加到第二样品中(或者，第二样品可以被收集到包含生长培养基的器皿或容器)，并将第二样品在适合于微生物细胞生长的条件下进行孵育。
103.如步骤110所示，将一定量的一种或多种所选择的抗生素添加到主等分试样中(应注意的是，分隔样品以获得主等分试样的容器可以包含抗生素，使得样品被添加到抗生素中)。例如，可以根据已知的或标准化的值(如临床和实验室标准化研究所(clsi)的抗微生物敏感性测试标准中所引用的那些值)来确定所选择的抗生素的量。在另一个实施例中，可基于抗菌谱数据来确定所选择的抗生素的量。
104.因此，将一种或多种所选择的抗生素添加到主等分试样中(或添加到两个或更多个主等分试样中)，且将至少一个其它的等分试样用作无抗生素的参考等分试样。虽然本文提供的示例性实施方案描述了所选择的抗生素的单一量或浓度的测试，但应当理解的是，可以测试所选择的抗生素的多个量或浓度(例如顺序的或同时的)。例如，样品可以制备成多个等分试样，使得为每个抗生素的量或浓度提供至少一个等分试样。有多个抗生素浓度的实施方案可以促进与抗生素的效力相关的最小抑制浓度或其它量度的测量、确定或评估。
105.如步骤115所示，然后在适合于微生物生长的条件(即使得在孵育期间微生物细胞在无抗生素存在的情况下生长)下孵育等分试样。例如，可以将微生物细胞于合适的温度(例如37℃)、在存在适合于生长(存在或不存在设计用来抑制抗生素的作用的培养基，如下所述)的生长培养基(例如培育培养基)的情况下孵育。可以将微生物细胞于合适的温度(例如37℃)，在如描述的样品中(如直接在含有合适的抗凝血剂的血液中)孵育。
106.在一些实施方案中，主等分试样与所选择的抗生素孵育的持续时间可以至少部分地基于微生物细胞各自的倍增时间和抗生素作用的模式。例如，干扰细胞壁合成的抗微生物剂阻断肽聚糖的合成，且细胞死亡的机制是通过因细胞壁的缺陷或弱化而导致的细胞裂解。因此，细胞壁合成抑制剂仅针对生长的细菌具有活性。细胞死亡机制并不是立即的且涉及许多活性的细胞过程。干扰dna合成的抗微生物剂例如能结合dna旋转酶
‑
dna复合物并在dna复制过程中通过dna旋转酶干扰破损dna链的修复，导致立即的抑菌作用，随后导致细胞死亡。
107.在一些实施方案中，将主等分试样与所选择的抗生素孵育一段时间，此段时间应足够长，使得抗生素在敏感性微生物细胞中诱导出代谢响应，此代谢响应影响在进行从等
antimicrobial drug action,2005,p.96)。在一些情况下，细胞周期的控制受tmrna的合成和降解的时机严格调控(robert a.meyers,rna regulation,2014,p.68)。因此，tmrna可以被选为确定细菌细胞的生存能力的合适的靶标。如下述实施例1和2所示，已示出即使在相对短的暴露时间(例如，1
‑
2小时)之后，当主等分试样中的微生物细胞对所选择的抗生素敏感时，主分析信号的tmrna rt
‑
pcr信号显著低于参考分析信号。
115.本文所述的示例性方法非常适合于在常规培养结果(例如血培养物，或其它样品如尿、痰、脑脊髓液的培养物)可用之前，进行样品的快速鉴定和抗生素测试。例如，可以采用此类快速的、预培养鉴定和抗生素敏感性测试方法学的结果以通过缩小初始开出的广谱抗生素的谱来改良抗微生物疗法(即快速缩小广谱治疗的范围)，同时还测试了根据改良的抗微生物疗法所选择的抗生素的效力。对于已开始抗微生物疗法的情况，这种方法提供了抗微生物疗法的指导性的和快速的再定向。或者，在测试结果可用之前尚未开始抗微生物疗法的情况中，可以采用本文所公开的方法以提供避免使用广谱抗生素的指导性初始疗法。避免使用或滥用广谱抗生素的能力可有益于降低与广谱抗生素使用相关的副发病变和增加的死亡风险。例如，可以采用此类策略以支持治疗的递送来避免或降低与广谱抗生素使用相关的毒性的风险、因消灭天然菌群引起的继发性感染的风险和出现抗生素耐受性的风险。
116.在某些情况下，获得的样品可以包括在样品收集之前施用给受试者的抗生素。在此类情况下，在将主样品与所选择的抗生素孵育之前，提取至少部分的抗生素，这可能是有益的。图1c示出了在获得主等分试样之前将抗生素吸收剂添加到第二样品的示例性实施方案。
117.在步骤103中，将生长培养基和抗生素吸收剂添加到第二样品中，并将第二样品在适合促进微生物细胞生长的条件下孵育。在一些实施方案中，此预孵育步骤可以持续进行一段时间，如0.5小时至1小时，1小时至2小时，2小时至3小时，3小时至4小时，或多于4小时，这取决于该抗生素吸收剂的效力和浓度。此外，虽然如图1c所示，步骤103在进行多重鉴定测试组之后出现，但其也可以在步骤100之前进行。抗生素吸收剂的实例是活性碳颗粒和抗生素结合树脂(例如阳离子交换树脂和聚合物吸收树脂)，其是本领域技术人员公知的。此类抗生素吸收剂已经被证明在0.5至2小时的持续时间内降低常用抗生素的残留活性。
118.如步骤104所示，在获得第一和第二等分试样之前，使用诸如离心或过滤的方法将抗生素吸收剂去除。
119.现在参考图1d，其描述了当样品是全血样品时，用于确定所选择的抗生素的效力的示例性方法。在步骤111中进行多重鉴定测试组之后(或在此步骤之前)，将血裂解剂添加到第二全血样品中，以实现至少一些存在于样品中的血细胞的裂解。
120.在添加血裂解剂并将血裂解剂与样品混合后，去除至少部分的所获得的混合物，而不去除并保留微生物细胞。这可以通过例如过滤或离心来实现。例如，可以将混合物离心，任选地在存在如美国专利公开第20140154687中所述的缓冲剂溶液的情况下离心，并可将至少部分的上清液去除。例如，根据不同的实施例，被去除的上清液的部分可为50％至75％，75％至90％，90％至95％和多于95％。
121.在去除步骤之后，将生长培养基添加到剩余的悬浮物中，使得微生物细胞重悬于生长培养基。不希望受理论的限制，存在怀疑的是，血细胞的部分裂解改善了样品中的微生
物细胞的生长。然后，此重悬样品可以在如步骤112所示的适合于促进微生物细胞生长的条件下孵育，例如，持续时间为1至2小时或例如2至3小时。
122.在一个实施例中，每约1ml全血的血细胞裂解剂的组成可以提供如下：约100μl体积的水性溶液，其具有浓度为约40mg/ml的皂素(84510，sigma)、约10mg/ml的聚茴香磺酸钠(sps)(p2008，sigma)和按体积计约1％的聚丙二醇(ppg)mw 2000(202339，sigma)。在将血裂解剂与全血样品混合后，皂素、sps和ppg的终浓度分别是约3.6mg/ml、0.9mg/ml和0.09％。
123.在一个实施例中，全血和血裂解剂混合后的皂素和sps的浓度可以分别在约1.0至10mg/ml的范围和0.5至2mg/ml的范围。
124.在另一个实施例中，用于裂解约1ml全血的血细胞裂解剂的组成可以提供如下：约100μl体积的水性溶液，具有浓度为按体积计约1.5％的tritonx
‑
100(x
‑
100，sigma)、约18mg/ml的聚茴香磺酸钠(sps)(p2008，sigma)和按体积计约1％的聚丙二醇(ppg)mw2000(202339，sigma)，缓冲ph范围为5至11。在血裂解剂与全血样品混合后，tritonx
‑
100、sps和ppg的终浓度分别是约0.14％、0.55mg/ml和0.03％。
125.在一个实施例中，裂解剂和全血样品混合后的tritonx
‑
100和sps的浓度可以分别在约0.05％至0.5％的范围内以及在0.2至2mg/ml的范围内。如上所述，初始暴露于血裂解剂并随后去除至少部分的混合物(同时保留微生物细胞)，这可有益于促进生长而不显著损害微生物细胞的生存能力，并且还可有益于浓缩剩余的悬浮物。此外，可以采用被去除的混合物的量和随后添加的生长培养基的量，以实现在采样时已存在于样品中的抗生素的稀释(例如，实现不希望的抗生素的至少50％、75％、90％或95％的稀释)。
126.在进行初始血裂解步骤之后，如上所述，根据步骤113至115，获得并孵育等分试样。
127.然后可以分离主等分试样和参考等分试样中的微生物细胞，其中在分离步骤前，将血裂解剂添加到各个等分试样中，以实现裂解至少一些可能仍存在于等分试样中的血细胞。例如，可以提供美国专利公开第20140154687号中所述的血裂解剂。
128.例如，在一个实施例中，每约1ml全血的血细胞裂解剂的组成可以提供如下：约500μl体积的水性溶液，具有浓度为约75mg/ml的皂素(84510，sigma)、约15mg/ml的聚茴香磺酸钠(sps)(p2008，sigma)和按体积计约1％的聚丙二醇(ppg)mw2000(202339，sigma)。在血裂解剂与全血样品混合后，皂素、sps和ppg的终浓度分别是约25mg/ml、5mg/ml和0.3％。
129.在一个实施例中，在全血与血裂解剂混合后，皂素和sps的浓度可以分别在约1.5至80mg/ml的范围内以及在0.5至20mg/ml的范围内。在另一个实施例中，皂素和sps的浓度可以分别在约10至30mg/ml的范围内以及在2.5至10mg/ml的范围内。
130.在另一个实施例中，用于裂解约1ml全血的血细胞裂解剂的组成可以提供如下：约500μl体积的水性溶液，具有浓度为按体积计约1.5％的tritonx
‑
100(x
‑
100，sigma)、约18mg/ml的聚茴香磺酸钠(sps)(p2008，sigma)和按体积计约1％的聚丙二醇(ppg)mw2000(202339，sigma)，缓冲ph的范围为5到11。在血裂解剂与全血样品混合后，tritonx
‑
100、sps和ppg的终浓度分别是约0.5％、6mg/ml和0.3％。在一个实施例中，在裂解剂与全血样品混合后，tritonx
‑
100和sps的浓度可以分别在约0.1％至1.5％的范围内以及在1至10mg/ml的范围内。
131.在添加血裂解剂后，可以采用如过滤或离心的方法来分离微生物细胞。例如，可以通过离心，以及任选的洗涤(按照美国专利公开第20140154687号中公开的方法)来分离微生物细胞。然后，根据步骤125至135，如上所述，裂解并分析所分离的微生物细胞。
132.如图1e所示，可以提供另外的步骤来实现在采样时已存在于样品中的抗生素的存在或活性的进一步降低。例如，如步骤116和117所示，可以以类似于上文结合图1c的描述的方式添加抗生素吸收剂，并随后从微生物细胞的悬浮物中去除。
133.上述示例性实施方案可有益于解决如下的采样问题。分离步骤可以采用离心浓缩(或过滤浓缩并随后重悬)微生物细胞，使得可以使用足够体积的粗样品，而不受下一阶段中的样品尺寸所施加的约束的限制。例如，约1ml或更小的较小样品尺寸对于自动分析步骤是可取的，而检测极限低至约1cfu/ml要求样品体积远大于1ml。第二点，第二样品(和/或等分试样)与生长培养基预孵育允许增加微生物细胞的数量，从而降低了系统对统计抽样误差的灵敏度。第三点，在抗生素敏感性测试之前进行的多重鉴定测试组通常将候选抗生素的数量限制到低的数量，如1种、2种或3种候选抗生素(根据治疗设施的抗菌谱)。此外，当考虑治疗设施的抗菌谱时，相关抗生素测试浓度的数量可以减少到一种浓度，或可能两种或三种浓度。第四点，采用rna作为检测目标将最小化因rna分子的高拷贝数引起的裂解后抽样误差。如本文所公开，选择用于核酸扩增检测的靶rna分子可以选择为核糖体rna(rrna)、转运信使rna(tmrna)或丰富的信使rna。
134.图2a示出了一个示例性实施方案，其中进行抗生素敏感性测试而不需要进行初始的多重鉴定测试组。如步骤200所示，从样品中获得2个或更多个主等分试样，并还获得至少一个参考样品。初始样品可任选地在获得等分试样之前与生长培养基进行初始孵育，或如步骤205所示，任选地等分试样与生长培养基孵育，以提高等分试样中存在的微生物细胞的数量。
135.在步骤210中，将一种或多种抗生素添加到各个主等分试样中，使得主等分试样中的至少2个包括不同的抗生素。因此，用不同的抗生素组测试主等分试样，且其中2个或更多个主等分试样可包括相同抗生素的不同浓度。如图1a的步骤115至125所述来进行步骤215至225，以处理等分试样并获得来自各个等分试样的裂解物。
136.在步骤230中，对主裂解物和次裂解物进行逆转录和扩增，以检测与来自测试组的微生物细胞的存在相关的基于rna的核酸序列。例如，测试组可以是一组临床相关的革兰氏阳性、革兰氏阴性和真菌微生物细胞。所检测的核酸序列是来自测试组的成员的核酸序列的集合中的任一个，其可以包括组成测试组的微生物细胞类型特异的一种或多种序列。所检测的一种或多种核酸序列可以包括在2个或更多个测试组成员之间的保守的序列。然后比较自主裂解物和次裂解物所获得的分析信号，以确定抗生素的效力，而不用鉴定存在于样品中的微生物细胞。当迫切需要初始抗生素效力信息时，这样的实施方案可能是有用的，这是因为其不需要等待初始多重鉴定测试组的进行。
137.图2b示出了经用于检测tmrna的逆转录和扩增，进行抗生素敏感性测试的示例性方法，其中方法可以在有或没有通过多重鉴定测试组的微生物细胞的初始鉴定的情况下来进行。图2b中后续步骤与图2a所公开的相类似。在步骤255中，对主裂解物和参考裂解物进行逆转录，以检测与属于测试组的微生物细胞相关的tmrna。在步骤260中，然后比较主分析信号和参考分析信号以确定所选择的抗生素的效力。
138.图2c示出了可替代的示例性实施方案，其中基于将微生物细胞体内暴露于所指定的抗生素来进行抗生素敏感性测试。在步骤400中，从患者或受试者获得第一样品，其中样品怀疑含有微生物细胞。然后如上所述进行快速多重鉴定测试组以获得关于微生物细胞身份的信息。例如，可以采用公开于美国专利公开第20140154687号和美国专利公开第20140004501号的样品制备、分离和裂解方法。
139.在步骤410中，基于鉴定组的结果选择一种或多种抗生素。例如，可以采用前述任一的抗生素选择的方法。
140.在向患者或受试者指定一种或多种抗生素之后，且在体内孵育延迟过去之后(例如，小于1小时、1小时至2小时、2小时至3小时、3小时至4小时或多于4小时的时间延迟)，在步骤415获得第二样品。
141.然后在步骤420测试第二样品以确定由于将微生物细胞与给患者所指定的抗生素体内孵育所引起的分析信号的变化。此测试可以是相同的多重鉴定测试组。在另一个实施方案中，测试组可以是原来的鉴定测试组的子集，其基于测试第一样品时呈阳性的测试中的一个或多个。最后，在步骤425中，比较第一测试和第二测试中的分析信号以确定所指定的抗生素对微生物细胞是否有效。
142.在下述另一个示例性实施方案中，用于在快速时间段上探测细胞的mrna含量的方法用以确定或估计微生物细胞的抗生素敏感性。下述的示例性实施方案提供了这样的方法，其涉及基于响应刺激所产生的靶mrna的转录状态(例如数量或浓度)，来评估或确定微生物细胞对抗生素的敏感性水平。与已知的抗生素敏感性测试的方法不同的是，本公开的实施方案支持了在很短时间内从患者样品直接确定敏感性或耐受性，从而切实影响治疗选择。
143.根据一些实施方案，可以在首先获得与样品中微生物细胞鉴定相关的信息(例如，属、种、界、革兰氏染色状态或另一种鉴定特征如属于微生物细胞的dna或rna的分子序列)之后，进行抗生素敏感性测试，使得可以选择一种或多种候选的抗生素(如上所述)。然后将微生物细胞接触所选择的抗生素(例如提供包括微生物细胞和抗生素的悬浮物，如血样品或液体血液培养基)并在这样的条件下进行孵育，其支持微生物细胞在没有抗生素(和任选地存在抗生素，例如在耐受性微生物细胞的情况下)的情况下生长。将微生物细胞与抗生素孵育一段时间，此段时间应足够长，使得抗生素在敏感性和/或耐受性微生物细胞中诱导响应如转录响应、表型响应或代谢响应(例如从约0.5小时至约2小时)。在微生物细胞接触抗生素后，裂解微生物细胞以释放靶mrna，其随后被检测以评估微生物细胞对抗生素的敏感性。
144.与已知的抗生素敏感性测试的方法不同，诱导的微生物细胞对于抗生素的响应不需要涉及细胞死亡或细胞生长缺失，但可涉及在暴露于抗生素后表明微生物细胞的长期生存能力的响应。例如，微生物细胞对于抗生素的响应可以包括与长期生存能力丧失相关的代谢变化，如抑制或阻止微生物细胞的繁殖和/或响应刺激而表达给定mrna的能力。
145.在一些实施方案中，可以为给定的生物体和抗生素选择靶mrna，使得细胞内mrna的产生直接与微生物细胞对于抗生素的耐受性和/或敏感性相关，并且其中微生物细胞暴露于抗生素，这在靶mrna的细胞内浓度上产生快速的改变。
146.可以选择靶mrna使得所诱导的细胞内mrna的产生在暴露于抗生素的数秒或数分
钟内发生。例如，微生物细胞可以对抗生素有耐受性，并且微生物细胞暴露于抗生素的响应可涉及，支持微生物细胞暴露于抗生素时的生存能力的靶mrna的产生。可以检测此类靶mrna以确定微生物细胞的耐受性性质。在另一个实例中，微生物细胞可对抗生素是敏感的，并且微生物细胞暴露于抗生素的响应可涉及，表明微生物细胞暴露于抗生素时生存能力下降的靶mrna的产生。可以检测此类靶mrna以确定微生物细胞的敏感性性质。
147.可以裂解微生物细胞以释放靶mrna，使得靶mrna在裂解物中保持稳定，并可以进行分析以确定与裂解物中mrna的存在或数量相关的量度。裂解和mrna分析也可在尚未暴露于抗生素的样品等分试样中进行，并且可以比较获自两个等分试样的量度以确定或估计微生物细胞对抗生素的敏感性。
148.在其它实施方案中，可以选择靶mrna，使得其产生间接地与微生物细胞暴露于抗生素相关。选择刺激和靶mrna，使得敏感性和/或耐受性微生物细胞的mrna的产生因微生物细胞暴露于抗生素而变化。例如，可以选择的靶mrna是由响应刺激的活细胞(或例如在生长期的细胞)所产生的mrna，使得在暴露于抗生素之后敏感性微生物细胞中的靶mrna的产生降低了，而在耐受性微生物细胞中靶mrna的产生基本上未变化。根据此类实施方案，在将微生物细胞暴露于抗生素一段时间(此段时间应足够长，使得敏感性和/或耐受性微生物细胞对抗生素的存在产生表型、代谢或其它的响应)之后，微生物细胞可接受与微生物细胞中的靶mrna的产生相关的刺激。
149.然后，微生物细胞可以被快速裂解以释放靶mrna，使得靶mrna在裂解物中保持稳定(即裂解时裂解物中的靶mrna基本上不降解)，并可以进行分析以确定与裂解物中的靶mrna的存在或数量相关的量度。还可以在未暴露于抗生素的等分试样中进行刺激、裂解和mrna分析，并且可以比较获自两个等分试样的量度以确定或估计微生物细胞对抗生素的敏感性。
150.如上所述，通过以基本上稳定形式呈现靶mrna的方式进行快速细胞裂解来释放可检测形式的靶mrna，使得靶mrna随后被检测到而没有显著降解。响应抗生素或刺激的存在的mrna的产生可以发生在快速的时间段中，如数秒或数分钟的时间段。因此，在一些实施方案中，在与微生物细胞中靶mrna的产生相关的一段时间内(例如在与微生物细胞内产生的靶mrna的寿命相关的时间段，例如在约30秒至10分钟内)进行微生物细胞的裂解，使得所释放的和所检测的mrna表示了微生物细胞对抗生素存在或刺激应用的响应。
151.本领域技术人员可以理解，许多常规的裂解方法都不能满足下述双重限制：(a)在与响应抗生素或所应用的刺激的微生物细胞内的靶mrna的产生相关的持续时间中进行裂解，以及(b)产生裂解物，其中靶mrna是稳定的。
152.一个示例性裂解方法可涉及去除细胞悬浮物中潜在的pcr抑制剂和核酸酶，再通过在可包括核酸酶抑制剂的裂解缓冲液中进行快速裂解方案(如有或没有超声波照射的珠击)。不幸的是，这些方法涉及多个步骤和试剂，并且通常需要在进行pcr之前进行随后的纯化步骤。
153.在一个实施例中，可以通过美国专利公开第20140004501号公开的快速电裂解法来满足上述双重裂解限制。这样的方法提供了在比靶mrna产生的时间段短得多的时间段上的快速电裂解，并还提供了适合于保持靶mrna处于稳定形式(由于核酸酶的失活)的裂解物。
154.现参考图3，根据一个实施方案，提供的流程图示出了进行微生物敏感性测试的示例性方法，其中在将样品中的微生物细胞暴露于抗生素之后，应用外部刺激，其中提供刺激以诱导微生物细胞内的mrna的产生，且其中随后微生物细胞被裂解用以基于mrna的检测来评估抗生素敏感性。在本发明的非限制性示例性方法中，使用美国专利公开第20140004501号中公开的电裂解法进行裂解。
155.在步骤310中，测试样品中病原性微生物细胞的存在和身份。此步骤可以根据多种方法来进行，其中所选择的方法取决于样品的性质。例如，如果样品是阳性血培养样品，可以使用如常规表型测试、荧光原位杂交和基于maldi的检测的方法(在某些情况下，可有必要首先通过传代培养获得分离物)。如果样品未进行培养，可以使用分子方法如septifast test mgrade、sepsitest
tm
和方案，进行直接的样品鉴定。在另一个实施例中，可以如上所述根据美国专利公开第20140154687号公开的方法进行微生物细胞的鉴定。
156.然后在步骤312中进行抗生素选择。可以根据已知的方法进行抗生素选择，例如基于已证明对所鉴定的微生物细胞有效的公开或已知的抗生素和/或基于抗菌谱。尽管本文提供的示例性实施方案涉及一种抗生素的选择和检测，但是应当理解的是，还可以测试多种抗生素。
157.在步骤314中，获得样品的至少两个等分试样。例如，可以根据已知或标准化的值(如在临床和实验室标准化研究所(clsi)的抗微生物敏感性测试标准中所引用的那些值)来确定所选择的抗生素的预定量。可以将抗生素添加到一个等分试样中，并使用至少一个其它的等分试样作为无抗生素的对照。虽然本文提供的示例性实施方案描述了所选择的抗生素的单一量或浓度的测试，但应当理解的是，可以测试所选择的抗生素的多个量或浓度(例如顺序的或同时的)。例如，样品可以制备成多个等分试样，使得为每个抗生素的量或浓度提供至少一个等分试样。有多个抗生素浓度的实施方案可以促进与抗生素的效力相关的最小抑制浓度或其它量度的测量、确定或评估。
158.然后，如步骤316所示，在适合于微生物生长的条件(即，使得微生物细胞在孵育期间在不存在抗生素的情况下生长)下孵育样品等分试样。例如，可以在合适的温度(例如37℃)在适合于生长的培育培养基(无旨在抑制抗生素作用的培养基)中孵育微生物细胞。在另一个实例中，可以将微生物细胞于合适的温度(例如37℃)，在如描述的样品中(如直接在含有合适的抗凝血剂的血液中)孵育。
159.在一些实施方案中，暴露于抗生素的合适的时间可以至少部分地基于微生物细胞的各自的倍增时间和抗生素的作用模式。例如，干扰细胞壁合成的抗微生物剂阻断肽聚糖的合成，且细胞死亡的机制是通过因细胞壁的缺陷或弱化而导致的细胞裂解。因此，细胞壁合成抑制剂仅针对生长的细菌具有活性。细胞死亡机制并不是立即的且涉及许多活性的细胞过程。干扰dna合成的抗微生物剂例如能结合dna旋转酶
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dna复合物并在dna复制过程中通过dna旋转酶干扰破损dna链的修复，导致立即的抑菌作用，随后导致细胞死亡。
160.根据本发明的示例性方法，在步骤318处理各个等分试样，使得分离微生物细胞并任选地浓缩于裂解缓冲液中，从而获得各个等分式样的微生物细胞的悬浮物。可使用任何的合适的方案进行分离，如美国专利公开第20140154687号公开的方案。
161.应当理解的是，本发明的示例性方法仅提供了一个实施例，可以进行其它方法来
分离以及任选地浓缩微生物细胞。
162.在步骤320中，各个悬浮物都接受了所选择的用以诱导微生物细胞内的靶mrna的产生的刺激。可以选择靶mrna和刺激，使得响应刺激的mrna的产生因暴露于抗生素而发生变化。例如，所选择的靶mrna可以是活细胞响应刺激所产生的mrna，使得在暴露于抗生素之后降低了敏感性微生物细胞中的靶mrna的产生，而在耐受性微生物细胞中靶mrna的产生基本上未变化。此刺激可以是任何导致产生靶mrna的刺激，如物理、化学或电刺激。下述提供靶mrna和相关刺激的实例。
163.然后，根据美国专利公开第20140004501所述的方法，如上所述在步骤322中进行各个悬浮物的电处理。电处理方法裂解微生物细胞，并且也使得细胞内rrna和基因组dna易于与外来的酶相作用。如上所述，电处理方法也在此步骤中提供了电处理，其基本上使抑制随后的扩增和检测的酶或因子失活。
164.在步骤324中，将裂解物与合适的预混(master mix)相混合，并进行逆转录用以将裂解物中的mrna转录成相应的cdna。预混可包含用于对cdna进行pcr扩增循环的组分。然后通过扩增方法如pcr(或其变型)进行经转录的cdna的扩增。最后，在步骤328中检测扩增子并在步骤330中比较它们的水平(对应于2个等分试样)以判断抗生素的敏感性。
165.可以进行mrna的扩增和检测而不去除相应的gdna。在一个实施方案中，可以使用在低温(rt温度的范围为40
‑
50℃)下特异性结合并包括非特异性dna标签的引物来实现。这确保了只有mrna被这一引物标记，该引物随后在pcr步骤(在高退火温度下)中可以用于特异性扩增由之前逆转录(rt)步骤中的mrna转化而来的cdna)。
166.可以通过参考图4a和4b来理解此方法的原理。下述是用于提供合适的引物并进行有效分析的示例性方法。
167.于初始，设计靶向目标基因的正向和反向引物。从反向引物(也是rt引物)去除核苷酸直到解链温度低于40s。然后将非特异性dna标签连接到反向引物的5'端。特异性序列 tag的解链温度应大于约64℃。然后，在约42℃进行rt反应，并在约65℃的退火温度下进行pcr。在这些条件下，扩增应仅发生在被标记的cdna(用被标记的反向引物对mrna的rt获得的cdna)上。
168.在图4a中，在低温下(在低于40℃s)进行逆转录(rt)，在这期间gdna未变性用于被标记的反向引物退火。因此，仅mrna通过被标记的反向引物退火并逆转录成被标记的cdna。在图4b的pcr的循环#1中，gdna的反义链和被标记的cdna由正向引物退火并复制相应的有义链。gdna的复制的有义链不含标签的互补序列而被标记的cdna的复制的有义链含标签的互补序列。在图4b的pcr的循环#2中，由于标签序列仅存在于被标记的核酸中以及被标记的反向引物的高退火温度(大于约64℃)，仅有被标记的反向引物可以成功地将被标记的有义链退火。在图4b的后续pcr循环中，被标记的核酸呈指数式扩增。
169.在所公开的方法和实施方案中，任何的或所有的步骤都可以在自动化系统中进行以防止污染并减少靶mrna分子的数量损失。自动化还可以降低处理步骤之间的时间延迟，并且可以用于增加或最大化mrna检测的“实时”或快照性质。
170.如上所述，可以根据本文所公开的抗生素敏感性测试方法研究各种mrna。例如，可以选择由活微生物细胞(例如在生长期的细胞)响应刺激所产生的靶mrna。在另一个实例中，可以选择响应特定抗生素(例如，通过dna合成抑制抗微生物剂的双链dna断裂的形成诱
导了sos响应基因(如dna修复酶)的表达)所产生的靶mrna。或者可以通过鉴定保守的细菌死亡途径来选择靶mrna，其中保守的细菌死亡途径是所有的杀菌性抗生素的细胞死亡的共同机制(例如，活性氧类(ros)的产生，其应在敏感性细菌菌株中被激活)。
171.靶mrna及其用于检测的相关基因的非限制性实例包括如下。对于监测细菌生长，许多基因与细菌分裂和生长相关(例如，dnak、tufa、rpoa)。通过监测这些基因的mrna水平(在存在或不存在刺激应用的情况下)，其能够确定在抗生素存在的情况下细菌是否正在生长。其它示例性基因和靶mrna与对环境压力(如热休克、冷休克、营养限制(严格响应)和dna损伤剂(sos响应))高度协调的细菌响应相关。与热休克相关的示例性基因和靶mrna是热休克蛋白(hsp)，与冷休克相关的示例性基因和靶mrna是冷休克蛋白(csp)。与对莫匹罗星(mupirocin)(其是异亮氨酰trna合成酶抑制剂)严格响应相关的示例性基因和靶mrna是参与异亮氨酸生物合成的酶(ilv，leu)。与对丝裂霉素c的sos响应相关的示例性基因和靶mrna是参与dna代谢的蛋白(uvr，ssb)。在另一个实例中，一些特定的基因和靶mrna可以在特定小分子存在的情况下被诱导。例如，通过异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代
‑
半乳糖苷(iptg)诱导的参与乳糖发酵的酶，lac操纵子基因。抗生素敏感的微生物细胞对这些诱导物的响应能力可以被抑制，并且例如可以利用此机制以确定细菌菌株是否对特定抗生素有耐受性。
172.此外，最近细菌凋亡样途径被表征，并且可以适用于确定细菌是否被特定抗生素杀死。认为许多抗生素通过活性氧类(ros)的产生起作用，这可能是另一种确定微生物细胞对抗生素的敏感性的方法。
173.大多数细菌mrna的半衰期的范围为40秒至60分钟，这取决于转录物稳定性的变化。例如，大多数在金黄色葡萄球菌中产生的转录物的mrna半衰期是快速降解的(89.7％都小于5分钟)，而1.1％的转录物是稳定的(半衰期大于30分钟)。有趣的是，在这些细菌中热休克和冷休克响应的诱导似乎戏剧性地稳定了mrna转录物，其中大多数都具有5至30分钟的半衰期(anderson等人，j bacterial 2006 188(19):6739)。
174.尽管前述实施方案已经公开了靶向抗生素敏感性测试的方法，可以理解的是，本文公开的方法可以被修改和/或适用于其它的应用。例如，在一个实施例中，可以修改上述方法实施方案以通过检测响应刺激所产生的靶mrna来评估、研究或确定一个或多个微生物细胞的状态。例如，可以通过以下来评估一个或多个细胞的生存能力：向含有微生物细胞的悬浮物提供刺激(其中选择刺激以诱导活微生物细胞中的mrna的产生)，在与微生物细胞内的mrna的产生相关的时间段内裂解微生物细胞，并检测裂解物中的mrna。应当理解的是，此类实施方案可用于广泛的应用，这包括但不限于临床诊断、流行病学研究、法医、抗微生物剂的开发和治疗候选物的高通量筛选。
175.本申请还涉及以下实施方案：
176.实施方案1.进行快速抗生素敏感性测试的方法，其包括：
177.对第一裂解物进行多重鉴定测试组，所述第一裂解物获自怀疑含有微生物细胞的第一样品；
178.从怀疑含有所述微生物细胞的第二样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样，其中所述主等分试样和所述参考等分试样含有生长培养基，并且其中所述第一样品和所述第二样品来自共同的受试者；
179.向所述主等分试样添加至少一种所选择的抗生素，所述所选择的抗生素至少部分
地基于所述多重鉴定测试组的结果而选择；
180.在适合于促进微生物生长的条件下孵育所述主等分试样和所述参考等分试样，以测试所述所选择的抗生素的效力；
181.从所述主等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得主悬浮物；
182.从所述参考等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得参考悬浮物；
183.裂解所述主悬浮物和所述参考悬浮物中的微生物细胞，从而获得主裂解物和参考裂解物；
184.对所述主裂解物进行逆转录和扩增，以检测与通过所述多重鉴定测试组可检测的微生物细胞相关的核酸，从而获得主分析信号；
185.对所述参考裂解物进行逆转录和扩增，以检测与通过所述多重鉴定测试组可检测的微生物细胞相关的核酸，从而获得参考分析信号；
186.比较所述主分析信号和所述参考分析信号，以获得所述所选择的抗生素对所述微生物细胞的效力的量度。
187.实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中进行所述逆转录和扩增以检测rrna，且其中所述主分析信号相对于所述参考分析信号的降低指示所述所选择的抗生素的效力。
188.实施方案3.根据实施方案1所述的方法，其中进行所述逆转录和扩增以检测tmrna，且其中所述主分析信号相对于所述参考分析信号的降低指示所述所选择的抗生素的效力。
189.实施方案4.根据实施方案1所述的方法，其中进行所述逆转录和扩增以检测mrna，且其中采用所述主分析信号相对于所述参考分析信号的变化来确定所述所选择的抗生素的效力。
190.实施方案5.根据实施方案4所述的方法，其还包括使所述主等分试样和所述参考等分试样接受配置成诱导mrna的产生的刺激，其中选择所述刺激以使得敏感性和/或耐受性微生物细胞的mrna的产生因所述微生物细胞暴露于所述抗生素而改变。
191.实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述逆转录和扩增检测多种核酸序列，使得所述多种核酸序列包括与通过所述多重鉴定测试组可检测的微生物细胞相关的核酸序列。
192.实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述逆转录和扩增检测至少一种核酸序列，所述核酸序列在两种或更多种类型的通过所述多重鉴定测试组可检测的微生物细胞之间是保守的。
193.实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中通过离心分离所述微生物细胞。
194.实施方案9.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中通过过滤分离所述微生物细胞。
195.实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品是全血样品，所述方法还包括在获得所述主等分试样和所述参考等分试样之前，将第一血裂解剂添加到所述第二样品中。
196.实施方案11.根据实施方案10所述的方法，其还包括在向所述第二样品添加所述第一血裂解剂之后，对所述第二样品进行离心，并取出至少一部分上清液。
197.实施方案12.根据实施方案10或11所述的方法，其中所述第一血裂解剂包含皂素和sps，其中皂素和sps在混合全血和所述第一血裂解剂后的浓度分别为约1.0mg/ml至10mg/ml和0.5mg/ml至2mg/ml。
198.实施方案13.根据实施方案10至12中任一项所述的方法，其还包括在从所述主等分试样中分离所述微生物细胞之前，将第二血裂解剂添加到所述主等分试样中。
199.实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述第二血裂解剂包含皂素和sps，其中皂素和sps在混合全血和所述第二血裂解剂后的浓度分别为约1.5mg/ml至80mg/ml和0.5mg/ml至20mg/ml。
200.实施方案15.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品来自痰样品、尿样品、脑脊髓液样品之一。
201.实施方案16.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品是血清样品、血浆样品和血培养物样品之一。
202.实施方案17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中所述第二样品获自所述第一样品。
203.实施方案18.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中在获得所述主等分试样和所述参考试样之前，将生长培养基添加到所述第二样品中。
204.实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其中在进行所述第一裂解物中的核酸的多重扩增检测之前，将所述生长培养基添加到所述第二样品中，并且其中孵育所述第二样品，并在适合于促进微生物生长的条件下进行核酸的多重扩增检测。
205.实施方案20.根据实施方案18所述的方法，其中在将所述所选择的抗生素添加到所述主等分试样之前，在适合于促进微生物生长的条件下孵育所述第二样品。
206.实施方案21.根据实施方案19或20所述的方法，其中在孵育所述第二样品之前，将抗生素吸收剂添加到所述第二样品中，并且其中在获得所述主等分试样和所述参考等分试样之前，从所述第二样品中去除所述抗生素吸收剂。
207.实施方案22.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中在将所述所选择的抗生素添加到所述主等分试样之前，在适合于促进微生物生长的条件下孵育所述主等分试样和所述参考等分试样。
208.实施方案23.根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中所述多重鉴定测试组的各个测试与界、科、革兰氏状态、属、种和株之一相关。
209.实施方案24.根据实施方案1至23中任一项所述的方法，其中核酸的多重扩增检测采用逆转录和随后的多重扩增来检测rrna。
210.实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中进行逆转录而不进行初始生长步骤。
211.实施方案26.根据实施方案1至25中任一项所述的方法，其中在约1小时内鉴定所述鉴定组中微生物细胞的存在。
212.实施方案27.根据实施方案1至26中任一项所述的方法，其中等分试样的数量是2个。
213.实施方案28.根据实施方案1至26中任一项所述的方法，其中等分试样的数量是2个至4个。
214.实施方案29.根据实施方案1至26中任一项所述的方法，其中所述主等分试样是第一主等分试样和所述所选择的抗生素是第一所选择的抗生素，且其中一个或多个另外的等分试样获自所述第二样品，所述方法还包括向每一个另外的等分试样添加另外的所选择的抗生素并处理每一个另外的等分试样，以获得每种另外的所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度，其中每种另外的所选择的抗生素至少部分地基于微生物细胞的鉴定而选择。
215.实施方案30.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中所述所选择的抗生素至少部分地基于所述微生物细胞的鉴定，和至少部分地通过处理储存于存储器中的抗菌谱而自动选择。
216.实施方案31.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中所述所选择的抗生素基于医生提供的信息而获得。
217.实施方案32.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中来自所述多重鉴定测试组的阳性测试结果的一种或多种组合具有至少一种对应的与其相关的抗生素，并且其中选择至少一种所选择的抗生素是通过：选择对应的与来自所述多重鉴定测试组的结果相关的抗生素作为所选择的抗生素，且其中基于所选择的抗生素而不是接受医生提供的信息，进行所选择的抗生素的效力的确定作为反应测试。
218.实施方案33.根据实施方案32所述的方法，其中来自所述多重鉴定测试组的阳性测试结果的一种或多种组合具有与其相关的多种对应的抗生素，所述抗生素至少按样品类型分类，其中所述所选择的抗生素作为与所述第一样品的样品类型相关的对应的抗生素而选择。
219.实施方案34.根据实施方案32所述的方法，其中来自所述多重鉴定测试组的阳性测试结果的一种或多种组合具有与其相关的多种对应的抗生素，所述抗生素至少按医院病房分类，其中所述所选择的抗生素作为与收集所述第一样品的医院病房相关的对应的抗生素而选择。
220.实施方案35.根据实施方案32所述的方法，其中来自所述多重鉴定测试组的阳性测试结果的一种或多种组合具有与其相关的多种对应的抗生素，所述抗生素至少按医院或社区获得的感染来源分类，其中所述所选择的抗生素作为与感染来源相关的对应的抗生素而选择。
221.实施方案36.进行快速抗生素敏感性测试的方法，其包括：
222.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样，其中所述主等分试样和所述参考等分试样含有生长培养基；
223.向所述主等分试样添加至少一种所选择的抗生素；
224.在适合于促进微生物生长的条件下孵育所述主等分试样和所述参考等分试样，以测试所述所选择的抗生素的效力；
225.从所述主等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得主浓缩悬浮物；
226.从所述参考等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得参考浓缩悬浮物；
227.裂解所述主浓缩悬浮物和所述参考浓缩悬浮物中的微生物细胞，从而获得主裂解物和参考裂解物；
228.对所述主裂解物和所述参考裂解物进行逆转录和扩增，以检测与微生物测试组成员相关的核酸，从而获得主分析信号和参考分析信号；
229.比较所述主分析信号和所述参考分析信号，以获得所述所选择的抗生素对所述微生物细胞的效力的量度。
230.实施方案37.根据实施方案36所述的方法，其中所述主等分试样是第一主等分试样和所述所选择的抗生素是第一所选择的抗生素，且其中一个或多个另外的等分试样获自所述样品，所述方法还包括向每一个另外的等分试样添加另外的所选择的抗生素并处理每一个另外的等分试样，以获得每一种另外的所选择的抗生素的效力的量度。
231.实施方案38.进行快速抗生素敏感性测试的方法，其包括：
232.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得多个主等分试样和参考等分试样，其中所述主等分试样和所述参考等分试样含有生长培养基；
233.向各个主等分试样添加至少一种所选择的抗生素，使得至少两个所述主等分试样含有不同的所选择的抗生素；
234.在适合于促进微生物生长的条件下孵育所述主等分试样和所述参考等分试样，以测试所述所选择的抗生素的效力；
235.从所述主等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得多个主悬浮物；
236.从所述参考等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得参考悬浮物；
237.裂解所述主悬浮物和所述参考悬浮物中的微生物细胞，从而获得多个主裂解物和参考裂解物；
238.对所述主裂解物和所述参考裂解物进行逆转录和扩增，以检测与微生物组成员相关的核酸，从而获得多个主分析信号和参考分析信号；
239.比较所述主分析信号和所述参考分析信号，以获得所述所选择的抗生素对所述微生物细胞的效力的量度。
240.实施方案39.进行快速抗生素敏感性测试的方法，其包括：
241.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样，其中所述主等分试样和所述参考等分试样含有生长培养基；
242.向所述主等分试样添加至少一种所选择的抗生素；
243.在适合于促进微生物生长的条件下孵育所述主等分试样和所述参考等分试样，以测试所述所选择的抗生素的效力；
244.使所述主等分试样和所述参考等分试样中的微生物细胞接受配置成诱导靶mrna的产生的刺激，其中选择所述刺激以使得敏感性和/或耐受性微生物细胞的mrna的产生因所述微生物细胞暴露于所述所选择的抗生素而改变；
245.裂解所述主等分试样和所述参考等分试样中的微生物细胞，以获得主裂解物和次裂解物，其中以适合于避免各裂解物中的mrna大量降解的方式进行所述裂解，并且其中在与响应所述刺激的微生物细胞中所产生的mrna的寿命相关的时间段进行所述裂解；
246.对所述主裂解物和所述参考裂解物进行逆转录和扩增以检测与微生物测试组成员相关的mrna，从而获得主分析信号和参考分析信号；
247.比较所述主分析信号和所述参考分析信号，以获得所述所选择的抗生素对所述微生物细胞的效力的量度。
248.实施方案40.进行抗生素敏感性测试的方法，其包括：
249.从怀疑含有微生物细胞的样品中获得至少一个主等分试样和参考等分试样；
250.向所述主等分试样添加至少一种所选择的抗生素；
251.裂解获自所述主等分试样和所述参考等分试样的微生物细胞，从而获得主裂解物和参考裂解物；
252.对所述主裂解物进行逆转录和扩增，以检测与测试组成员相关的tmrna，从而获得主分析信号；
253.对所述参考裂解物进行逆转录和扩增，以检测与测试组成员相关的核酸，从而获得参考分析信号；
254.比较所述主分析信号和所述参考分析信号，以获得所述所选择的抗生素对所述微生物细胞的效力的量度。
255.展示下述实施例是为了使本领域技术人员能够理解和实施本公开的实施方案。它们不应当被认为是对本公开范围的限制，而仅仅是本公开范围的说明和代表。
实施例
256.在实施例1和实施例2中，革兰氏阴性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)细胞生长于lb琼脂板上，细胞的单个菌落在lb液体培养基中于37℃培养过夜。将细胞以7000rpm离心5分钟。将细胞团洗涤2次并重悬于0.8mm的磷酸盐缓冲液(ph7.4)，通过0.2μm的过滤器预过滤。
257.无论何时需要预处理血样品时，使用血细胞裂解剂。血细胞裂解剂由皂素(84510，sigma)、聚茴香磺酸钠(sps)(p2008，sigma)和聚丙二醇(ppg)mw2000(202339，sigma)的混合物组成。皂素溶解于试剂级水中，通过0.2μm pes注射器式过滤器过滤并使用amicon ultra
‑
15 10k mv截留(z706345，sigma)进行纯化。将sps溶于试剂水中并通过0.2μm pes注射器式过滤器过滤。直接使用原瓶的ppg mw 2000(202339，sigma)。此外，添加fluorinert
tm fc
‑
40(f9755，sigma)作为缓冲剂溶液。
258.除非指明了任何变化，下述实施例的预处理过程均在需要预处理血样品的实验中进行，其中预处理过程包括血细胞裂解步骤以及后续的4次洗涤循环。将10μl的fluorinert
tm
添加到2ml的硅化微量离心管(t3531，sigma)中，随后添加500μl的血细胞裂解剂。血细胞裂解剂由75mg/ml的皂素、15mg/ml的sps和1％的ppg组成。将1ml的掺有微生物细胞的edta处理的来自健康志愿者的人全血添加到含有血细胞裂解剂和fluorinert
tm
的管中，并通过颠倒10次并低速涡旋10秒进行混合。混合物中组分的最终浓度为25mg/ml的皂素、5mg/ml的sps和0.33％的ppg。将管以12,000rpm离心1分钟，去除1.35ml的上清液，留下150μl的液体上清液、fluorinert
tm
和沉淀的微生物细胞。通过以下来进行第一次洗涤循环：添加1.35ml的0.8mm的磷酸盐缓冲液至如上所述的150μl剩余的液体上清液中，通过低速涡旋10秒混合，在12,000rpm下离心1分钟并去除1.35ml的上清液，留下150μl的液体上清液、
fluorinert
tm
和沉淀的微生物。通过以下来进行剩余的洗涤循环：添加0.75ml的0.8mm的磷酸盐缓冲液至150μl的剩余的液体上清液，通过低速涡旋10秒混合，在12,000rpm下离心1分钟，去除0.75ml的上清液，留下150μl的液体上清液、fluorinert
tm
和沉淀的微生物。在最后的洗涤后，将沉淀的微生物细胞重悬于剩余的液体中。通过添加0.8mm的磷酸盐缓冲液(ph7.4)和相同浓度的各微生物细胞(作为各实验中预处理样品的标称浓度)来制备阳性对照样品。
259.在采用电细胞裂解的实施例中，经预处理的样品和阳性对照样品以10μl/10s的步速穿过电室并施加n＝250的双极矩形脉冲(其具有50μs的持续时间和190v的振幅)。电室尺寸为6.4x15x0.2mm3且入口和出口是受限的类型。
260.在下述实施例中，进行实时逆转录pcr(实时rt
‑
pcr)分析以检测各个微生物细胞类型的16s rrna、tmrna或mrna中的特定靶区域。通过序列比对软件(bioedit,ibis biosciences,usa)和引物设计软件(primer3，national institutes of health)设计引物。电裂解以后，经预处理的样品的细胞裂解物进行实时rt
‑
pcr。
261.除非指明了任何变化，通过混合1μl的样品、1μl的kapa 2g robust hotstart 5x缓冲液(kk5517，kapa biosystems)、0.05μl的kapa 2g robust hotstart dna聚合酶(kk5517，kapa biosystems)、0.2μl的逆转录酶(goscript，a5004 promega)、0.04μl的100mm的dntp(10297
‑
117，life technologies)、0.25μl的dmso、0.13μl的sybr green(1/375的稀释度，s7563 invitrogen)、分别的正向和反向引物(2.5μμ)各自0.5μl和1.34μl的无rna酶的水来制备5μl体积的rt
‑
pcr反应。在所示实验中，对于5μl体积的pcr反应而言，组成与rt
‑
pcr反应相同，除了添加0.2μl的无rna酶的水来代替逆转录酶。通过在50℃逆转录5分钟，在97℃失活逆转录酶并激活热启动dna聚合酶5分钟，再使用双链dna结合荧光染料(sybr green)在eco实时pcr系统(lllumina)中进行35至40个循环的cdna扩增(95℃变性5秒、63℃退火7秒并72℃延伸10秒)来进行靶向rrna或tmrna的实时rt
‑
pcr。
262.实施例1：部分裂解再富集的全血样品中的细菌生长
263.在下述实施例中，描述了确保在部分裂解血细胞并富集血培养物之后的全血样品中细菌生长的方法。使用肺炎克雷伯菌种作为一个实例。掺入肺炎克雷伯菌的全血中的血细胞被裂解剂部分裂解，并且离心后去除大部分的上清液。使用tsb生长培养基富集含有所收获的微生物细胞的剩余的最小体积的液体并于37℃预孵育以允许细菌在混合物中繁殖。
264.以100cfu/ml的浓度将肺炎克雷伯菌细胞掺入到2ml的edta处理的全血中。将200μl的血细胞裂解剂(其含有40mg/ml的皂素、10mg/ml的sps和1％的ppg)添加到血中。将内容物通过以下充分混合：颠倒，再低速涡旋10秒，在12,000rpm下离心2分钟并去除1.8ml的上清液，留下200μl的液体和沉淀的剩余的血细胞以及微生物细胞。通过以下来进行一次洗涤循环：添加1.8ml的tsb培养基至200μl的剩余的液体上清液中，颠倒混合，在12,000rpm下离心2分钟，并去除1.8ml的上清液，留下200μl的液体和沉淀的剩余的血细胞以及微生物细胞。使用3.8ml的tsb生长培养基富集剩余的最小体积的液体，通过颠倒充分混合并于37℃预孵育2小时以允许细菌在混合物中繁殖。在预孵育的0、1和2小时的时间点，用1ml的各个培养物进行如上所述的血样品预处理过程(其包括血细胞裂解步骤，再接4次洗涤循环)。
265.通过电裂解来裂解所获得的预处理样品中的肺炎克雷伯菌细胞，并将1μl的含有标称1细胞的细胞裂解物进行rt
‑
pcr。在本实施例中使用的rrna引物是rrna引物#2
(enterob4)正向(5'
‑
acaagcggtggagcatgtgg
‑
3')(seq.id 1)和rrna引物#2(enterob4)反向(5'
‑
gcgggacttaacccaacatttcac
‑
3')(seq.id 2)。通过rrna引物对#2扩增166个碱基对的16s rrna片段。在本实施例中使用的tmrna引物是tmrna引物#c正向(5'
‑
gcaaacgacgaaaactacgctttagc
‑
3')(seq.id 3)和tmrna引物#c反向(5'
‑
cctacatcctcggtactacatgc
‑
3')(seq.id 4)。通过tmrna引物对#c扩增240个碱基对的tmrna片段(核苷酸97至337，使用肺炎克雷伯菌kp52.145作为参考)。实时荧光信号与循环数的对比示于图3，以示出在富集的血培养物中的细菌的生长。
266.实施例2：在部分裂解再富集的全血样品中的细菌的抗微生物灵敏度测试
267.在下述实施例中，描述了在部分裂解血细胞并富集血培养物之后的全血样品中进行细菌的抗微生物灵敏度测试的方法。使用肺炎克雷伯菌种作为实例。掺入肺炎克雷伯菌的全血中的血细胞被裂解剂部分裂解，并且离心后去除大部分的上清液。使用tsb生长培养基富集剩余的最小体积的液体并于37℃预孵育以允许细菌在混合物中繁殖。在预孵育期结束时，通过将培养物等分成多个管来进行抗微生物灵敏度测试，其中一个管没有抗生素，其余管有不同的抗生素。
268.以100cfu/ml的浓度将肺炎克雷伯菌细胞掺入2ml的edta处理的全血中。将在200μl水中含有40mg/ml皂素、10mg/ml的sps和1％的ppg的血细胞裂解剂添加到血中。将内容物通过以下充分混合：颠倒，再低速涡旋10秒，在12,000rpm下离心2分钟并去除1.8ml的上清液，留下200μl的液体和沉淀的剩余的血细胞以及微生物细胞。通过以下来进行一次洗涤循环：添加1.8ml的tsb培养基至200μl的剩余的液体上清液，颠倒混合，在12,000rpm下离心2分钟，并去除1.8ml的上清液，留下200μl的液体和沉淀的剩余的血细胞以及微生物细胞。向剩余的最小体积的液体补充3.8ml的tsb生长培养基，通过颠倒充分混合并于37℃预孵育2小时以使细菌在混合物中繁殖。在预孵育期结束时，将1ml的各个培养物分配到多个管中。一个管被指定为未处理的生长对照管(没有任何抗生素)，将最终浓度为8μg/ml的诺氟沙星和四环素添加到剩余的各个管中。将培养管于37℃孵育2小时，在孵育时间结束时，将1ml的各个tsb富集的血培养物接受血样品预处理过程，其中预处理过程包括如上所述进行血细胞裂解步骤，再接4次洗涤循环。通过电裂解将获得的预处理的样品中的肺炎克雷伯菌细胞裂解，用1μl含有标称1细胞的细胞裂解物进行rt
‑
pcr。
269.在本实施例中使用的rrna引物是rrna引物#1(enterob2)正向(5'
‑
gtgcccttgaggcgtggcttc
‑
3')(seq.id.5)，rrna引物#1(enterob2)反向(5'
‑
gcgggacttaaccgaacattcac
‑
3')(seq.id.6)，rrna引物#2(enterob4)正向(5'
‑
acaagcggtggagcatgtgg
‑
3')(seq.id.7)，rrna引物#2(enterob4)反向(5'
‑
gcgggacttaacccaacatttcac
‑
3')(seq.id.8)，rrna引物#3(ebgn3)正向(5'
‑
actttcagcggggaggaagg
‑
3')(seq.id.9)和rrna引物#3(ebgn3)反向(5'
‑
gcgggacttaacccaacatttcac
‑
3')(seq.id.10)。用引物对#1扩增203个碱基对的16s rrna片段(核苷酸504至707，使用肺炎克雷伯菌kp52.145作为参考)，用引物对#2扩增166个碱基对并用引物对#3扩增666个碱基对。
270.在本实施例中使用的tmrna引物是tmrna引物a#正向(5'
‑
gcaaacgacgaaaactacgctttagc
‑
3')(seq.id 11)，tmrna引物a#反向(5'
‑
gcttagtcagtctttacattcgc
‑
3')(seq.id 12)，tmrna引物#b正向(5'
‑
gcaaacgacgaaaactacgctttagc
‑
3')(seq.id 13)，tmrna引物#b反向(5'
‑
cggacggacacgccactaac
‑
3')(seq.id 14)，tmrna引物#c正向(5
‑
'
‑
gcaaacgacgaaaactacgctttagc
‑
3')(seq.id15)，tmrna引物#c反向(5'
‑
cctacatcctcggtactacatgc
‑
3')(seq.id 16)，tmrna引物#d正向(5'
‑
gggatttgcgaaacccaaggtgc
‑
3')(seq.id 17)，tmrna引物#d反向(5'
‑
gttttaacgcttcaaccccaggc
‑
3')(seq.id 18)，tmrna引物#e正向(5'
‑
gggatttgcgaaacccaaggtgc
‑
3')(seq.id 19)，tmrna引物#e反向(5'
‑
gcttagtcagtctttacattcgc
‑
3')(seq.id20)，tmrna引物#f正向(5'
‑
gggatttgcgaaacccaaggtgc
‑
3')(seq.id 21)，tmrna引物#f反向(5'
‑
cggacggacacgccactaac
‑
3')(seq.id 22)，tmrna引物#g正向(5'
‑
gggatttgcgaaacccaaggtgc
‑
3')(seq.id 23)，tmrna引物#g反向(5'
‑
cctacatcctcggtactacatgc
‑
3')(seq.id 24)。用引物对#a扩增218个碱基对的tmrna片段(核苷酸97至315，使用肺炎克雷伯菌kp52.145作为参考)，用引物对#b扩增183个碱基对，用引物对#c扩增240个碱基对，用引物对#d扩增221个碱基对，用引物对#e扩增293个碱基对，用引物对#f扩增258碱基对，用引物对#g扩增315个碱基对。
271.实时荧光信号与循环数的对比示于图8和图9中以表明使用诺氟沙星和四环素的灵敏度测试。在此实施例中，相比于不含抗生素(未处理的)的培养物，证实了rrna和tmrna响应抗生素的降低。
272.实施例3：通过在存在其对应的gdna时检测mrna靶标的特异性的探针依赖度
273.在实施例3和4中，革兰氏阴性大肠杆菌细胞生长于lb琼脂板上，细胞的单个菌落在lb液体培养基中于37℃培养过夜。为了用在指数生长期的细胞进行实验，将500μl的过夜培养物接种到5ml的lb液体培养基中并于37℃振荡孵育指定时间，直至od
600nm
达到0.3至0.5，其对应约108cfu/ml。将1ml的细胞悬浮物在10,000rpm下离心5分钟。将细胞团洗涤2次并重悬于1ml的0.5mm磷酸缓冲液(ph7.4)，通过0.2μm的过滤器预过滤。
274.将洗涤后的细胞悬浮物10倍稀释至约107cfu/ml，其中的50μl于42℃孵育3分钟以诱导热休克条件。经热休克的细胞立即连续稀释至104cfu/ml并进行e
‑
裂解。
275.在下述实施例中，进行实时逆转录pcr(rt
‑
pcr)或实时pcr分析以分别检测大肠杆菌的dnak mrna或gdna中的特定靶区域。通过序列比对软件(bioedit,ibis biosciences,usa)和引物设计软件(primer3，national institutes of health)设计引物。电裂解后的细胞裂解物进行实时rt
‑
pcr或pcr。除样品之外，将用于细胞悬浮的预过滤的磷酸盐缓冲液进行rt
‑
pcr或pcr作为阴性对照。
276.在此实施例中，将500μl过夜的大肠杆菌培养物接种到5ml的lb液体培养基中并于37℃振荡孵育90分钟。在如上所述的洗涤细胞并重悬于磷酸盐缓冲液之后，将细胞于42℃孵育3分钟以在e
‑
裂解之前立即诱导热休克。将电裂解后的1μl的含有标称10细胞的细胞裂解物进行实时rt
‑
pcr或仅进行pcr。在本实施例中使用dnak正向引物(5'
‑
gtactaccaactcttgtgtagcg
‑
3')(seq.id.25)，r1反向引物(5'
‑
agcagcaataattttgaacggc
‑
3')(seq.id.26)，具有5'标签的r5反向引物(5'
‑
agtacgcacggtatcagcagcaat
‑
3')(seq.id.27)和具有5'标签的r8反向引物(5'
‑
gcagcacggttttgaacggcat
‑
3')(seq.id.28)。实时荧光信号与循环数的对比示于图10。
277.观察到的是，当使用未标记的反向引物时，rt
‑
pcr和rt分析的ct值的差异仅是3.4个循环，差异增加至8.4个循环。通过适当的引物选择在背景抑制方面，这相当于32倍的改善。因此，引物序列影响扩增以及gdna所获得的扩增子和mrna所获得的扩增子的比。
278.实施例4：在将细菌暴露于抗生素之后的mrna水平的差异
279.在此实施例中，将500μl的过夜大肠杆菌培养物接种到5ml有或没有最终浓度为4或8μg/ml的抗生素诺氟沙星的lb液体培养基中并于37℃振荡孵育120分钟。在如上所述的洗涤细胞并重悬于磷酸盐缓冲液之后，将细胞于42℃孵育3分钟以在e
‑
裂解之前立即诱导热休克。将电裂解后的1μl含有标称10细胞的细胞裂解物进行实时rt
‑
pcr(rt )或pcr(rt
‑
)。本实施例中使用dnak正向引物(5'
‑
gtactaccaactcttgtgtagcg
‑
3')(seq.id.29)和具有5'标签的r5反向引物(5'
‑
agtacgcacggtatcagcagcaat
‑
3')(seq.id.30)。实时荧光信号与循环数的对比示于图11。
280.观察到的是，微生物细胞暴露于抗生素诺氟沙星使靶mrna的量降低约8
‑
16倍(对应于3
‑
4个pcr循环)。这些结果表明，因热诱导的mrna水平受对抗微生物剂的敏感性的充分影响。
281.上述具体实施例是以示例的方式呈现，并且应当理解的是，这些实施例可以包括各种修改和替代形式。应当进一步理解的是，权利要求不旨在限制公开的具体形式，而是覆盖了落入本公开的精神和范围之内的所有修改、等同物和替代物。

技术特征：
1.进行快速抗生素敏感性测试的方法，其包括：获得第一样品和第二样品，其中所述第一样品和所述第二样品来自同一受试者；向所述第二样品中添加生长培养基，并在适合于促进微生物生长的条件下预孵育所述第二样品；在预孵育所述第二样品的同时，对所述第一样品进行多重鉴定测试组，并鉴定所述第一样品中一种或多种微生物细胞的存在，其中对所述第一样品进行多重鉴定测试组，而无需事先培养所述第一样品；和对所述第二样品进行抗微生物敏感性试验，以确定抗生素对第二样品中微生物细胞的效力的量度，其中基于来自所述多重鉴定测试组的结果选择所述抗生素。2.根据权利要求1所述的方法，其中在预孵育所述第二样品之前将抗生素吸收剂添加到所述第二样品中，并且其中在进行所述抗微生物敏感性测试之前从所述第二样品中去除所述抗生素吸收剂。3.根据权利要求1所述的方法，其中在大约一个小时内在所述多重鉴定测试组中鉴定出所述第一样品中所述微生物细胞的存在。4.根据权利要求1所述的方法，其中进行所述多重鉴定测试组和所述抗微生物敏感性测试中的一个或两者包括进行逆转录和随后的多重扩增以检测rrna。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多重鉴定测试组的每个测试与界、科、革兰氏状态、属、种和株之一相关。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二样品是从所述第一样品获得的。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品是全血样品。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品是来自痰样品、尿样品、脑脊髓液样品中的一种。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品是血清样品和血浆样品中的一种。10.根据权利要求1所述的方法，其中来自所述多重鉴定测试组的阳性测试结果的一种或多种组合具有至少一种与其相关联的抗生素，并且其中至少一种所选择的抗生素是通过以下选择的：选择与来自所述多重鉴定测试组的结果相关的相应抗生素作为所选择的抗生素，并且其中基于所选择的抗生素作为反应测试而无需接收来自医生的输入来对所选择抗生素的效力进行确定。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗微生物敏感性测试通过以下进行：从所述第二样品中获得至少主等分试样和参考等分试样；向所述主等分试样添加所选择的抗生素，所述所选择的抗生素至少部分地基于所述多重鉴定测试组的结果而选择；在适合于促进微生物生长的条件下孵育所述主等分试样和所述参考等分试样，以测试所述所选择的抗生素的效力；从所述主等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得主悬浮物；从所述参考等分试样中分离微生物细胞，并将所分离的微生物细胞重悬，以获得参考
悬浮物；裂解所述主悬浮物和所述参考悬浮物中的微生物细胞，从而获得主裂解物和参考裂解物；对所述主裂解物进行逆转录和扩增，从而获得主分析信号；对所述参考裂解物进行逆转录和扩增，从而获得参考分析信号；比较所述主分析信号和所述参考分析信号，以获得所述所选择的抗生素对所述微生物细胞的效力的量度。12.根据权利要求11所述的方法，其中进行所述逆转录和扩增以检测rrna，且其中所述主分析信号相对于所述参考分析信号的降低指示所述所选择的抗生素的效力。13.根据权利要求11所述的方法，其中进行所述逆转录和扩增以检测tmrna，且其中所述主分析信号相对于所述参考分析信号的降低指示所述所选择的抗生素的效力。14.根据权利要求11所述的方法，其中进行所述逆转录和扩增以检测mrna，且其中采用所述主分析信号相对于所述参考分析信号的变化来确定所述所选择的抗生素的效力。15.根据权利要求14所述的方法，其还包括使所述主等分试样和所述参考等分试样接受配置成诱导mrna的产生的刺激，其中选择所述刺激以使得敏感性和/或耐受性微生物细胞的mrna的产生因所述微生物细胞暴露于所述抗生素而改变。16.根据权利要求11所述的方法，其中所述逆转录和扩增检测多种核酸序列，使得所述多种核酸序列包括与微生物细胞类型相关的核酸序列，所述微生物细胞类型是通过所述多重鉴定测试组的成员。17.根据权利要求11所述的方法，其中所述逆转录和扩增检测至少一种核酸序列，所述核酸序列在两种或更多种类型的微生物细胞之间是保守的，所述两种或更多种类型的微生物细胞是所述多重鉴定测试组的成员。18.根据权利要求11所述的方法，其中通过离心或过滤分离所述微生物细胞。19.根据权利要求11所述的方法，其中所述主等分试样和所述参考等分试样在将所述所选择的抗生素添加到所述主等分试样之前，在适合于促进微生物生长的条件下孵育。20.根据权利要求11所述的方法，其中所述主等分试样是第一主等分试样和所述所选择的抗生素是第一所选择的抗生素，且其中一个或多个另外的等分试样获自所述第二样品，所述方法还包括向每一个另外的等分试样添加另外的所选择的抗生素并处理每一个另外的等分试样，以获得每种另外的所选择的抗生素对微生物细胞的效力的量度，其中每种另外的所选择的抗生素至少部分地基于微生物细胞的鉴定而选择。
技术总结
提供了基于来自暴露于抗生素之后的微生物细胞中的RNA如tmRNA的检测来进行抗生素敏感性测试的方法。在一些实施方案中，从样品中获得等分试样，其中的一个等分试样含有所选择的抗生素。将含有生长培养基的等分试样在适合于微生物生长的条件下孵育，并将各个等分试样中的微生物细胞移出并裂解，并将裂解物逆转录并扩增来推断所选择的抗生素对微生物细胞的作用。在一个实施方案中，在存在所选择的抗生素的情况下孵育含有微生物细胞的样品并提供刺激以诱导微生物细胞中mRNA的产生。随后裂解微生物细胞而裂解物中的mRNA基本不降解，并检测mRNA以确定抗生素对微生物细胞的作用。测mRNA以确定抗生素对微生物细胞的作用。测mRNA以确定抗生素对微生物细胞的作用。


技术研发人员：萨马德
受保护的技术使用者：克维拉公司
技术研发日：2014.07.03
技术公布日：2021/6/25