差异筛选特异感应三阴性乳腺癌的脱氧核酶探针的制作方法

1.本发明属于脱氧核酶探针技术领域，具体涉及一种差异筛选方法获得特异感应三阴性乳腺癌的脱氧核酶探针。


背景技术：

2.三阴性乳腺癌(triple
‑
negative breast cancers，简称tnbc)，是一类雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均表达为阴性的乳腺癌，占乳腺癌总体的15％
‑
20％。tnbc具有患者年轻化、肿瘤侵袭性强、放化疗预后差、疾病早期即发生远处转移等特点，是目前最为恶性的乳腺癌。因为缺乏明确的标志物(即治疗靶点)，现有的内分泌治疗和靶向治疗对tnbc效果欠佳，且常规放化疗仅能使部分患者获益。
3.脱氧核酶(deoxyribozyme)是一类有催化功能的单链dna，具有高效的催化活性和结构识别能力，一般通过指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，selex)从随机单链dna文库中进化获得。针对像tnbc这类靶标分子未知的目标物，可运用“对冲抵消”的差异筛选方法，即以目标细胞进行正向筛选，而以对照细胞进行负向筛选，来获得脱氧核酶探针。已有研究者利用该方法获得了能特异识别tnbc细胞系mda
‑
mb
‑
231裂解液、并在特定rna碱基位点发生切割的脱氧核酶探针，但是该探针识别的是胞内分子，实际检测中需将细胞裂解，在tnbc临床诊断中具有局限性。因此，亟需开发特异感应tnbc胞外代谢物的脱氧核酶探针，为未来临床诊断tnbc提供新思路。


技术实现要素：

4.为了克服上述技术问题，本发明通过“对冲抵消”的差异筛选策略，在目标分子未知的情况下，获得了特异感应tnbc细胞系mda
‑
mb
‑
231胞外代谢物的脱氧核酶探针。
5.本发明的第一方面，提供了一种特异感应三阴性乳腺癌细胞的脱氧核酶探针，所述脱氧核酶探针的核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。
6.4#：5
′‑
gtagccttcgcat
‑
r
‑
tgagacatcgcaaccgtgacgcaggttgcgatgtcataatagcggaggtaaagcgtgatgccatacgacactgcataggttgggcgcgaaggctacatcacgctac
‑3′
(seq id no:1)，其中，r代表单个插入的rna碱基a(ra)，下划线部分是经筛选后随机库进化出的序列。
7.6#：5
′‑
gtagccttcgcat
‑
r
‑
tgagacatcgcaaccgtgacgcaggttgcgatgtcataatagcggagagctgcggagatgtatgccgggtcgaacgtgtggcggacgaaggctacatcacgctac
‑3′
(seq id no:2)其中，r代表单个插入的rna碱基a(ra)，下划线部分是经筛选后随机库进化出的序列。
8.所述探针识别三阴性乳腺癌细胞中的目标物后，探针的构象发生改变，水解切割序列中最不稳定的rna碱基。
9.在某些实施例中，脱氧核酶探针的切割速率常数k
obs
分别为0.073和0.042min
‑1。
10.另一方面，本发明还提供了上述脱氧核酶探针的筛选方法，包括以下步骤，
11.步骤s1，将底物链、酶链和连接链按物质的量1:1:1混合，并置于t4连接酶反应体
系中，构建dna文库；
12.步骤s2，将步骤s1所得的dna文库置于正常乳腺上皮细胞mcf
‑
10a和hmec的ems中，室温孵育，进行负向筛选，分离纯化未切割的dna条带；
13.步骤s3，将步骤s2获得的dna条带置于细胞mda
‑
mb
‑
231的ems中，室温孵育，进行正向筛选，分离纯化切割的dna条带；
14.步骤s4，以步骤s3获得的dna条带为模板进行pcr扩增，并回收正义链；
15.步骤s5，将步骤s4获得的正义链与步骤1中所述的底物链、连接链按物质的量1:1:1混合，按照步骤s1
‑
s4进行重复筛选；
16.步骤s6，计算切割百分比(clv％)，当所述切割百分比达到平台期时，对pcr产物克隆测序，挑选重复度高的序列即为特异感应三阴性乳腺癌的脱氧核酶探针。
17.在某些实施例中，所述底物链序列如seq id no:3所示，所述酶链序列如seq id no:4所示，所述连接链序列如seq id no:5所示。
18.在某些实施例中，所述步骤s2、步骤s3中的孵育时间为1
‑
1.5h。
19.在某些实施例中，所述pcr扩增的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如seq id no:6所示，所述下游引物序列如seq id no:7所示。
20.在某些实施例中，所述重复筛选中孵育时间随着重复次数的递增而逐步缩减为1min，所述重复筛选的次数为10
‑
15次。
21.采用上述技术方案可以得到灵敏度更高，特异性更好的脱氧核酶探针，在多轮筛选过程中需不断施加筛选压力，如缩短孵育时间或引入突变pcr等。在每一轮筛选后，用切割序列所占百分比(clv％)来表征dna文库的富集程度。经过11轮的筛选，逐步消除了mda
‑
mb
‑
231的ems中非独有成分的干扰，获得了仅特异感应mda
‑
mb
‑
231的ems并切割ra碱基的脱氧核酶探针。
22.在某些实施例中，在最后2
‑
3次筛选中采用突变pcr扩增。
23.第三方面，本发明提供了脱氧核酶探针在特异性切割三阴性乳腺癌胞外代谢物的应用，其特征在于，所述三阴性乳腺癌胞外代谢物为细胞系mda
‑
mb
‑
231胞外代谢物。
24.第四方面，本发明提供了脱氧核酶探针在制备特异性快速检测三阴性乳腺癌细胞的装置中的应用。所述装置包括但不限于检测试剂盒、检测芯片等。
25.本发明相对于现有技术的技术效果：
26.1)本发明的脱氧核酶探针在与mda
‑
mb
‑
231的em共孵育后，探针切割信号随着时间的延长而逐渐增加。经计算，4#和6#探针的切割速率常数k
obs
分别为0.073和0.042min
‑1。
27.2)本发明的筛选方法通过“对冲抵消”的差异筛选策略，在目标分子未知的情况下，获得了特异感应tnbc细胞系mda
‑
mb
‑
231胞外代谢物的脱氧核酶探针。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
29.图1是dna文库构建示意图及文库序列信息。
30.图2是差异筛选获得特异感应tnbc脱氧核酶探针的流程示意图。
31.图3是每一轮dna文库切割信号统计图。
32.图4是脱氧核酶探针4#和6#的动力学表征：图4a是4#和6#探针的序列信息；图4b是4#和6#探针分别与mda
‑
mb
‑
231和mcf
‑
10a、hmec的ems共孵育动力学胶图；图4c是4#和6#探针k
obs
及half
‑
life表征。
33.图5是4#探针特异性表征胶图。
具体实施方式
34.下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
35.实施例1 dna文库的构建
36.将合成的底物链、酶链和连接链按1:1:1混合，70℃孵育5min，再置于室温退火10min；加入t4连接酶，室温反应2小时。反应结束后，加入3倍体积的
‑
20℃100％乙醇和3μl 2.5mg/ml的糖原，置于
‑
80℃冰箱冷冻10min。将冷冻后的混合物低温高速离心(4℃，15000rpm，30min)，去除上清，待乙醇挥发后加入20μl超纯水复溶，经8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denatured polyacrylamide gel electrophoresis，dpage)纯化，用荧光成像仪和割胶仪回收连接成功的条带(全长119nt)。向回收的目的条带中加入crush
‑
soak缓冲液(200mm nacl，10mm tris
‑
hcl ph 7.5，1mm edtaph 8.0)，置于4℃过夜洗脱，经乙醇沉降、超纯水复溶后即得筛选所需的dna文库。
37.dna建库体系：
[0038][0039][0040]
底物链：5
′‑
gtagccttcgcat
‑
r
‑
tgagacatcgcaacc
‑3′
(seq id no:3)其中，r代表单个插入的rna碱基a(ra)。
[0041]
酶链：
[0042]5′‑
phos
‑
gtgacgcaggttgcgatgtc
‑
n
‑
cgaaggctacatcacgcctac
‑3′
(seq id no:4)其中n代表n
50
。
[0043]
连接链：5
′‑
aacctgcgtcacggttgcgatgtct
‑3′
(seq id no:5)
[0044]
将化学合成的3种dna单链，即底物链、连接链和酶链，经退火、t4连接酶连接和核酸电泳分离纯化，获得全长为119nt的dna筛选文库，如图1所示。该文库包括了一个ra碱基和50nt随机序列，具体序列如下：
[0045]5′‑
gtagccttcgcat
‑
r
‑
tgagacatcgcaaccgtgacgcaggttgcgatgtc
‑
n50
‑
cgaaggctacatcacgctac
‑3′
，其中，r代表单个插入的rna碱基a(ra)，n50为50个随机序列。
[0046]
实施例2细胞培养及胞外代谢物(extracellular mixtures,ems)提取
[0047]
选取典型tnbc亚型mca
‑
mb
‑
231(atcc no.htb
‑
26)作为目标细胞系，正常乳腺细胞系mcf
‑
10a(atcc no.crl
‑
10317)和hmec(atcc no.pcs
‑
600
‑
010)作为对照细胞。根据atcc推荐培养方案对上述细胞进行培养、传代。当细胞培养至约80％融合时，用pbs清洗3次后转入无血清培养基中24小时，离心除去细胞碎片并用0.22μm膜过滤，向所得上清中加入蛋白酶抑制剂，置于
‑
80℃贮存，既得筛选所需的ems。
[0048]
实施例3差异筛选
[0049]
如图2所示，差异筛选分为负向筛选、正向筛选、pcr扩增、连接成库等步骤进行。在11轮筛选后进行克隆测序。具体筛选步骤包括：
[0050]
1、负向筛选
[0051]
用75μl缓冲液1将实施例1中构建好的dna文库溶解，置于70℃的金属浴中加热5min，再降温至37℃，加入25μl正常乳腺上皮细胞mcf
‑
10a和hmec的ems，37℃孵育5min；然后加入100μl含mg
2
的缓冲液2，室温孵育1h，进行负向筛选。最后加入等体积2
×
上样缓冲液(含尿素)终止反应，用8％dpage分离纯化未切割的dna条带，即全长序列，过夜洗脱。
[0052][0053]
2、正向筛选
[0054]
将负向筛选得到的全长序列洗脱离心后溶解于75μl缓冲液1，置于70℃的金属浴中加热5min，再降温至37℃，加入25μl mda
‑
mb
‑
231的ems，37℃孵育5min；然后加入100μl含mg
2
的缓冲液2，室温孵育1h，进行正向筛选。最后加入等体积2
×
上样缓冲液(含尿素)终止反应，用8％dpage分离纯化切割的dna条带，即切割序列，过夜洗脱。
[0055]
3、pcr扩增
[0056]
以正向筛选回收的、发生切割的序列为模板，以5
′
端带磷酸基团修饰的正向引物primera和5
′
端带空间子修饰的反向引物primer b作引物，对筛选后的序列进行扩增。pcr产物用8％dpage分离纯化。由于反向引物带有空间子修饰，因此pcr扩增后会得到长度不同的正义链(90nt)和反义链(115nt)，切胶回收正义链，并测定含量。
[0057]
primer a：5
′‑
phos
‑
gtgacgcaggttgcgatgtc
‑3′
(seq id no:6)
[0058]
primer b：5
′‑
a
15
‑
/isp9/gtagcgtgatgtagccttcg
‑3′
(seq id no:7)
[0059]
pcr反应体系如下：
[0060][0061]
pcr反应条件：95℃预变性2min，之后每个循环95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸20s，扩增25个循环；最后68℃终延伸5min。
[0062]
4、连接成库
[0063]
将pcr扩增后的正义链与底物链、连接链按物质的量1:1:1混合，70℃孵育5min，再恢复至室温10min；加入t4连接酶，室温反应2h。反应结束后，用8％dpage分离纯化连接成功的条带，即为下一轮筛选的dna文库。
[0064]
在筛选过程中为得到灵敏度更高，特异性更好的脱氧核酶探针，需要不断的施加筛选压力。如图3所示，在1
‑
6轮的筛选步骤中允许脱氧核酶筛选时间为1h；在7
‑
9轮的筛选中，降低筛选时间到10min；在第10
‑
11轮的筛选中，再次降低筛选时间到1min。在1
‑
7轮和10
‑
11轮筛选中，对筛选后的切割序列进行普通pcr扩增；在8
‑
9轮筛选中，对筛选后的切割序列进行突变pcr扩增。
[0065]
突变pcr反应体系：
[0066][0067]
10
×
突变pcr缓冲液：70mm mncl2，500mm kcl，100mm tris(ph＝8.3)，0.1％明胶；10
×
突变pcr dntp混合液：2mm dgtp和datp；10mm dctp和dttp。突变pcr反应条件：每个循环95℃变性1min，58℃退火1min，68℃延伸1min，扩增25个循环。无预变性和最终延伸步骤。
[0068]
用如下公式计算切割百分比(clv％)，用以表征每一轮筛选后dna文库的富集程度，如图3所示。经过多轮筛选，当孵育时间缩短至1min，第10、11轮筛选的clv％约为15％且无增加趋势，表明dna文库已富集完成。
[0069][0070]
其中clv％为切割百分比，clv为dpage胶图中切割条带的量，unclv为dpage胶图中未切割条带的量。
[0071]
经克隆测序，挑选出2个高度重复的脱氧核酶探针，分别命名为4#和6#探针。4#和6#探针随机区域(n50)的序列信息如下：
[0072]
4#(51nt)：
[0073]5′‑
ataatagcggaggtaaagcgtgatgccatacgacactgcataggttgggcg
‑3′
(seq id no:8)
[0074]
6#(50nt)：
[0075]5′‑
ataatagcggagagctgcggagatgtatgccgggtcgaacgtgtggcgga
‑3′
(seq id no:9)
[0076]
4#：5
′‑
gtagccttcgcat
‑
r
‑
tgagacatcgcaaccgtgacgcaggttgcgatgtcataatagcggaggtaaagcgtgatgccatacgacactgcataggttgggcgcgaaggctacatcacgctac
‑3′
(seq id no:1),其中，r代表单个插入的rna碱基a(ra)，下划线部分是经筛选后随机库进化出的序列。
[0077]
6#：5
′‑
gtagccttcgcat
‑
r
‑
tgagacatcgcaaccgtgacgcaggttgcgatgtcataatagcggagagctgcggagatgtatgccgggtcgaacgtgtggcggacgaaggctacatcacgctac
‑3′
(seq id no:2)其中，r代表单个插入的rna碱基a(ra)，下划线部分是经筛选后随机库进化出的序列。
[0078]
实施例4脱氧核酶探针性能表征
[0079]
对4#和6#探针进行切割速率测试。将4#和6#探针分别与mcf
‑
10a/hmec和mda
‑
mb
‑
231的ems共孵育，通过跑8％dpage测定不同反应时间点的切割百分比(clv％)，如图4所示。与mcf
‑
10a和hmec的ems共孵育后，4#和6#探针均未发生切割；而与mda
‑
mb
‑
231的em共孵育后，4#和6#探针切割信号随着时间的延长而逐渐增加。经计算，4#和6#探针的切割速率常数k
obs
分别为0.073和0.042min
‑1。
[0080]
对脱氧核酶探针进行特异性表征。以4#探针为例，将探针分别与mda
‑
mb
‑
231和其他非目标细胞系ems共孵育1h，终止反应后，通过跑8％dpage对探针特异性进行表征。如图5所示，除mda
‑
mb
‑
231
‑
rr、mda
‑
mb
‑
231
‑
4175、mda
‑
mb
‑
231
‑
4173和mda
‑
mb
‑
231
‑
gem70这四种mda
‑
mb
‑
231衍生细胞系的ems可触发4#探针切割外，本发明中所测试的其他tnbc细胞亚型ems均对4#探针无明显切割响应。
[0081]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

技术特征：
1.一种特异感应三阴性乳腺癌细胞的脱氧核酶探针，其特征在于，所述脱氧核酶探针的核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。2.根据权利要求1所述的脱氧核酸酶探针，其特征在于，所述脱氧核酶探针的切割速率常数k
obs
分别为0.073和0.042min
‑1。3.权利要求1所述的脱氧核酶探针的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，步骤s1，将底物链、酶链和连接链按物质的量1:1:1混合，并置于t4连接酶反应体系中，构建dna文库；步骤s2，将步骤s1所得的dna文库置于正常乳腺上皮细胞mcf
‑
10a和hmec的胞外代谢物(extracellular mixtures,ems)中，室温孵育，进行负向筛选，分离纯化未切割的dna条带；步骤s3，将步骤s2获得的dna条带置于细胞mda
‑
mb
‑
231的ems中，室温孵育，进行正向筛选，分离纯化切割的dna条带；步骤s4，以步骤s3获得的dna条带为模板进行pcr扩增，并回收正义链；步骤s5，将步骤s4获得的正义链与步骤1中所述的底物链、连接链按物质的量1:1:1混合，按照步骤s1
‑
s4进行重复筛选；步骤s6，计算切割百分比(clv％)，当所述切割百分比达到平台期时，对pcr产物克隆测序，挑选重复度高的序列即为特异感应三阴性乳腺癌的脱氧核酶探针。4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述底物链序列如seq id no:3所示，所述酶链序列如seq id no:4所示，所述连接链序列如seq id no:5所示。5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤s2、s3中的孵育时间为1
‑
1.5h。6.根据权利要求1所述的筛选，其特征在于，所述pcr扩增的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如seq id no:6所示，所述下游引物序列如seq id no:7所示。7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述重复筛选中孵育时间随着重复次数的递增而逐步缩减为1min，所述重复筛选的次数为10
‑
15次。8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，在最后2
‑
3次筛选中采用突变pcr扩增。9.权利要求1所述的脱氧核酶探针在特异性切割三阴性乳腺癌胞外代谢物中的应用，其特征在于，所述三阴性乳腺癌胞外代谢物为细胞系mda
‑
mb
‑
231胞外代谢物。10.权利要求1所述的脱氧核酶探针在制备特异性快速检测三阴性乳腺癌细胞的装置中的应用。
技术总结
本发明公开了一种特异感应三阴性乳腺癌的脱氧核酶探针及筛选方法。本发明通过“对冲抵消”的差异筛选策略，在目标分子未知的情况下，获得了特异感应TNBC细胞系MDA


技术研发人员：顾宏周 胡沁沁 佟宗轩 江一舟 邵志敏 刘西禹 葛丽萍 傅彤
受保护的技术使用者：复旦大学附属肿瘤医院
技术研发日：2021.04.02
技术公布日：2021/6/29