与肝细胞癌相关的lncRNA及其应用的制作方法

专利2022-05-10  2


与肝细胞癌相关的lncrna及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤领域,具体涉及与肝细胞癌相关的lncrna及其应用。


背景技术:

2.肝癌是全球性的重大公共卫生问题,是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球恶性肿瘤发病率的第五位,死亡率高居第四位,且发病率逐年上升,2021年肝癌新增病例已经超过90万,到2025年预计每年新增病例数将超过100万,每年可导致83万名患者死亡。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是最常见的原发性肝癌,约占原发性肝癌的90%,下文中的肝癌均指肝细胞癌。hcc的危险因素包括长期饮酒、糖尿病或肥胖相关的非酒精性脂肪肝(non

alcoholic steatohepatitis,nash)、hbv或hcv感染、黄曲霉毒素b1摄入、遗传性血色病等。虽然肝癌临床早期诊断和治疗有了很大提高,但因肝癌复发率高,患者的5年生存率仍偏低。因此迫切需要研究肝癌发生、发展的潜在分子机制,以便肝癌的诊断和治疗。
3.发明人目前的研究发现,多种lncrna在肝癌患者中表达异常,这些异常表达的lncrna参与肝癌的发生、发展、复发及转移,因此这类lncrna能够作为hcc诊断、治疗的潜在生物标志物。hulc是第一个被发现的,在肝癌组织中异常高表达的lncrna。与正常组织相比,hulc在肝癌组织和肝结肠转移瘤中明显高表达,且hulc与肿瘤组织学分级和hbv感染程度呈正相关。对患者血浆样本进行分析,发现hulc在肝癌患者血浆中显著高表达。hulc可以被camp、creb和igf2等调节,从而促进肝癌细胞增殖、转移,体内实验也证实hulc能够促进裸鼠皮下移植瘤的生长。
4.正常情况下,h19在胚胎发育期具有较高的表达丰度,而在成人肝脏中的表达量微乎其微。但是在肝组织再生和肝癌发生过程中,h19被重新活化,表达明显升高。深入研究表明,在肝癌中,h19有3个比较明显的甲基化表达位点,高甲基化与肝癌密切相关。基于上述h19的表达特性,有研究将h19纳为肝癌的特定治疗靶点。
5.meg3在各类正常组织中均有表达,但是在某些肿瘤中,其表达会明显降低。在肝癌中,meg3均存在不同程度的甲基化,进一步实验表明,meg3的表达量降低的程度与甲基化程度呈正相关。而高甲基化的meg3可以通过mir

29,调节肝癌的增殖。pten及同源的ptenp1,能够负向调控pi3k/akt/mtor信号通路,从而抑制肿瘤的发生发展。但是,在肝癌中,pten及同源的ptenp1的表达量明显降低。在肝癌细胞中,过表达ptenp1能显著抑制细胞的增殖、迁移、侵袭及远处转移。
6.xist和ftx在肝癌组织中的表达明显低于正常肝组织。xist能够通过抑制mir

92b的表达,从而抑制hcc的增殖和转移。ftx是xist的调节因素,功能与xist类似,能作用于wnt/β

catenin信号通路,减少emt的表达,并与mcm2的复制起始段结合,影响mcm2的表达。xist和ftx单独分析,与肝癌临床特征关联不大,但二者结合分析,能够较好地判断肝癌患者的预后,因此两者联合运用可能成为肝癌的潜在预后评估标志物。
7.上述异常表达的lncrna参与肝癌的发生发展,但其具体分子机制并未完全发掘,
因此它们作为肝癌诊断标志物或治疗靶点的可靠性有待进一步验证。lncrna应用于临床,应该具有方便、低成本等特点,但上述lncrna的检测很多包含多个蛋白分子,或dna双链甲基化、转录起始位点等的检测,大部分医疗机构并不具备相关检测能力,且检测成本较为昂贵,因此其推广应用价值有限,也未能对肝癌患者分级及预后进行确切诊断。因此迫切需要寻找新型分子标记物,以提高肝癌诊断的灵敏性和预后判断的准确性,明确其在肝癌患者中的临床价值,这对于提高肝癌患者的生存率具有重大的临床意义。
8.lncrna

bf368575是人们发现的众多lncrna中的一条,有关其功能报导罕见,cn107460234a公开了由48个lncrna组成的分子标签,可以高准确性地区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌四个人群。lncrna

bf368575是48个lncrna组成的分子标签中的一条,其变化倍数(患者/hc)为7.7倍,处于中游,未有数据显示其单独具有何种效用。


技术实现要素:

9.本发明的目的在于提供基于lncrna

bf368575的新应用。
10.本发明所采取的技术方案是:发明人通过lncrna表达谱芯片筛选出bf368575,通过qrt

pcr技术检测了16对肝癌临床组织样本及相应的正常肝组织中lncrna

bf368575的表达情况,结果显示lncrna

bf368575在肝癌组织中的表达水平高于正常组织。后又通过人肝癌组织芯片(hlivh180su15)对lncrna

bf368575表达进行验证,证实lncrna

bf368575不仅在肝癌组织中高表达,且其表达量与肝癌患者的病理分级呈正相关。进一步分析lncrna

bf368575与患者生存期,发现lncrna

bf368575高表达患者的无疾病生存期(dfs)明显短于低表达患者,单因素分析表明lncrna

bf368575与肝癌患者总生存期(os)和无疾病生存期(dfs)密切相关,提示lncrna

bf368575可能是肝癌发生发展中的重要调控因子。
11.接着,发明人对lncrna

bf368575进行了体外细胞功能学的研究,进一步的实验研究表明,与对照组细胞株相比,高表达lncrna

bf368575的肝癌细胞株具有更强的增殖能力。沉默内源性lncrna

bf368575表达后,mhcc97h和snu

423肝癌细胞株增殖能力减弱,过表达lncrna

bf368575后,hepg2和bel7402肝癌细胞株增殖能力明显增强。体内实验证实,过表达lncrna

bf368575能有效促进裸鼠皮下成瘤。由此可见,lncrna

bf368575在肝癌中起着促进肿瘤发生发展的作用。进一步的机制研究表明,lncrna

bf368575可能通过上调pi3k/akt/mtor信号通路关键蛋白的磷酸化水平,激活pi3k/akt/mtor信号通路,进而促进肝癌细胞增殖。而lncrna

bf368575的促癌作用可以被靶向药物ly294002抑制,这表明lncrna

bf368575可以作为肿瘤抑制剂等相关药物的作用靶点。rna结合蛋白免疫共沉淀实验(rip)证实lncrna

bf368575可与p

mtor(ser2448)、p

akt(thr308)和p

4e

bp1(thr37/46)直接结合,从而抑制磷酸化蛋白降解。
12.本发明的第一个方面,提供:lncrna

bf368575表达量的定量试剂在制备肝细胞癌预后检测试剂中的应用。
13.在一些实例中,所述定量试剂选自高通量lncrna芯片、组织芯片或pcr试剂。
14.在一些实例中,lncrna

bf368575表达量显著升高时,判定为肝细胞癌治疗后复发。
15.在一些实例中,所述定量试剂检测的样本为患者血清和/或组织。
16.本发明的第二个方面,提供:一种肝细胞癌预后分析系统,包括:lncrna表达量检测装置,用于检测样本中lncrna

bf368575的表达量;预后分析装置,基于lncrna

bf368575的表达量,确定肝细胞癌预后;结果输出装置,用于输出预后分析装置分析得到的结果。
17.在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中,所述lncrna表达量检测装置选自高通量lncrna芯片、组织芯片或pcr试剂。
18.在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中,lncrna

bf368575表达量显著升高时,判定为肝细胞癌治疗后复发。
19.在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中,所述lncrna表达量检测装置分析的样本为患者血清和/或组织。
20.本发明的第三个方面,提供:抑制lncrna

bf368575表达的试剂在制备肝细胞癌治疗药物中的应用。
21.在一些实例中,所述试剂选自针对lncrna

bf368575的mirna、sirna或shrna、lncrna

bf368575启动子抑制剂。
22.本发明的有益效果是:本发明通过lncrna表达谱芯片筛选出bf368575,并检测肝癌组织中lncrna

bf368575表达情况,发现肝癌组织中lncrna

bf368575高表达,且lncrna

bf368575的表达水平与肝癌患者的预后明显相关。本发明的一些实例,通过检测肝癌患者lncrna

bf368575的表达量,可以有效预测肝癌患者的预后,明确患者肝癌复发的风险,可以更好地进行个性化用药,提高患者的生存质量。
23.本发明对lncrna

bf368575进行细胞功能学的研究,发现高表达lncrna

bf368575的肝癌细胞具有更强的增殖能力,而沉默内源性lncrna

bf368575表达后,肝癌细胞增殖能力减弱。本发明的一些实例,通过抑制lncrna

bf368575的表达,有望辅助肝癌的治疗。
附图说明
24.图1是lncrna

bf368575在肝癌组织和肝癌细胞中的表达量;图2是lncrna

bf368575表达量及与预后相关的结果;图3、4、5、6是lncrna

bf368575促进肝癌细胞增殖的结果;图7是lncrna

bf368575促进裸鼠皮下成瘤的结果;图8、9是lncrna

bf368575正向调节pi3k/akt/mtor信号通路;图10 是ly294002能部分逆转lncrna

bf368575的促癌作用;图11是lncrna

bf368575能与p

mtor(ser2448)、p

akt(thr308)和p

4e

bp1(thr37/46)相互结合。
具体实施方式
25.下面结合实验数据,进一步说明本发明的技术方案。
26.研究表明lncrna

bf368575在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达:首先,采用qrt

pcr检测了16对肝癌临床组织样本和相应的正常肝组织中lncrna

bf368575的表达情况,结果显示肝癌组织中lncrna

bf368575的表达水平高于正常组织(图1a)。qrt

pcr检测4株肝癌细胞和1株正常肝细胞系,发现lncrna

bf368575在mhcc97h、snu

423、hepg2高表达(图1b)。
27.由于lncrna的生物学功能与其细胞内定位密切相关,因此发明人对hepg2细胞进行核质rna分离后,逆转录成cdna,并进行qpcr及dna凝胶电泳,结果显示lncrna

bf368575在细胞质中明显高表达(图1c和1d)。上述实验表明,lncrna

bf368575在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达,且lncrna

bf368575在肝癌细胞细胞质中的表达量明显高于其在细胞核中的表达量。
28.研究表明lncrna

bf368575表达水平与肝癌的发展相关:为了探讨lncrna

bf368575在hcc中的临床意义,发明人从芯超生物技术公司获得了人肝癌组织芯片(hlivh180su15)。对上述获得的人肝癌组织芯片进行原位杂交,结果显示lncrna

bf368575在肝癌组织与癌旁组织的表达存在显著差异(表2、图2a和2b)。
29.接下来发明人分析了lncrna

bf368575表达水平与肝癌患者临床病理特征的相关性(表1),结果显示lncrna

bf368575表达水平与肿瘤分级密切相关。
30.肿瘤分级是判断肝癌预后的重要标志,生存分析结果提示低表达lncrna

bf368575是患者无疾病生存期(dfs)的有利预后因素(图2c和2d)。
31.从lncrna

bf368575对肝癌患者总生存期影响的单因素和多因素分析看,lncrna

bf368575的表达量与肝癌患者的总生存期并未存在明显相关性(表3)。
32.上述实验及分析表明,lncrna

bf368575在肝癌组织中显著高表达,高表达lncrna

bf368575严重影响了肝癌患者的无病生存期,且与肝癌病理分级较高密切相关。
33.表1、lncrna

bf368575与肝癌患者临床病理特征的关系
*统计学显著(p<0.05)。
[0034] 表2、 lncrna

bf368575在肝癌组织和癌旁组织的表达量表3、 lncrna

bf368575对肝癌患者总生存期影响的单因素和多因素分析
*统计学显著(p<0.05)。
[0035]
研究表明lncrna

bf368575在hcc中促进肝癌细胞增殖:鉴于lncrna

bf368575在肝癌组织中高表达,并与肝癌患者预后密切相关。为研究lncrna

bf368575在肝癌发生发展中的作用,发明人构建了lncrna

bf368575稳定过表达和敲降细胞株。在hepg2和bel

7402细胞中稳定过表达lncrna

bf368575,在snu

423和mhcc97h稳定敲降lncrna

bf368575。构建完成后,提取肝癌细胞rna,并用qrt

pcr进行检测,发现lncrna

bf368575在hepg2和bel

7402的稳定过表达(图3a),以及在snu

423和mhcc97h的稳定敲降(图3b),均符合预期,表明lncrna

bf368575稳定过表达和敲降细胞株构建成功。
[0036]
过表达或敲降lncrna

bf368575后,用cck

8试剂对4株肝癌细胞的增殖能力进行检测,发现过表达lncrna

bf368575能显著促进肝癌细胞的增殖,而敲降lncrna

bf368575则抑制肝癌细胞的增殖(图4)。
[0037]
为进一步验证lncrna

bf368575对肝癌细胞增殖的影响,对稳定过表达和敲降lncrna

bf368575的肝癌细胞株进行平板克隆实验。实验结果表明过表达lncrna

bf368575能显著促进肝癌细胞的克隆形成能力(图5),而敲降lncrna

bf368575则显著抑制肝癌细胞的克隆形成能力(图6)。
[0038]
上述实验结果表明,过表达lncrna

bf368575可促进肝癌细胞的增殖,而抑制lncrna

bf368575则发挥抑制肝癌细胞增殖的作用。
[0039]
研究表明lncrna

bf368575在裸鼠皮下成瘤模型中促进肝癌细胞的肿瘤形成:为进一步确定lncrna

bf368575在体内是否也具有促进肝癌细胞增殖的作用,发
明人将lncrna

bf368575高表达的hepg2细胞注射到裸鼠皮下,并设置对照组。
[0040]
与对照组相比,lncrna

bf368575过表达组可以显著促进裸鼠皮下肿瘤的生长,肿瘤出现的时间较对照组提前了近一周(图7b)。过表达lncrna

bf368575的hepg2细胞,裸鼠皮下肿瘤体积明显较大(图7a和b),肿瘤重量显著增加(图7c)。从裸鼠肿瘤组织中提取rna,并进行qrt

pcr检测,发现裸鼠肿瘤组织中lncrna

bf368575表达显著上升(图7d),表明裸鼠皮下成瘤源于稳定过表达lncrna

bf368575的hepg2细胞,且在成瘤过程中,lncrna

bf368575一直发挥作用。
[0041]
上述实验结果说明,lncrna

bf368575过表达能有效促进裸鼠皮下成瘤。
[0042]
研究表明lncrna

bf368575通过正向调控pi3k/akt/mtor信号通路促进肝癌细胞生长:为探究lncrna

bf368575促进肝癌发生发展的分子机制,对稳定过表达lncrna

bf368575的hepg2和bel

7402细胞以及稳定敲降lncrna

bf368575的snu

423和mhcc97h细胞中的pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白pi3k、p

pi3k(tyr607)、akt、p

akt(thr308)、mtor、p

mtor(ser2448)、4e

bp1、p

4e

bp1(thr37/46)、s6和p

s6(ser235/236)进行蛋白印迹检测,并计算灰度值,进行统计学分析。
[0043]
结果显示在过表达lncrna

bf368575的hepg2和bel

7402肝癌细胞中,pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白的总量并未发生明显改变,但关键蛋白的磷酸化水平显著升高(图8a、图9a和b);而在敲降lncrna

bf368575的snu

423和mhcc97h细胞中,pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白的总量也未发生明显改变,但关键蛋白的磷酸化水平显著降低(图8b、图9c和d)。
[0044]
上述实验结果表明,lncrna

bf368575可能通过pi3k/akt/mtor信号通路促进肝癌细胞的增殖。
[0045]
研究表明ly294002能逆转lncrna

bf368575的促癌作用:在稳定过表达lncrna

bf368575的hepg2和bel

7402细胞中,加入一定浓度的ly294002,能逆转过表达lncrna

bf368575导致的细胞增殖能力增强(图10a)。采用软琼脂成球实验,对ly294002拮抗lncrna

bf368575的作用进行进一步验证。
[0046]
结果显示ly294002可以逆转lncrna

bf368575对肝癌细胞hepg2和bel

7402的促生长作用(图10b)。蛋白印迹检测结果显示ly294002能够逆转过表达lncrna

bf368575导致的pi3k/akt/mtor信号通路关键蛋白的磷酸化,尤其是p

pi3k(tyr607)、p

akt(thr308)和p

s6(ser235/236)这三个蛋白的磷酸化(图10c)。
[0047]
上述实验结果表明,ly294002能逆转lncrna

bf368575在肝癌细胞中的促癌作用。
[0048]
研究表明lncrna

bf368575通过直接与pi3k/akt/mtor信号通路磷酸化蛋白结合,发挥促癌作用:上述实验结果表明,lncrna

bf368575可以影响pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白的磷酸化水平,为了进一步探究两者之间的具体作用机制,发明人进行了rna结合蛋白免疫共沉淀实验(rip)。采用p

mtor(ser2448)、p

akt(thr308)和p

4e

bp1(thr37/46)对rna进行沉淀,逆转录扩增后对dna进行凝胶电泳检测。电泳结果发现,p

mtor(ser2448)、p

akt(thr308)和p

4e

bp1(thr37/46)均能从细胞裂解产物中结合lncrna

bf368575,其中p

akt(thr308)和p

4e

bp1(thr37/46)结合的lncrna

bf368575最多(图11)。探究lncrna

bf368575与p

mtor(ser2448)、p

akt(thr308)和p

4e

bp1(thr37/46)相互结合的方式,明确lncrna

bf368575对下游蛋白的影响,能进一步阐明lncrna

bf368575发挥促癌作用的分子机制,为肝癌的防治提供新的方向。
[0049]
总结:综上所述,发明人的研究发现了一个新的lncrna

bf368575,它在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达,高表达lncrna

bf368575与肝癌患者较短的dfs密切相关,lncrna

bf368575表达越低预后越好。功能实验显示lncrna

bf368575在体内外均能促进肝癌细胞的增殖。机制上lncrna

bf368575可能通过pi3k/akt/mtor信号通路发挥促癌作用。鉴于lncrna

bf368575的表达水平与肝癌患者的预后明显相关,因此lncrna

bf368575可用于预测肝癌预后。鉴于lncrna

bf368575可通过直接与pi3k/akt/mtor信号通路磷酸化蛋白结合促进肝癌生长,且其促癌作用可以被ly294002逆转,因此lncrna

bf368575可作为治疗肝癌的一个新的治疗靶点。
[0050]
以上是对本发明所作的进一步详细说明,不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的简单推演或替换,都在本发明的保护范围之内。
[0051]
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转载请注明原文地址: https://doc.8miu.com/read-1549970.html

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