与肝细胞癌相关的lncRNA及其应用的制作方法

与肝细胞癌相关的lncrna及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤领域，具体涉及与肝细胞癌相关的lncrna及其应用。


背景技术：

2.肝癌是全球性的重大公共卫生问题，是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全球恶性肿瘤发病率的第五位，死亡率高居第四位，且发病率逐年上升，2021年肝癌新增病例已经超过90万，到2025年预计每年新增病例数将超过100万，每年可导致83万名患者死亡。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是最常见的原发性肝癌，约占原发性肝癌的90%，下文中的肝癌均指肝细胞癌。hcc的危险因素包括长期饮酒、糖尿病或肥胖相关的非酒精性脂肪肝（non
‑
alcoholic steatohepatitis，nash）、hbv或hcv感染、黄曲霉毒素b1摄入、遗传性血色病等。虽然肝癌临床早期诊断和治疗有了很大提高，但因肝癌复发率高，患者的5年生存率仍偏低。因此迫切需要研究肝癌发生、发展的潜在分子机制，以便肝癌的诊断和治疗。
3.发明人目前的研究发现，多种lncrna在肝癌患者中表达异常，这些异常表达的lncrna参与肝癌的发生、发展、复发及转移，因此这类lncrna能够作为hcc诊断、治疗的潜在生物标志物。hulc是第一个被发现的，在肝癌组织中异常高表达的lncrna。与正常组织相比，hulc在肝癌组织和肝结肠转移瘤中明显高表达，且hulc与肿瘤组织学分级和hbv感染程度呈正相关。对患者血浆样本进行分析，发现hulc在肝癌患者血浆中显著高表达。hulc可以被camp、creb和igf2等调节，从而促进肝癌细胞增殖、转移，体内实验也证实hulc能够促进裸鼠皮下移植瘤的生长。
4.正常情况下，h19在胚胎发育期具有较高的表达丰度，而在成人肝脏中的表达量微乎其微。但是在肝组织再生和肝癌发生过程中，h19被重新活化，表达明显升高。深入研究表明，在肝癌中，h19有3个比较明显的甲基化表达位点，高甲基化与肝癌密切相关。基于上述h19的表达特性，有研究将h19纳为肝癌的特定治疗靶点。
5.meg3在各类正常组织中均有表达，但是在某些肿瘤中，其表达会明显降低。在肝癌中，meg3均存在不同程度的甲基化，进一步实验表明，meg3的表达量降低的程度与甲基化程度呈正相关。而高甲基化的meg3可以通过mir
‑
29，调节肝癌的增殖。pten及同源的ptenp1，能够负向调控pi3k/akt/mtor信号通路，从而抑制肿瘤的发生发展。但是，在肝癌中，pten及同源的ptenp1的表达量明显降低。在肝癌细胞中，过表达ptenp1能显著抑制细胞的增殖、迁移、侵袭及远处转移。
6.xist和ftx在肝癌组织中的表达明显低于正常肝组织。xist能够通过抑制mir
‑
92b的表达，从而抑制hcc的增殖和转移。ftx是xist的调节因素，功能与xist类似，能作用于wnt/β
‑
catenin信号通路，减少emt的表达，并与mcm2的复制起始段结合，影响mcm2的表达。xist和ftx单独分析，与肝癌临床特征关联不大，但二者结合分析，能够较好地判断肝癌患者的预后，因此两者联合运用可能成为肝癌的潜在预后评估标志物。
7.上述异常表达的lncrna参与肝癌的发生发展，但其具体分子机制并未完全发掘，
因此它们作为肝癌诊断标志物或治疗靶点的可靠性有待进一步验证。lncrna应用于临床，应该具有方便、低成本等特点，但上述lncrna的检测很多包含多个蛋白分子，或dna双链甲基化、转录起始位点等的检测，大部分医疗机构并不具备相关检测能力，且检测成本较为昂贵，因此其推广应用价值有限，也未能对肝癌患者分级及预后进行确切诊断。因此迫切需要寻找新型分子标记物，以提高肝癌诊断的灵敏性和预后判断的准确性，明确其在肝癌患者中的临床价值，这对于提高肝癌患者的生存率具有重大的临床意义。
8.lncrna
‑
bf368575是人们发现的众多lncrna中的一条，有关其功能报导罕见，cn107460234a公开了由48个lncrna组成的分子标签，可以高准确性地区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌四个人群。lncrna
‑
bf368575是48个lncrna组成的分子标签中的一条，其变化倍数(患者/hc)为7.7倍，处于中游，未有数据显示其单独具有何种效用。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供基于lncrna
‑
bf368575的新应用。
10.本发明所采取的技术方案是：发明人通过lncrna表达谱芯片筛选出bf368575，通过qrt
‑
pcr技术检测了16对肝癌临床组织样本及相应的正常肝组织中lncrna
‑
bf368575的表达情况，结果显示lncrna
‑
bf368575在肝癌组织中的表达水平高于正常组织。后又通过人肝癌组织芯片（hlivh180su15）对lncrna
‑
bf368575表达进行验证，证实lncrna
‑
bf368575不仅在肝癌组织中高表达，且其表达量与肝癌患者的病理分级呈正相关。进一步分析lncrna
‑
bf368575与患者生存期，发现lncrna
‑
bf368575高表达患者的无疾病生存期（dfs）明显短于低表达患者，单因素分析表明lncrna
‑
bf368575与肝癌患者总生存期（os）和无疾病生存期（dfs）密切相关，提示lncrna
‑
bf368575可能是肝癌发生发展中的重要调控因子。
11.接着，发明人对lncrna
‑
bf368575进行了体外细胞功能学的研究，进一步的实验研究表明，与对照组细胞株相比，高表达lncrna
‑
bf368575的肝癌细胞株具有更强的增殖能力。沉默内源性lncrna
‑
bf368575表达后，mhcc97h和snu
‑
423肝癌细胞株增殖能力减弱，过表达lncrna
‑
bf368575后，hepg2和bel7402肝癌细胞株增殖能力明显增强。体内实验证实，过表达lncrna
‑
bf368575能有效促进裸鼠皮下成瘤。由此可见，lncrna
‑
bf368575在肝癌中起着促进肿瘤发生发展的作用。进一步的机制研究表明，lncrna
‑
bf368575可能通过上调pi3k/akt/mtor信号通路关键蛋白的磷酸化水平，激活pi3k/akt/mtor信号通路，进而促进肝癌细胞增殖。而lncrna
‑
bf368575的促癌作用可以被靶向药物ly294002抑制，这表明lncrna
‑
bf368575可以作为肿瘤抑制剂等相关药物的作用靶点。rna结合蛋白免疫共沉淀实验（rip）证实lncrna
‑
bf368575可与p
‑
mtor（ser2448）、p
‑
akt（thr308）和p
‑
4e
‑
bp1（thr37/46）直接结合，从而抑制磷酸化蛋白降解。
12.本发明的第一个方面，提供：lncrna
‑
bf368575表达量的定量试剂在制备肝细胞癌预后检测试剂中的应用。
13.在一些实例中，所述定量试剂选自高通量lncrna芯片、组织芯片或pcr试剂。
14.在一些实例中，lncrna
‑
bf368575表达量显著升高时，判定为肝细胞癌治疗后复发。
15.在一些实例中，所述定量试剂检测的样本为患者血清和/或组织。
16.本发明的第二个方面，提供：一种肝细胞癌预后分析系统，包括：lncrna表达量检测装置，用于检测样本中lncrna
‑
bf368575的表达量；预后分析装置，基于lncrna
‑
bf368575的表达量，确定肝细胞癌预后；结果输出装置，用于输出预后分析装置分析得到的结果。
17.在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中，所述lncrna表达量检测装置选自高通量lncrna芯片、组织芯片或pcr试剂。
18.在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中，lncrna
‑
bf368575表达量显著升高时，判定为肝细胞癌治疗后复发。
19.在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中，所述lncrna表达量检测装置分析的样本为患者血清和/或组织。
20.本发明的第三个方面，提供：抑制lncrna
‑
bf368575表达的试剂在制备肝细胞癌治疗药物中的应用。
21.在一些实例中，所述试剂选自针对lncrna
‑
bf368575的mirna、sirna或shrna、lncrna
‑
bf368575启动子抑制剂。
22.本发明的有益效果是：本发明通过lncrna表达谱芯片筛选出bf368575，并检测肝癌组织中lncrna
‑
bf368575表达情况，发现肝癌组织中lncrna
‑
bf368575高表达，且lncrna
‑
bf368575的表达水平与肝癌患者的预后明显相关。本发明的一些实例，通过检测肝癌患者lncrna
‑
bf368575的表达量，可以有效预测肝癌患者的预后，明确患者肝癌复发的风险，可以更好地进行个性化用药，提高患者的生存质量。
23.本发明对lncrna
‑
bf368575进行细胞功能学的研究，发现高表达lncrna
‑
bf368575的肝癌细胞具有更强的增殖能力，而沉默内源性lncrna
‑
bf368575表达后，肝癌细胞增殖能力减弱。本发明的一些实例，通过抑制lncrna
‑
bf368575的表达，有望辅助肝癌的治疗。
附图说明
24.图1是lncrna
‑
bf368575在肝癌组织和肝癌细胞中的表达量；图2是lncrna
‑
bf368575表达量及与预后相关的结果；图3、4、5、6是lncrna
‑
bf368575促进肝癌细胞增殖的结果；图7是lncrna
‑
bf368575促进裸鼠皮下成瘤的结果；图8、9是lncrna
‑
bf368575正向调节pi3k/akt/mtor信号通路；图10 是ly294002能部分逆转lncrna
‑
bf368575的促癌作用；图11是lncrna
‑
bf368575能与p
‑
mtor（ser2448）、p
‑
akt（thr308）和p
‑
4e
‑
bp1（thr37/46）相互结合。
具体实施方式
25.下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
26.研究表明lncrna
‑
bf368575在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达：首先，采用qrt
‑
pcr检测了16对肝癌临床组织样本和相应的正常肝组织中lncrna
‑
bf368575的表达情况，结果显示肝癌组织中lncrna
‑
bf368575的表达水平高于正常组织（图1a）。qrt
‑
pcr检测4株肝癌细胞和1株正常肝细胞系，发现lncrna
‑
bf368575在mhcc97h、snu
‑
423、hepg2高表达（图1b）。
27.由于lncrna的生物学功能与其细胞内定位密切相关，因此发明人对hepg2细胞进行核质rna分离后，逆转录成cdna，并进行qpcr及dna凝胶电泳，结果显示lncrna
‑
bf368575在细胞质中明显高表达（图1c和1d）。上述实验表明，lncrna
‑
bf368575在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达，且lncrna
‑
bf368575在肝癌细胞细胞质中的表达量明显高于其在细胞核中的表达量。
28.研究表明lncrna
‑
bf368575表达水平与肝癌的发展相关：为了探讨lncrna
‑
bf368575在hcc中的临床意义，发明人从芯超生物技术公司获得了人肝癌组织芯片（hlivh180su15）。对上述获得的人肝癌组织芯片进行原位杂交，结果显示lncrna
‑
bf368575在肝癌组织与癌旁组织的表达存在显著差异（表2、图2a和2b）。
29.接下来发明人分析了lncrna
‑
bf368575表达水平与肝癌患者临床病理特征的相关性（表1），结果显示lncrna
‑
bf368575表达水平与肿瘤分级密切相关。
30.肿瘤分级是判断肝癌预后的重要标志，生存分析结果提示低表达lncrna
‑
bf368575是患者无疾病生存期（dfs）的有利预后因素（图2c和2d）。
31.从lncrna
‑
bf368575对肝癌患者总生存期影响的单因素和多因素分析看，lncrna
‑
bf368575的表达量与肝癌患者的总生存期并未存在明显相关性（表3）。
32.上述实验及分析表明，lncrna
‑
bf368575在肝癌组织中显著高表达，高表达lncrna
‑
bf368575严重影响了肝癌患者的无病生存期，且与肝癌病理分级较高密切相关。
33.表1、lncrna
‑
bf368575与肝癌患者临床病理特征的关系
*统计学显著(p<0.05)。
[0034] 表2、 lncrna
‑
bf368575在肝癌组织和癌旁组织的表达量表3、 lncrna
‑
bf368575对肝癌患者总生存期影响的单因素和多因素分析
*统计学显著(p<0.05)。
[0035]
研究表明lncrna
‑
bf368575在hcc中促进肝癌细胞增殖：鉴于lncrna
‑
bf368575在肝癌组织中高表达，并与肝癌患者预后密切相关。为研究lncrna
‑
bf368575在肝癌发生发展中的作用，发明人构建了lncrna
‑
bf368575稳定过表达和敲降细胞株。在hepg2和bel
‑
7402细胞中稳定过表达lncrna
‑
bf368575，在snu
‑
423和mhcc97h稳定敲降lncrna
‑
bf368575。构建完成后，提取肝癌细胞rna，并用qrt
‑
pcr进行检测，发现lncrna
‑
bf368575在hepg2和bel
‑
7402的稳定过表达（图3a），以及在snu
‑
423和mhcc97h的稳定敲降（图3b），均符合预期，表明lncrna
‑
bf368575稳定过表达和敲降细胞株构建成功。
[0036]
过表达或敲降lncrna
‑
bf368575后，用cck
‑
8试剂对4株肝癌细胞的增殖能力进行检测，发现过表达lncrna
‑
bf368575能显著促进肝癌细胞的增殖，而敲降lncrna
‑
bf368575则抑制肝癌细胞的增殖（图4）。
[0037]
为进一步验证lncrna
‑
bf368575对肝癌细胞增殖的影响，对稳定过表达和敲降lncrna
‑
bf368575的肝癌细胞株进行平板克隆实验。实验结果表明过表达lncrna
‑
bf368575能显著促进肝癌细胞的克隆形成能力（图5），而敲降lncrna
‑
bf368575则显著抑制肝癌细胞的克隆形成能力（图6）。
[0038]
上述实验结果表明，过表达lncrna
‑
bf368575可促进肝癌细胞的增殖，而抑制lncrna
‑
bf368575则发挥抑制肝癌细胞增殖的作用。
[0039]
研究表明lncrna
‑
bf368575在裸鼠皮下成瘤模型中促进肝癌细胞的肿瘤形成：为进一步确定lncrna
‑
bf368575在体内是否也具有促进肝癌细胞增殖的作用，发
明人将lncrna
‑
bf368575高表达的hepg2细胞注射到裸鼠皮下，并设置对照组。
[0040]
与对照组相比，lncrna
‑
bf368575过表达组可以显著促进裸鼠皮下肿瘤的生长，肿瘤出现的时间较对照组提前了近一周（图7b）。过表达lncrna
‑
bf368575的hepg2细胞，裸鼠皮下肿瘤体积明显较大（图7a和b），肿瘤重量显著增加（图7c）。从裸鼠肿瘤组织中提取rna，并进行qrt
‑
pcr检测，发现裸鼠肿瘤组织中lncrna
‑
bf368575表达显著上升（图7d），表明裸鼠皮下成瘤源于稳定过表达lncrna
‑
bf368575的hepg2细胞，且在成瘤过程中，lncrna
‑
bf368575一直发挥作用。
[0041]
上述实验结果说明，lncrna
‑
bf368575过表达能有效促进裸鼠皮下成瘤。
[0042]
研究表明lncrna
‑
bf368575通过正向调控pi3k/akt/mtor信号通路促进肝癌细胞生长：为探究lncrna
‑
bf368575促进肝癌发生发展的分子机制，对稳定过表达lncrna
‑
bf368575的hepg2和bel
‑
7402细胞以及稳定敲降lncrna
‑
bf368575的snu
‑
423和mhcc97h细胞中的pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白pi3k、p
‑
pi3k（tyr607）、akt、p
‑
akt（thr308）、mtor、p
‑
mtor（ser2448）、4e
‑
bp1、p
‑
4e
‑
bp1（thr37/46）、s6和p
‑
s6（ser235/236）进行蛋白印迹检测，并计算灰度值，进行统计学分析。
[0043]
结果显示在过表达lncrna
‑
bf368575的hepg2和bel
‑
7402肝癌细胞中，pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白的总量并未发生明显改变，但关键蛋白的磷酸化水平显著升高（图8a、图9a和b）；而在敲降lncrna
‑
bf368575的snu
‑
423和mhcc97h细胞中，pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白的总量也未发生明显改变，但关键蛋白的磷酸化水平显著降低（图8b、图9c和d）。
[0044]
上述实验结果表明，lncrna
‑
bf368575可能通过pi3k/akt/mtor信号通路促进肝癌细胞的增殖。
[0045]
研究表明ly294002能逆转lncrna
‑
bf368575的促癌作用：在稳定过表达lncrna
‑
bf368575的hepg2和bel
‑
7402细胞中，加入一定浓度的ly294002，能逆转过表达lncrna
‑
bf368575导致的细胞增殖能力增强(图10a)。采用软琼脂成球实验，对ly294002拮抗lncrna
‑
bf368575的作用进行进一步验证。
[0046]
结果显示ly294002可以逆转lncrna
‑
bf368575对肝癌细胞hepg2和bel
‑
7402的促生长作用（图10b）。蛋白印迹检测结果显示ly294002能够逆转过表达lncrna
‑
bf368575导致的pi3k/akt/mtor信号通路关键蛋白的磷酸化，尤其是p
‑
pi3k（tyr607）、p
‑
akt（thr308）和p
‑
s6（ser235/236）这三个蛋白的磷酸化（图10c）。
[0047]
上述实验结果表明，ly294002能逆转lncrna
‑
bf368575在肝癌细胞中的促癌作用。
[0048]
研究表明lncrna
‑
bf368575通过直接与pi3k/akt/mtor信号通路磷酸化蛋白结合，发挥促癌作用：上述实验结果表明，lncrna
‑
bf368575可以影响pi3k/akt/mtor信号通路的关键蛋白的磷酸化水平，为了进一步探究两者之间的具体作用机制，发明人进行了rna结合蛋白免疫共沉淀实验（rip）。采用p
‑
mtor（ser2448）、p
‑
akt（thr308）和p
‑
4e
‑
bp1（thr37/46）对rna进行沉淀，逆转录扩增后对dna进行凝胶电泳检测。电泳结果发现，p
‑
mtor（ser2448）、p
‑
akt（thr308）和p
‑
4e
‑
bp1（thr37/46）均能从细胞裂解产物中结合lncrna
‑
bf368575，其中p
‑
akt（thr308）和p
‑
4e
‑
bp1（thr37/46）结合的lncrna
‑
bf368575最多（图11）。探究lncrna
‑
bf368575与p
‑
mtor（ser2448）、p
‑
akt（thr308）和p
‑
4e
‑
bp1（thr37/46）相互结合的方式，明确lncrna
‑
bf368575对下游蛋白的影响，能进一步阐明lncrna
‑
bf368575发挥促癌作用的分子机制，为肝癌的防治提供新的方向。
[0049]
总结：综上所述，发明人的研究发现了一个新的lncrna
‑
bf368575，它在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达，高表达lncrna
‑
bf368575与肝癌患者较短的dfs密切相关，lncrna
‑
bf368575表达越低预后越好。功能实验显示lncrna
‑
bf368575在体内外均能促进肝癌细胞的增殖。机制上lncrna
‑
bf368575可能通过pi3k/akt/mtor信号通路发挥促癌作用。鉴于lncrna
‑
bf368575的表达水平与肝癌患者的预后明显相关，因此lncrna
‑
bf368575可用于预测肝癌预后。鉴于lncrna
‑
bf368575可通过直接与pi3k/akt/mtor信号通路磷酸化蛋白结合促进肝癌生长，且其促癌作用可以被ly294002逆转，因此lncrna
‑
bf368575可作为治疗肝癌的一个新的治疗靶点。
[0050]
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
[0051]
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