含有配体的充气微泡的制作方法

1.本发明涉及含有配体的充气微泡的新配制物，其可有利地用于例如通过浮力分离细胞或生物材料的方法中。


背景技术：

2.用于从复杂的细胞混合物中(例如在如血液或血浆的生理流体中)分离出所需细胞的方法在许多生物医学领域中是有用的。在一种应用如基因治疗领域中，从患者身上获取细胞，进行处理以表达所需基因，和之后注回给患者。另一种可能的应用是用于分离循环的肿瘤细胞(ctc)或循环的生物标记物(例如液体活检)。
3.可以应用抗体或其它分子来标记用于随后分离的所需细胞。抗体可以共轭到磁性微米颗粒或纳米颗粒上。当与异质细胞混合物混合时，磁性颗粒结合到靶向细胞上和之后应用磁场分离。这一概念已经在几种商业产品(dynabeads,magnetic
‑
activated cell sorting)中得到了实现。主要缺点是难以从靶向细胞中移除小颗粒。
4.最近描述了基于浮力的方法(例如参见us 2015/0219636)，其中将气体包封的微泡或微米颗粒用作浮力活化细胞分选(bacs)的反应试剂。在这种情况下，微泡/细胞的相互作用也用抗体或其它分子来实施。正如us2015/0219636中所提到的，微泡结合效率随配体密度增加。
5.但正如本技术人所观察到的，高的配体密度有可能促进微泡聚集(或微泡悬浮液的中间前体制剂的不稳定)。
6.现在已经发现，包含磷脂及聚乙二醇化磷脂与含有配体的聚乙二醇化磷脂的合适混合物的配制物可能是特别有利的，特别是用于分离细胞或生物材料的方法中。


技术实现要素：

7.本发明的一个方面涉及具有稳定性包膜的包含生理上可接受气体的充气微泡的悬浮液，所述包膜包含：
8.a)磷脂；
9.b)1
‑
8mol％的含有反应性部分的第一聚乙二醇化磷脂，至少部分第一聚乙二醇化磷脂通过所述反应性部分与配体结合；和
10.c)1
‑
12mol％的第二聚乙二醇化磷脂；
11.相对于包膜中包含配体的聚乙二醇化磷脂的摩尔量，所述悬浮液包含少于40mol％游离的或与所述聚乙二醇化磷脂结合的所述配体。
12.所述配体优选能够选择性结合到生物素上。所述生物素更优选选自抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白，优选为链霉抗生物素蛋白。所述配体优选与聚乙二醇化磷脂共价结合。
13.未与稳定性包膜结合的配体的量优选小于33％，更优选小于25％，和甚至更优选小于20％。
14.在稳定性包膜中，含有配体的第一聚乙二醇化磷脂部分的存在量优选为0.03
‑
0.75mol％，优选为0.05
‑
0.7％，更优选为0.08
‑
0.6％。
15.第一和第二聚乙二醇化磷脂(“pe
‑
peg”)可以相同或不同，其为共价连接至平均分子量为1000
‑
8000g/mol、优选2000
‑
5000g/mol的聚乙二醇(peg)上的磷脂。在第一pe
‑
peg中，peg的平均分子量(amw)可以等于、大于或小于第二pe
‑
peg中peg的amw。第一pe
‑
peg中peg的amw优选与第二pe
‑
peg中peg的amw相同或更大。
16.在一个实施方案中，第一和第二pe
‑
peg中peg的平均分子量为约2000g/mol(pe
‑
peg2000)；第二pe
‑
peg的摩尔量优选为至少3.5％，更优选为至少5％，甚至更优选为至少6％。
17.在另一个实施方案中，第一和第二pe
‑
peg中peg的平均分子量为约5000g/mol(pe
‑
peg5000)。
18.在另一个实施方案中，第一pe
‑
peg中peg的平均分子量为约2000g/mol(pe
‑
peg2000)，和第二pe
‑
peg中peg的平均分子量为约5000g/mol(pe
‑
peg5000)。
19.在另一个实施方案中，第一pe
‑
peg中peg的平均分子量为约5000g/mol(pe
‑
peg5000)，和第二pe
‑
peg中peg的平均分子量为约2000g/mol(pe
‑
peg2000)。
20.在优选的实施方案中，本发明的充气微泡在其表面上的配体密度有利地为至少8000分子/μm2，优选为至少12000分子/μm2，更优选为至少15000分子/μm2，和甚至更优选为至少18000分子/μm2，例如至多50000分子/μm2。
21.本发明的另一个方面涉及一种生产用于制备前述充气微泡悬浮液的冻干前体的方法，所述方法包括：
22.‑
制备含预定摩尔量磷脂、含有反应性部分的聚乙二醇化磷脂的含水有机乳液；
23.‑
向所述乳液中加入一定摩尔量的官能化配体，所述摩尔量小于所述聚乙二醇化磷酯的摩尔量；
24.‑
使所述聚乙二醇化磷脂与所述配体偶合；
25.‑
冻干所述乳液。
26.本发明的另一方面包括在分离细胞的方法中应用上述充气微泡悬浮液。所述方法优选包括将所述微泡结合到生理液体中的所需细胞上，和通过浮力分离所述细胞。
具体实施方式
27.正如上文所提到的，本发明的一个方面涉及具有稳定性包膜的包含生理上可接受气体的充气微泡的悬浮液。所述稳定性包膜包含磷脂和预定量的含有配体的第一聚乙二醇化磷脂和第二聚乙二醇化磷脂。所述悬浮液的进一步特征在于相对于包含所述配体的聚乙二醇化磷脂的摩尔量，其包含少于40mol％的未与稳定性包膜结合的所述配体(游离的或与所述聚乙二醇化磷脂结合的)。
28.磷脂
29.正如这里所应用的，术语“磷脂”包括具有一个或优选两个(相同或不同的)脂肪酸残基和具有一个磷酸残基的甘油酯，其中所述磷酸残基进一步与亲水基团如胆碱(磷脂酰胆碱
‑
pc)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸
‑
ps)、甘油(磷脂酰甘油
‑
pg)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺
‑
pe)、肌醇(磷脂酰肌醇)结合。只有一个脂肪酸残基的磷脂的酯在本领域中通常称作磷脂的“溶
血”形式或“溶血磷脂”。在磷脂中存在的脂肪酸残基一般为长链脂肪酸，通常包含12
‑
24个碳原子，优选为14
‑
22个碳原子；脂肪链可以包含一个或多个不饱和键，或优选完全饱和。磷脂中包含的合适脂肪酸的实例有月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选采用饱和脂肪酸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。
30.正如这里所应用的，术语磷脂包括天然的、半合成的或合成制备的产品，它们可单独应用或作为混合物应用。
31.天然磷脂的实例有天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(pc)衍生物)，通常如大豆或蛋黄卵磷脂。
32.半合成磷脂的实例有天然卵磷脂的部分或全部氢化衍生物。优选的磷脂有磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酸(pa)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰肌醇(pi)或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
33.优选磷脂的实例有例如二月桂酰
‑
磷脂酰胆碱(dlpc)、二肉豆蔻酰
‑
磷脂酰胆碱(dmpc)、二棕榈酰
‑
磷脂酰胆碱(dppc)、二花生酰
‑
磷脂酰胆碱(dapc)、二硬脂酰
‑
磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰
‑
磷脂酰胆碱(dopc)、双十五碳酰
‑
磷脂酰胆碱(dpdpc)、1
‑
肉豆蔻酰
‑2‑
棕榈酰
‑
磷脂酰胆碱(mppc)、1
‑
棕榈酰
‑2‑
肉豆蔻酰
‑
磷脂酰胆碱(pmpc)、1
‑
棕榈酰
‑2‑
硬脂酰
‑
磷脂酰胆碱(pspc)、1
‑
硬脂酰
‑2‑
棕榈酰
‑
磷脂酰胆碱(sppc)、1
‑
棕榈酰
‑2‑
油酰磷脂酰胆碱(popc)、1
‑
油酰
‑2‑
棕榈酰
‑
磷脂酰胆碱(oppc)、二月桂酰
‑
磷脂酰甘油(dlpg)及其碱金属盐、二花生酰磷脂酰
‑
甘油(dapg)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dmpg)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)及其碱金属盐、二油酰
‑
磷脂酰甘油(dopg)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(dmpa)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸(dppa)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(dspa)、二花生酰磷脂酸(dapa)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰
‑
磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰
‑
乙醇胺(dspe)、二油酰磷脂酰
‑
乙醇胺(dope)、二花生酰
‑
磷脂酰乙醇胺(dape)、二亚油酰磷脂酰乙醇胺(dlpe)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(dmps)、二花生酰磷脂酰丝氨酸(daps)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(dpps)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(dsps)、二油酰磷脂酰丝氨酸(dops)、二棕榈酰鞘磷脂(dpsp)和二硬脂酰鞘磷脂(dssp)、二月桂酰
‑
磷脂酰肌醇(dlpi)、二花生酰磷脂酰肌醇(dapi)、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇(dmpi)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(dppi)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(dspi)、二油酰
‑
磷脂酰肌醇(dopi)。
34.特别优选的磷脂为dmpc、dapc、dspc、dppc、dmpa、dppa、dspa、dmpg、dppg、dspg、dmps、dpps和dsps。最优选的为dmpc、dapc、dspc和dppc。
35.也可以使用磷脂的混合物，例如dppe和/或dspe、dppc、dspc和/或dapc与dsps、dpps、dspa、dppa、dspg和dppg的混合物。
36.聚乙二醇化磷脂
37.正如这里所应用的，术语“聚乙二醇化磷脂”在其含义内包括共价结合到如上所述那些磷脂残基上的任何聚乙二醇残基(“peg”)。
38.聚乙二醇通常通过其平均分子量(“amw”，例如数均分子量“mn”)来标识。例如，正如这里所应用的，peg2000指amw为约2000g/mol(通常 /
‑
5％)的聚乙二醇。
39.合适的聚乙二醇化磷脂为包括平均分子量为约1000g/mol(即peg1000)至约8000g/mol(peg8000)、优选为2000
‑
5000g/mol(peg5000)的peg残基的那些。用于形成上面
所定义的聚乙二醇化磷脂的peg聚合物的具体实例包括peg750、peg1000、peg2000、peg3400、peg4000、peg5000、peg6000、peg7000和peg8000。所述peg优选共价结合到含有各脂质链例如肉豆蔻酰、棕榈酰或硬脂酰的磷脂酰乙醇胺(“pe”)残基上。
40.合适的聚乙二醇化磷脂的实例有例如dmpe
‑
peg、dppe
‑
peg和dspe
‑
peg，它们通常作为peg具有上述平均分子量的聚乙二醇化磷脂商购获得，例如dmpe
‑
peg2000、dmpe
‑
peg3400、dmpe
‑
peg5000、dppe
‑
peg2000、dppe
‑
peg3400、dppe
‑
peg5000、dspe
‑
peg2000、dspe
‑
peg3400或dspe
‑
peg5000。
41.必要时，聚乙二醇化磷脂可适当地用反应性部分官能化，特别是能够与官能化配体上的对应反应性部分(如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白部分)反应的那些。合适的反应性部分例如包括nhs(n
‑
羟基
‑
琥珀酰亚胺)、氨基、巯基、马来酰亚胺、叠氮化物或dbco(二苯并环辛炔)。
42.例如，如果两种反应性组分中一种含有反应性氨基，则它可以与含有合适对应反应性部分的另一组分反应，所述对应反应性部分如异硫氰酸酯基(形成硫脲键)、反应性酯(形成酰胺键)或醛基(形成亚胺键，其可还原为烷基胺键)。替代地，如果两种反应性组分中一种含有反应性硫醇基，则另一组分上合适的互补反应性部分可以包括卤代乙酰基衍生物、马来酰亚胺(形成硫醚键)或包含2
‑
吡啶硫基形式的硫化物的混合二硫化物，它们与衍生自含硫醇组分的硫醇反应时在两种组分间形成稳定的二硫化物键。另外，如果两种反应性组分中一种含有反应性羧基，则另一组分上的合适反应性部分可以是胺和酰肼(形成酰胺或n
‑
酰基、n
′‑
烷基酰肼官能团)。按照一个实施方案，马来酰亚胺衍生的聚乙二醇化磷脂(如pe
‑
peg2000
‑
mal或pe
‑
peg5000
‑
mal)可与带有硫醇(
‑
sh)反应性部分的配体反应，例如通过与sulfo
‑
lc
‑
spdp(磺基琥珀酰亚胺基6
‑
(3
′‑
(2
‑
吡啶基二硫)丙酰胺)己酸酯)反应而引入配体上。
43.配体
44.与pe
‑
peg结合并引入微泡包膜的配体是与另一对应分子形成特定“结合对”的配体。配体(和各自的结合对)的实例例如包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白，它们可以与生物素形成结合对。链霉抗生物素蛋白对本发明来说是优选的。
45.配体合适地进行衍生，以引入能够与官能化的pe
‑
peg上的对应反应性部分发生共价反应的反应性部分。例如，当应用马来酰亚胺官能化的pe
‑
peg时，在配体中引入硫醇部分，以使马来酰亚胺/硫醇偶合。当应用dbco官能化的脂质时，在链霉抗生物素蛋白中引入了叠氮化物部分，以允许点击化学偶合。
46.制备方法和配制物
47.可按wo2004/069284中公开的制备方法有利地制备本发明的微泡。
48.所述制备方法包括冻干残余物的初始制备，其包括如下步骤：
49.a)制备包含磷脂、含有反应性部分的第一聚乙二醇化磷脂和第二聚乙二醇化磷脂的含水有机乳液；
50.b)向这种乳液中加入能够与所述反应性部分反应的官能化配体；
51.c)使所述聚乙二醇化磷脂与所述配体偶合；和
52.d)冻干所述乳液以获得冻干残余物。
53.然后使所述冻干残余物(如在玻璃瓶中收集)与生物相容性气体接触，和随后通过
使其溶解于生理上可接受的液体载体中进行重构，从而获得所需的充气微泡悬浮液。
54.含水有机乳液可通过在至少一种磷脂的存在下使含水介质与水不可混合溶剂(如支化或直链烷烃、链烯烃、环烷烃、芳烃、烷基醚、酮、卤代烃、全氟烃或它们的混合物；如环辛烷、环己烷或环庚烷)应用本领域已知的任何合适的乳液生成技术(例如高压均质或微混合)来制备。
55.合适的磷脂为上面所示的那些。另外，含水有机乳液还可以包含脂质，优选为脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸。
56.通常，磷脂占包膜形成组分的大部分，例如高达98％mol/mol。在某些实施方案中，磷脂的存在量可以为60
‑
95mol％，优选为70
‑
90mol％。任选的脂质(特别是脂肪酸)的存在量例如可以为10
‑
30mol％，更优选为15
‑
25mol％。
57.官能化的聚乙二醇化磷脂可以为上面所列的任意pe
‑
peg，并如上面讨论合适地进行官能化。
58.它的存在量可以为0.5
‑
8mol％，优选为1
‑
6mol％。
59.类似地，结合到官能化pe
‑
peg上的官能化配体可以选自之前所列的那些。
60.正如本技术人所观察到的，在步骤b)中添加的官能化配体的摩尔量优选低于所述配体要与之偶合的含有反应性部分的聚乙二醇化磷脂的摩尔量。实际上，对于bacs方法的具体用途，为了减小与靶向(如生物素化)抗体可能的竞争性偶合，优选在悬浮液中使有限量的配体(其本身或者与聚乙二醇化磷脂结合)保持游离状态。如上所述，在本发明的悬浮液中，未与稳定性包膜结合的配体的量小于40％，例如小于20％。为了限制“游离”配体的量，按照本发明的方法，相对于含有对应反应性部分的聚乙二醇化磷脂的量，优选以1:4或更低(例如低至1:40)的摩尔比加入官能化配体。所述摩尔比更优选为1:5至1:25，和甚至更优选为1:7至1:20。
61.在这些相对的摩尔比下，配体与pe
‑
peg的偶合率通常为至少70％(即低于30％的配体没有结合入微泡的最终稳定性包膜中)，优选为至少75％，更优选为80％，和甚至更优选为至少85％。
62.然后pe
‑
peg上未反应的反应性部分可通过与合适的对应钝化部分反应而“钝化”。例如，如果pe
‑
peg上的反应性部分是马来酰亚胺(pe
‑
peg
‑
mal)，则可以通过使其与半胱氨酸反应而钝化。替代地，反应性部分可经历自然钝化过程如水解，此时无需添加特定的钝化部分。
63.因此，“钝化”pe
‑
peg将与已经共价结合到配体上的pe
‑
peg一起结合入稳定性包膜中，后者即已经共价结合到配体上的pe
‑
peg在稳定性包膜中的存在量有利地为0.03
‑
0.75mol％，优选为0.05
‑
0.7mol％，更优选为0.08
‑
0.6mol％，和甚至更优选为0.1
‑
0.5mol％。“钝化”(未反应)pe
‑
peg在稳定性包膜中的存在量可以为0.5
‑
7.5mol％，优选为1
‑
6mol％，更优选为1.5
‑
5mol％。
64.如本技术人进一步观察到的，根据本发明，有利的是在上述步骤a)至c)的含水有机乳液中包含含有反应性部分的聚乙二醇化磷脂和不含反应性部分的附加聚乙二醇化磷脂的混合物。
65.如本技术人观察到的，为了提供所需的微泡悬浮液，pe
‑
peg的量和包含在所述pe
‑
peg中的peg链的分子量以一定的方式相关联，从而允许适当地对两者进行选择。所述关联
可有利地由如下定义的“n
peg”标识数字来表示：
66.n
peg
＝mw1*mol％1 mw2*mol％267.其中mw1和mol％1分别指在含有反应性部分的聚乙二醇化磷脂中包含的peg链的分子量和mol％，而mw2和mol％2分别指在不含反应性部分的聚乙二醇化磷脂中包含的peg链的分子量和mol％。
68.例如，如果组合物包含2.5％的官能化pe
‑
peg2000和1％的pe
‑
peg5000，则n
peg
数为：
69.n
peg
＝2000*0.025 5000*0.01＝100
70.正如本技术人所观察到的，为了获得稳定的乳液，数值n应优选大于90，更优选大于95，例如至多300，优选280。mw1优选类似于mw2，两者均更优选为约2000( /
‑
5％)。mol％1优选为0.01
‑
0.05，更优选为0.02
‑
0.03。mol％2优选为0.03
‑
0.12，更优选为0.05
‑
0.10。
71.按照本发明的一个实施方案，含有反应性部分的聚乙二醇化磷脂为官能化的pe
‑
peg2000(如dspe
‑
peg2000
‑
mal)，而第二聚乙二醇化磷脂为pe
‑
peg2000(例如dspe
‑
pe2000)。两种pe
‑
peg之间的摩尔比为1:1至1:8，优选为1:1.5至1:5，和甚至更优选为1:2至1:4。
72.按照本发明的另一个实施方案，含有反应性部分的聚乙二醇化磷脂为官能化的pe
‑
peg2000，例如dspe
‑
peg2000
‑
mal，而另一聚乙二醇化磷脂为pe
‑
peg5000，例如dppe
‑
。官能化pe
‑
peg2000与pe
‑
peg5000之间的摩尔比优选为5:1至1:3，更优选为4:1至1:2，和甚至更优选为3:1至1:1。按照另一个实施方案，含有反应性部分的聚乙二醇化磷脂和第二聚乙二醇化磷脂都为pe
‑
peg5000。两种pe
‑
peg之间的摩尔比优选为5:1至1:2.5，优选为3:1至1:2，和甚至更优选为2.5:1至1:1.5。
73.在优选的实施方案中，含水有机乳液还可包含冻干添加剂，例如具有防冻和/或防冻干作用的试剂和/或填充剂，例如氨基酸如甘氨酸；碳水化合物，例如糖，如蔗糖、甘露糖醇、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖或环糊精，或多糖如葡聚糖、壳聚糖及它们的衍生物(例如羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖)；或聚氧亚烷基二醇如聚乙二醇。在形成微泡稳定性包膜中基本不涉及的冻干添加剂优选作为水溶液添加。可在乳液形成前、乳液形成后添加或部分在乳液形成前添加和部分在乳液形成后添加。例如，可以应用10％(w/w)的peg4000水溶液。冻干前乳液中冻干添加剂的量通常为5
‑
20wt％(而包膜形成组分的总量通常为约0.5
‑
1wt％)。
74.正如申请人所观察到的，按如上所述制备的优选含水有机乳液在经历冻干步骤之前可稳定相对较长时间，通常为至少2
‑
3小时或更长。
75.例如，完成步骤c)的偶合步骤后通过测量最终乳液中微滴的浓度(按微滴总数计)并与21/2小时后乳液中的微滴浓度相比较，可以确定乳液稳定性。通常，相对于初始量，剩余微滴的百分数应该为至少80％，优选为至少90％，和甚至更优选为至少95％。
76.然后可以将乳液填充到经过冻干步骤的各玻璃瓶(如din4、din8或din20r)中。
77.完成冻干后，用生理上可接受气体饱和小瓶的顶部空间(含冻干残余物)，并密封小瓶(例如用橡胶塞)。
78.可应用任何生物相容性气体、气体前体(例如室温下的液体或其混合物)填充上述微泡(以下也称为“微泡形成气体”)。
79.氟化气体是优选的，特别是全氟化气体。优选的化合物有全氟化气体，如sf6或全氟化碳(全氟化烃)，即所有的氢原子均被氟原子取代的烃，已知它们形成特别稳定的微泡悬浮液，如在ep 0554 213中所公开的，该专利在这里作为参考引入。
80.优选的全氟化碳例如包括cf4、c2f6、c3f8、c4f8、c4f
10
、c5f
12
、c6f
12
和c6f
14
，更优选为cf4、c2f6、c3f8、c4f8和c4f
10
。
81.以任何比例使用上述任何气体的混合物也可能是有利的。例如，所述混合物可以包含常规气体(如氮气、空气或二氧化碳)和形成稳定微泡悬浮液的气体(如如上所示的六氟化硫或全氟化碳)。合适气体混合物的实例例如可以在wo94/09829中找到，该专利在这里作为参考引入。如下组合是特别优选的：气体(a)和(b)的混合物，其中气体(b)为选自前文所述的那些氟化气体，包括它们的混合物，和(a)选自空气、氧气、氮气、二氧化碳或它们的混合物。气体(b)的量可以占总混合物的约0.5
‑
95v/v％，优选为5
‑
80v/v％。
82.特别优选的气体为sf6、c3f8、c4f
10
或它们的混合物，任选与空气、氧气、氮气、二氧化碳或它们的混合物混合使用，例如全氟丁烷或全氟丙烷和氮气的35/65(v/v)混合物。
83.然后通过向小瓶中加入含水载体并轻摇其内容物，可以使冻干残余物重构，以提供所需的充气微泡悬浮液。所得微泡的数量、尺寸和尺寸分布与制备乳液中微滴的数量、尺寸和尺寸分布基本相当。
84.在本发明的一个实施方案中，充气微泡的最终稳定性包膜可以包含如下的混合物：(i)磷脂；(ii)任选的脂肪酸；(iii)含有配体的pe
‑
peg；(iv)“钝化的”pe
‑
peg(衍生自未与配体反应的官能化pe
‑
peg)；和(v)任选的附加的(未官能化的)pe
‑
peg。
85.按照一个实施方案，上述组分在稳定性包膜中存在的摩尔量可以为：
86.(i)磷脂：60
‑
98％，优选70
‑
85％
87.(ii)脂肪酸：0
‑
30％，优选10
‑
25％
88.(iii)含有配体的pe
‑
peg：0.03
‑
0.75％，优选0.1
‑
0.7％
89.(iv)“钝化的”pe
‑
peg：0.5
‑
7.5％，优选1
‑
6％，更优选1.5
‑
5％；
90.(v)第二(未官能化的)pe
‑
peg：0.5
‑
12％，优选1
‑
10％。
91.在一个优选的实施方案中，“钝化”pe
‑
peg和第二(未官能化的)pe
‑
peg的总摩尔量为2
‑
12％，优选5
‑
10％。
92.本发明的充气微泡，特别是由上述制备方法获得的那些，尽管在其制备中应用了相对少量的官能化pe
‑
peg，在其表面仍包含相对大量的配体。微泡表面上的配体量可以有利地用微泡表面上每μm2的配体密度来表示。正如如下实施例中详细描述的，通过测量洗涤后微泡悬浮液中的配体浓度(例如通过荧光，例如对于含链霉抗生物素蛋白的微泡用4
‑
生物素荧光素)，并用coulter计数器测量值计算微泡的总表面积，可以确定配体的密度。
93.本发明微泡的配体密度通常为至少8000分子/μm2，优选为至少12000分子/μm2，更优选为至少15000分子/μm2，和甚至更优选为至少18000分子/μm2，例如至多50000分子/μm2。
94.应用方法
95.本发明的充气微泡可有利地用于通常通过浮力分离细胞的方法(也称为浮力活化细胞分选，“bacs”)中。该方法可用于在生理液体(如血液或血浆)中使所需类型的细胞与其它细胞分离。
96.具体地，所述分离方法包括用能够结合到所述细胞上的特定(和选择性)受体的合
适标记抗体标记待分离的所需细胞。然后将本发明的微泡添加到待分离的细胞(包括携带标记抗体的那些)的悬浮液中；然后，本发明的微泡将通过配体与结合到抗体/细胞构造的标记残基结合，从而允许通过浮力分离细胞(参见例如wo 2017/117349)。在优选的实施方案中，标记抗体是生物素化抗体，其中生物素残基能够与充气微泡上的对应部分如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的残基结合。因此，本发明的微泡可用于从生理液体中分离大量细胞，前提是这类细胞可适当地用相应的标记(生物素化)抗体进行标记。
97.特别优选的是包含第一聚乙二醇化磷脂(其为官能化的pe
‑
peg2000(如dspe
‑
peg2000
‑
mal))和第二聚乙二醇化磷脂(其为pe
‑
peg2000(如dspe
‑
pe2000))的充气微泡的配制物。第一聚乙二醇化磷脂的存在量优选为1
‑
5mol％，更优选为1.5
‑
4mol％。第二聚乙二醇化磷脂的存在量优选为3
‑
12mol％，更优选为5
‑
10mol％。
98.如下实施例有助于进一步描述本发明。
99.实施例
100.材料
[0101][0102]
方法
[0103]
乳液尺寸和浓度：
[0104]
用配备有30μm孔的coulter计数器multisizer3测量乳液微滴的尺寸分布和浓度(在100ml 0.9％的nacl溶液中稀释20μl样品
‑
分析体积＝100μl)。测定如下参数：数量平均直径和体积平均直径(分别为dn和dv，μm)、微滴总浓度(总浓度，份/ml)、>2μm微滴的浓度(份/ml)、总微滴表面积(总表面积，μm2/ml)、总微滴体积(mvc，μl/ml)。
[0105]
刚稀释完成和稀释完成2h30后(轻柔搅拌)测量乳液微滴的浓度。用2h30后的浓度除以刚稀释完成后的浓度来确定乳液稳定性。
[0106]
微泡大小和浓度：
[0107]
用配备有30μm孔的coulter计数器multisizer3测量微泡(mv)的尺寸分布和浓度(在100ml 0.9％的nacl溶液中稀释50μl样品
‑
分析体积＝100μl)。获得如下参数：数量平均直径和体积平均直径(分别为dn和dv，μm)、微泡总浓度(总浓度，mv/ml)、>2μm微泡的浓度(mv/ml)、总微泡表面积(总表面积，μm2/ml)、总微泡体积(mvc，μl/ml)。
[0108]
链霉抗生物素蛋白浓度的确定：
[0109]
应用4
‑
生物素荧光素分析法测定原始微泡悬浮液和洗涤后微泡悬浮液中的stv含量。
[0110]
简言之，计数测量后，在超声槽(branson 5200
–
3x 2min)中使微泡坍塌，以获得澄清溶液。然后以50μl份在8个5ml玻璃管中对溶液取样。对每个样品计算pbs的适当体积和4
‑
生物素荧光素溶液(2803pmol/ml)的适当体积，以具有0.1、0.2、0.4、0.75、1.5、2、2.5和3倍的理论生物素容量。向样品溶液加入pbs，然后加入相应的4
‑
bf溶液中。
[0111]
然后，(涡流)混合溶液并在黑暗中在室温下培养30min。然后，每种混合物在96
‑
孔板上取样(每孔100μl和每种条件2个孔)，应用cytation 5读数机(λexc 480nm
–
λem 525nm)读取荧光值。作为4
‑
bf浓度的函数绘荧光曲线，四个初始点(低4
‑
bf)应用二次多项式拟合，和四个最终点(高4
‑
bf)应用线性拟合。在两条曲线间确定内插值，和应用标准曲线(来自游离的链霉抗生物素蛋白溶液)确定stv浓度。
[0112]
应用由coulter计数器测量确定的总mv表面积计算微泡上的stv密度(分子/μm2)。
[0113]
链霉抗生物素蛋白偶合收率的确定：
[0114]
将测量的洗涤后微泡悬浮液的链霉抗生物素蛋白密度除以测量的原始微泡悬浮液的链霉抗生物素蛋白密度，计算偶合收率(因为一定百分比的微泡可能在洗涤过程中被脱除)。
[0115]
实施例1
[0116]
链霉抗生物素蛋白(stv)衍生
[0117]
通过在1.62ml蒸馏水和1.08ml缓冲液a(50mm磷酸盐，150mm盐水ph 7.4)中溶解54mg冻干的链霉抗生物素蛋白(0.85mg stv/mg粉末(来自iba)
–
860.76nmol)制备链霉抗生物素蛋白溶液。得到澄清溶液(浓度为～20mg/ml)。
[0118]
在250μl的milliq水中溶解sulfo
‑
lc
‑
spdp(2.5mg)。该溶液(19μmol/ml)在实验前新鲜制备。
[0119]
将sulfo
‑
lc
‑
spdp溶液样品(160μl
–
3μmol
–
3.5当量)加入到stv溶液中。使所得溶液(涡流)混合且在室温下培养40min(每5min应用涡流进行搅拌)。
[0120]
应用缓冲液b(5mm磷酸盐，ph 7.4)平衡两个5ml
‑
zeba柱。
[0121]
培养后，在两个zeba柱(2x1.43ml)上纯化stv
‑
spdp溶液。纯化后回收溶液的体积为～2.9ml。
[0122]
在250μl缓冲液c(tris 500mm,edta 50mm ph:7)中溶解tcep(5.4mg)，获得75mm的溶液。
[0123]
将tcep溶液的样品(103μl
‑
～10当量)加入到stv
‑
spdp溶液中。(涡流)混合后，将溶液在室温下培养30min，以解除stv
‑
sdpd保护，并获得硫化的stv(stv
‑
sh)。
[0124]
应用缓冲液b平衡两个5ml的zeba柱。培养后，在两个柱(2x1.5ml)上纯化stv
‑
sh溶
液。所回收溶液的体积约为3ml，stv
‑
sh的浓度为约185nmol/ml。
[0125]
应用含stv
‑
sh的溶液进行随后与pe
‑
peg
‑
mal的偶合反应。
[0126]
实施例2
[0127]
应用dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺制备stv微泡
[0128]
有机相制备：在70℃下在4.8ml环辛烷中溶解60mg dspc/棕榈酸共混物(8/2摩尔比)。
[0129]
水相制备：60ml的peg4000，水中10％
[0130]
乳化前，将溶解于400μl 100mm ph 6磷酸盐缓冲液中的6.7mg dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺加入到水相中。
[0131]
应用megatron mt3000混合器高速旋转4min使两相乳化。然后将乳液在60℃下加热1小时，轻柔搅拌，然后冷却至室温。
[0132]
将乳液分为四份14ml样品和分别装入15ml试管(falcon)中。向乳液中加入stv
‑
sh溶液(在实施例1中制备)，其加入体积获得如表1所示的每ml乳液具有所需nmol量的stv
‑
sh。混合乳液并在室温下培养2h30。
[0133]
用10％的peg4000水溶液稀释乳液两次。应用coulter计数器multisizer3(beckman coulter)测量乳液尺寸和浓度。一部分稀释后的乳液在轻柔搅拌下在室温下保持2h30，以检查乳液稳定性，表示为2h30后微滴浓度(c1)与初始微滴浓度(c0)之间的比。
[0134]
在din20r小瓶(3ml/瓶)中对稀释后乳液取样。然后将小瓶放置到预先冷冻的冻干机(telstar lyobeta 35)上冻干。用c4f
10
/n2混合物(35/65v/v)填充小瓶的顶部空间，并密封小瓶。
[0135]
用6ml盐水(0.9％)再分散并轻柔混合后获得微泡悬浮液。应用coulter计数器multisizer3(beckman coulter)测量微泡尺寸和浓度。
[0136]
表1(pe
‑
peg2000
‑
mal 2.5％；n
peg
＝50)
[0137][0138]
由以上结果可以看出，随着乳液中stv量的增加，2h30后乳液稳定性急剧下降。
[0139]
实施例3
[0140]
应用dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺与不同量的dppe
‑
peg5000制备stv微泡
[0141]
按实施例2制备微泡，只是在乳化前向水相中另外加入溶解于250μl蒸馏水中的2.5mg、5.1mg或10.3mg的dppe
‑
peg5000(分别对应于摩尔量0.5％、1％或2％)。
[0142]
表2
‑
4给出了各自的结果。
[0143]
表2(pe
‑
peg2000
‑
mal 2.5％ pe
‑
peg5000 0.5％；n
peg
＝75)
[0144][0145]
表3(pe
‑
peg2000
‑
mal 2.5％ pe
‑
peg5000 1％；n
peg
＝100)
[0146][0147]
表4(pe
‑
peg2000
‑
mal 2.5％ pe
‑
peg5000 2％；n
peg
＝150)
[0148][0149]
由以上结果可以看出，相对于只含pe
‑
peg2000
‑
mal的配制物而言，0.5％pe
‑
peg5000的存在增加了乳液稳定性，至少在添加低浓度stv下如此；在1％pe
‑
peg5000存在下，所有的乳液随时间是稳定的，当存在2％pe
‑
peg5000时也是一样，尽管在后一种情况下可以观察到stv密度和收率略微降低。
[0150]
实施例4
[0151]
应用dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺和不同量的dspe
‑
peg2000制备stv微泡
[0152]
实施例4a
[0153]
按实施例2制备微泡，只是在乳化前向水相中另外加入溶解于400μl蒸馏水中的5.1mg或10.6mg dspe
‑
peg2000(对应于摩尔量1.9％或3.8％)。
[0154]
结果在下表5中给出。
[0155]
表5
[0156][0157]
虽然pe
‑
peg200摩尔浓度为1.9％时stv收率和密度相对较好，但乳液稳定性相对较低。
[0158]
通过增加pe
‑
peg2000的摩尔量(3.8％)，可以实现乳液稳定性的大幅增加。
[0159]
实施例4b
[0160]
按实施例4a制备微泡，只是在乳化前向水相中加入溶解于1ml蒸馏水中的16.1mg、22mg或28.1mg的dspe
‑
peg2000(分别对应于摩尔量6％、8％和10％)。通过向每ml乳液加入3nmol stv而制备所有组合物。
[0161]
结果在下表6中给出。
[0162]
表6
[0163][0164]
从上表可以看出，dspe
‑
peg2000的摩尔量增加导致微泡量(总mv)增加。另外，随dspe
‑
peg2000的量增加，stv偶合收率保持相对较高。
[0165]
对于表6中的三种制剂来说，n
peg
分别为170、210和250。
[0166]
实施例5
[0167]
应用dspe
‑
peg5000
‑
马来酰亚胺制备stv微泡
[0168]
按实施例2制备微泡，只是加入13.4mg的dspe
‑
peg5000
‑
马来酰亚胺(2.5％mol，sunbright dspe
‑
050ma
‑
nof)替代dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺。
[0169]
结果在表7中给出。
[0170]
表7(pe
‑
peg5000
‑
mal 2.5％；n
peg
＝125)
[0171][0172]
由上述结果可以看出，只存在pe
‑
peg5000
‑
mal允许获得良好的乳液稳定性以及可接受的stv收率和stv密度。但观察到相对较低的气泡总量(意外确定了stv密度增加)。
[0173]
实施例6
[0174]
应用dspe
‑
peg5000
‑
马来酰亚胺和dppe
‑
pe5000或dspe
‑
peg2000制备stv微泡
[0175]
按实施例5制备微泡，只是在乳化前向水相中另外加入溶解于250μl蒸馏水中的5.1mg dppe
‑
peg5000或dspe
‑
peg2000(分别对应于摩尔量1％或2％)。
[0176]
结果示于下表8中。
[0177]
表8(pe
‑
peg5000
‑
mal 2.5％ pe
‑
peg5000 1％；n
peg
＝175)
[0178][0179]
表9(pe
‑
peg5000
‑
mal 2.5％ pe
‑
peg2000 2％；n
peg
＝165)
[0180][0181]
由上述结果可以看出，虽然更大量的stv
‑
sh通常会增加微泡上的stv密度，但过量的话可能会负面影响其它参数，如微泡总量。
[0182]
实施例7
[0183]
应用dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺制备stv微泡
[0184]
按实施例2制备微泡，区别在于应用13.6mg的dspe
‑
peg2000
‑
mal(5mol％)。
[0185]
表10(pe
‑
peg2000
‑
mal 5％；n
peg
＝100)
[0186][0187]
上述结果表明，虽然获得了相对较好的stv收率和密度，但即使只是相对较大量的pe
‑
peg2000
‑
mal也可能造成乳液稳定性相对较低。
[0188]
实施例8
[0189]
应用dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺和dppe
‑
pe5000或dspe
‑
peg2000制备stv微泡
[0190]
按实施例7制备微泡，区别在于乳化前向水相中另外加入溶解于300μl蒸馏水中的2.5mg的dppe
‑
peg5000(0.5mol％)或3.8mg的dspe
‑
peg2000(1.5mol％)。
[0191]
表11(pe
‑
peg2000
‑
mal 5％ pe
‑
peg5000 0.5％；n
peg
＝125)
[0192][0193]
表12(pe
‑
peg2000
‑
mal 5％ pe
‑
peg2000 1.5％；n
peg
＝130)
[0194][0195]
实施例9
[0196]
应用不同量的dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺和0.5％的dppe
‑
pe5000制备stv微泡
[0197]
应用不同量的dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺和0.5mol％的dppe
‑
peg按实施例4a制备微泡。乳液处理后，在每种乳液中加入3nmol stv
‑
sh/ml乳液。结果示于表8中。
[0198]
表13(pe
‑
peg2000
‑
mal 0.5、1.0、2.5％ pe
‑
peg5000 0.5％；n
peg
＝35、45和75)
[0199][0200]
上述结果表明通过应用相同初始量的stv
‑
sh含有2.5％dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺的配制物允许获得更高的stv偶合收率。
[0201]
实施例10
[0202]
乳液稳定性对最终微泡悬浮液的影响
[0203]
利用3nmol的stv/ml乳液，按如上所述制备含dspe
‑
peg2000
‑
马来酰亚胺(2.5mol％)和含有不同量dppe
‑
peg5000(0、0.5、1和2mol％)的配制物。
[0204]
偶合和乳液稀释后，将一半乳液取样于小瓶中并冻干。将另一半乳液轻柔搅拌2h30，然后取样并冻干(以模拟工业或中试放大中可能的取样时间)。
[0205]
再分散后，比较微泡特性。结果示于表14中。
[0206]
表14
–
小瓶中刚刚分配之后的微泡
[0207][0208]
由上述结果可以看出，使用更高摩尔量的pe
‑
peg5000(实施例14c和14d)，可以获得更好的乳液稳定性。乳液形成2h30后由冻干残余物获得的微泡特征实际上类似于乳液刚刚冻干后获得的微泡特征。
[0209]
实施例11
[0210]
对比应用1％dppe
‑
peg5000的配制物与应用8％dspe
‑
peg2000的配制物
[0211]
按实施例2制备微泡，区别在于乳化前分别向水相中另外加入5mg dppe
‑
peg5000(1mol％，溶于300)或22mg dspe
‑
peg2000(8mol％，或1ml蒸馏水)；在每种乳液中加入3nmol stv
‑
sh/ml乳液。每种制剂重复8次(n＝8)。
[0212]
结果示于下表15中(记录值为每种配制物8种制剂的平均值)，表明这两种配制物的特性相当。
[0213]
表15(pe
‑
peg2000
‑
mal 2.5％ pe
‑
peg5000 01％或pe
‑
peg2000 8％)
[0214][0215]
实施例12
[0216]
细胞回收试验
[0217]
试验方案
[0218]
首先按供应商提供的方案对ccrf
‑
cem细胞(来自attc)进行培养和扩增。试验前，将细胞以5x106个细胞/ml的浓度重新悬浮于bsa/edta缓冲液(dpbs中1％bsa和2mm edta，w/o ca/mg)中。
[0219]
将细胞悬浮液(1ml，约5x106个细胞)转移到2ml低结合eppendorf中，并向细胞中加入160μl生物素化小鼠抗人cd45抗体(#555481
–
bd pharmigen)。在室温下在旋转混合器上培养混合物30min，然后离心洗涤细胞(400g/5min)；丢弃上清液，将细胞重新悬浮在1ml bsa/edta缓冲液中(在旋转混合器上混合5min)。
[0220]
然后将微泡悬浮液(0.5ml)添加到细胞悬浮液中，在室温下在旋转混合器上培养混合物20min。然后离心分离混合物(400g/5min)，并通过手动移液在液体弯月面处回收上清液(细胞/微泡复合物)。
[0221]
然后(通过施加正压)使充气微泡塌落，并应用血细胞计计数上清液部分和下清液部分中的细胞。
[0222]
细胞回收率按如下测定：细胞上清液/(细胞上清液 细胞下清液)，以％表示。还确定细胞平衡：(细胞上清液 细胞下清液)/初始细胞。只有当细胞平衡在90
‑
110％时，试验才有效。
[0223]
结果
[0224]
应用上述细胞回收试验方案评价实施例11中制备的微泡悬浮液的效果。各配制物15a或15b的8种制剂的每一种均试验两次(n＝2)。
[0225]
在下表16中给出了结果。
[0226]
表16:细胞回收试验
[0227]
制剂细胞回收率(％)15a(n＝8)85
±
5％15b(n＝8)97
±
2％
[0228]
由上述结果可以推知，与包含pe
‑
peg2000
‑
mal和pe
‑
peg5000的配制物相比，包含pe
‑
peg2000
‑
mal和pe
‑
peg2000组合物的配制物提供了更高的细胞回收率。
[0229]
使用配制物6a和6c(pe
‑
peg2000
‑
mal含量为2.5％，pe
‑
peg2000含量分别为6％或10％)获得类似的结果。