使用层粘连蛋白的新的角膜的治疗的制作方法

使用层粘连蛋白的新的角膜的治疗
1.本技术为分案申请，其原申请的申请日为2015年10月30日，申请号为201580059642.1(国际申请号pct/jp2015/005473)，名称为“使用层粘连蛋白的新的角膜的治疗”。
技术领域
2.本发明涉及使用层粘连蛋白的新疗法。更具体而言，本发明涉及使用层粘连蛋白的眼科治疗，仍更具体而言涉及角膜内皮的治疗及预防。


背景技术：

3.出生时人角膜内皮细胞以约3000细胞/mm2的密度存在。一旦受到损伤，人角膜内皮细胞不具备再生能力。因此，角膜内皮细胞被认为难以培养。由于目前在移植技术中难以培养与增殖，角膜内皮的治疗和手术实际上是不可能的。日本的角膜捐赠短缺，每年等待角膜移植的患者数量约为2600，而在日本进行的角膜移植的数量约为1700。
4.已知关于层粘连蛋白与眼科的关系的专利文献1和2。
5.引用列表
6.专利文献
7.专利文献1：日本国家阶段pct公开2004
‑
500012
8.专利文献2：日本国家阶段pct公开2003
‑
532647


技术实现要素：

9.解决问题的方案
10.本发明人已经发现特定的层粘连蛋白可用于眼科治疗，尤其是角膜内皮治疗，本发明就是基于这一发现。因此，本发明代表性地提供以下项：
11.(1)一种用于角膜内皮的疾病、障碍或病症的治疗或预防试剂，所述试剂包含至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂。
12.(2)项1所述的治疗或预防试剂，其中所述层粘连蛋白包含rgd序列。
13.(3)项1或2所述的治疗或预防试剂，其中所述层粘连蛋白包含α5链和/或γ1链。
14.(4)项1
‑
3中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述层粘连蛋白包含层粘连蛋白511(α5β1γ1)和层粘连蛋白521(α5β2γ1)。
15.(5)项1
‑
4中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述片段具有角膜内皮细胞的细胞粘附能力。
16.(6)项1
‑
5中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述试剂为层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或层粘连蛋白511
‑
e8片段。
17.(7)项1
‑
6中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述角膜内皮来自灵长类。
18.(8)项1
‑
7中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述角膜内皮的疾病、障碍或病症选自富克斯角膜内皮营养不良(fuchs’corneal endothelial dystrophy)、角膜内皮炎、
外伤及眼科手术中的障碍和病症。
19.(9)项1
‑
8中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述角膜内皮的疾病、障碍或病症选自畏光、视力模糊、视力缺损、眼痛、溢泪、充血、疼痛、大疱性角膜病变、眼部不适、对比度降低(diminished contrast)、眩光、角膜基质水肿、大疱性角膜病变和角膜混浊。
20.(10)项1
‑
9中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述角膜内皮包含角膜内皮层、后弹性膜或两者。
21.(11)项1
‑
10中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述角膜内皮具有处于脱离状态的后弹性膜。
22.(12)项1
‑
11中任一项所述的治疗或预防试剂，还包含角膜内皮细胞。
23.(13)项1
‑
11中任一项所述的治疗或预防试剂，还包含rock抑制剂。
24.(14)项1
‑
11中任一项所述的治疗或预防试剂，还包含角膜内皮细胞和rock抑制剂。
25.(15)项13或14所述的治疗或预防试剂，其中所述rock抑制剂选自y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)及其药学可接受的盐。
26.(16)项1
‑
15中任一项所述的治疗或预防试剂，其中将所述试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触。
27.(17)项1
‑
16中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述试剂以约21nm或以上存在。
28.(18)项1
‑
17中任一项所述的治疗或预防试剂，其中还给予角膜内皮细胞。
29.(19)项1
‑
18中任一项所述的治疗或预防试剂，其中提供与角膜内皮细胞混合的所述试剂，并且将至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触。
30.(20)项1
‑
19中任一项所述的治疗或预防试剂，还包含rock抑制剂。
31.(21)项1
‑
20中任一项所述的治疗或预防试剂，其中所述rock抑制剂选自y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)及其药学可接受的盐。
32.(22)项1
‑
21中任一项所述的治疗或预防试剂，其中与角膜内皮细胞混合的所述试剂为约2.1nm或以上，并且待注射的所述试剂为约21nm或以上。
33.(23)至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂，用于治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的。
34.(24)项23所述的试剂，还包括项2
‑
22中一项或多项所述的特征。
35.(25)一种用于治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂给予需要该治疗或预防的受试者。
36.(26)项25所述的方法，还包括项2
‑
11中一项或多项所述的特征。
37.(27)项26或26所述的方法，其还包括将角膜内皮细胞给予所述受试者。
38.(28)项25
‑
27中任一项所述的方法，其还包括将rock抑制剂给予所述受试者。
39.(29)项28所述的方法，其中所述rock抑制剂选自y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)及其药学可接受的盐。
40.(30)项25
‑
29中任一项所述的方法，还包括将角膜内皮细胞及rock抑制剂给予所述受试者。
41.(31)项25
‑
30中任一项所述的方法，其中将所述试剂注射到所述受试者的眼内从而与眼内的组织相接触。
42.(32)项25
‑
31中任一项所述的方法，其中所述试剂以约21nm或以上存在。
43.(33)项25
‑
32中任一项所述的方法，还包括将角膜内皮细胞与所述试剂分别给药。
44.(34)项25
‑
33中任一项所述的方法，其中提供与角膜内皮细胞混合的所述试剂，并且将至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触。
45.(35)项25
‑
34中任一项所述的方法，还包括将rock抑制剂与所述试剂分别给药。
46.(36)项25
‑
35中任一项所述的方法，其中所述rock抑制剂选自y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)及其药学可接受的盐。
47.(37)项25
‑
32中任一项所述的方法，其中与角膜内皮细胞混合的所述试剂为约2.1nm或以上，并且待注射的所述试剂为约21nm或以上。
48.(38)至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂用于制备治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的药物的用途。
49.(39)项38所述的用途，还包括项2
‑
22中一项或多项所述的特征。
50.(40)至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂用于治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的用途。
51.(41)项40所述的用途，还包括项2
‑
22中一项或多项所述的特征。
52.应当理解，一个或多个上述特征可进一步以除了本发明中明确示出的组合以外的组合的形式提供。在根据需要阅读和理解以下的详述之后，本领域技术人员会认识到本发明的其他实施方案和优势。
53.发明的有益效果
54.本发明使新的眼科治疗、尤其是新的角膜内皮细胞(特别是人角膜内皮细胞)的治疗成为可能。特别地，本发明可实现大疱性角膜病变的几乎完全康复。在优选的实施方案中，后弹性膜被治愈。这样的效果是使用常规技术无法达成的显著效果。
附图说明
55.[图1]图1示出了使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植后的眼前段的图像。示出了眼前段的图像，从左起，对照：机械刮除兔角膜内皮细胞的眼前段作为对照；rcec：所制备的模型的眼前段，在所述模型中将所培养的兔角膜内皮细胞注射到前房内并保持面朝下的姿势持续3个小时；rcec e8：所制备的模型的眼前段，在所述模型中将所培养的兔角膜内皮细胞与含有层粘连蛋白511
‑
e8片段(浓度调节至2.1nm)的dmem一起注射到前房内，并保持面朝下的姿势持续3个小时。上行示出了1周后的图像，下行表示2周后的图像。
[0056]
[图2]图2示出了使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜移植后的角膜厚度的变化。纵轴表示通过超声波厚度计测量的角膜厚度(μm)。横轴表示处理后的天数。标准误差用棒(bar)表示。
[0057]
[图3]图3示出了使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的培养的角膜内皮移植后的组织学检查结果。图3从左起示出了抗na

/k

‑
atp酶的抗体、抗zo
‑
1的抗体、抗n
‑
钙粘蛋白的抗体和鬼笔环肽的染色。
[0058]
[图4]图4示出了同时使用层粘连蛋白和rock抑制剂的兔大疱性角膜病变模型中检查培养的角膜内皮移植的结果。通过机械脱离兔角膜内皮而制备大疱性角膜病变模型。比较以下个体中24小时后所注射的细胞对基质的粘附：将培养的兔角膜内皮细胞与rock抑制剂y
‑
27632( )(100μm)一起注射到其前房内的个体，以及将细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)一起注入其中的个体。左侧示出了鬼笔环肽和dapi染色的图像。上行示出了没有层粘连蛋白511
‑
e8片段而有y
‑
27632( )(100μm)的结果，下行示出了有层粘连蛋白511
‑
e8片段和y
‑
27632( )(100μm)的结果。鬼笔环肽染色表明，在注射了细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的个体中更多细胞发生粘附。右侧示出了细胞密度数据图。纵轴表示细胞密度(细胞/mm2)。在注射了细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的个体中，所粘附的细胞密度明显更高。
[0059]
[图5]图5示出了兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植后的眼前段的图像。示出了眼前段的图像，从左起，角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离，并已注射培养的角膜内皮细胞与y
‑
27632( )(100μm)的个体；角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离，并已注射细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的个体；后弹性膜已脱离并已注射细胞与y
‑
27632( )(100μm)的大疱性角膜病变模型的个体；后弹性膜已脱离并已注射细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的大疱性角膜病变模型的个体。上行表示第3天的结果，下行表示第7天的结果。
[0060]
[图6]图6示出了培养的角膜内皮移植后图5中所示的四组的角膜厚度(μm)。横轴表示处理后的天数。实线表示没有后弹性膜脱离，虚线表示具有后弹性膜脱离。每个实心圆表示有层粘连蛋白511
‑
e8片段，空心圆表示没有层粘连蛋白511
‑
e8片段。与没有脱离的情况相比，后弹性膜脱离时角膜厚度的变薄被延迟得更多。
[0061]
[图7]图7示出了培养的角膜内皮移植后图5中所示的四组中的眼压(mmhg)。横轴表示处理后的天数。实线表示没有后弹性膜脱离，虚线表示具有后弹性膜脱离。每个实心圆表示有层粘连蛋白511
‑
e8片段，空心圆表示没有层粘连蛋白511
‑
e8片段。在任何组中均没有观察到被认为是由于细胞移植引起的并发症的眼压升高。
[0062]
[图8]图8示出了培养的角膜内皮移植14天后图6中所示的四组的组织学检查。图8从左起示出了抗na

/k

‑
atp酶的抗体、抗zo
‑
1的抗体、抗n
‑
钙粘蛋白的抗体和鬼笔环肽的染色。图8从上行起示出了以下个体的染色的图像：角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离，并已注射培养的角膜内皮细胞与y
‑
27632( )(100μm)的个体；角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离，并已注射细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的个体；后弹性膜已脱离并已注射细胞与y
‑
27632( )(100μm)的大疱性角膜病变模型的个体；后弹性膜已脱离并已注射细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的大疱性角膜病变模型的个体。
[0063]
[图9]图9示出了同时使用层粘连蛋白511
‑
e8片段处理的猴大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植后的眼前段的图像。在机械剥离角膜内皮细胞的食蟹猴(cynomolgus monkey)模型，将培养的食蟹猴角膜内皮细胞注射到前房内，并使其保持面朝
下的姿势持续3个小时。左上图表示第1天的结果，右上图表示第3天的结果，左下图表示第7天的结果，且右下图表示第14天的结果。
[0064]
[图10]图10示出了猴大疱性角膜病变模型中，使后弹性膜脱离并且同时使用层粘连蛋白511
‑
e8片段移植培养的角膜内皮细胞后的眼前段的图像。在机械剥离角膜内皮细胞的食蟹猴模型中，在后弹性膜脱离后，将培养的食蟹猴角膜内皮细胞注射到前房内，并使其保持面朝下的姿势持续3个小时。左上图表示第1天的结果，右上图表示第3天的结果，左下图表示第7天的结果，且右下图表示第14天的结果。
[0065]
[图11]图11示出了同时使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的猴大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植后的角膜厚度。示出了后弹性膜脱离的个体与后弹性膜未脱离的个体的角膜厚度(μm)。横轴表示处理后的天数，纵轴表示角膜厚度(μm)。实线表示没有后弹性膜脱离的实例，虚线表示后弹性膜脱离的个体。实心圆和三角形表示个体差异。在后弹性膜脱离的两个实例中均未观察到角膜厚度的变薄。
[0066]
[图12]图12示出了这样的眼前段的图像，即在猴大疱性角膜病变模型中使后弹性膜脱离后，将层粘连蛋白511
‑
e8片段以21nm的浓度注射到前房内，并使模型静置1小时以包被在活体中由于后弹性膜脱离而暴露的角膜基质，然后同时使用层粘连蛋白511
‑
e8片段移植培养的角膜内皮细胞后的眼前段的图像。左上图表示第1天的结果，右上图表示第3天的结果，左下图表示第7天的结果，且右下图表示第14天的结果。
[0067]
[图13]图13示出了整联蛋白对角膜内皮细胞的粘附的作用。加入层粘连蛋白511
‑
e8片段以使最终浓度为2.1nm，并接种角膜内皮细胞。示出了添加(从左起依次)小鼠igg、抗整联蛋白α3的抗体、抗整联蛋白α6的抗体、抗整联蛋白α2的抗体、抗整联蛋白β1的抗体、抗整联蛋白α3β1的抗体和抗整联蛋白α6β1的抗体后接种时，24小时后的粘附细胞数目(示出了相对于小鼠igg的比例)。右端示出了不添加层粘连蛋白511
‑
e8片段而仅添加小鼠igg以进行接种的对照。
[0068]
[图14]图14示出了细胞粘附相关蛋白的激活是由整联蛋白介导。制备无层粘连蛋白511
‑
e8片段的组作为左端的对照。从左起第二列及其后，制备添加层粘连蛋白511
‑
e8片段以使最终浓度为2.1nm的组。从左起第二列及其后示出了以下情况的蛋白质印迹的结果，依次为添加小鼠igg、抗整联蛋白α3的抗体、抗整联蛋白α6的抗体、抗整联蛋白α2的抗体、抗整联蛋白β1的抗体、抗整联蛋白α3β1的抗体和抗整联蛋白α6β1的抗体以进行接种的情况。从上行起示出了p
‑
fak、fak、p
‑
桩蛋白和背景gapdh。每个条带的数值表示将左端没有层粘连蛋白511
‑
e8的情况假设为1时定量的条带强度的相对值。
具体实施方式
[0069]
本发明在下文中描述。除非另有明确说明，在本说明书通篇中，单数形式的表述应当被理解为包含所述概念的复数形式。因此，除非另有明确说明，单数形式的冠词(例如，英语中的“一”、“一个”、“所述”等)应当被理解为包含所述概念的复数形式。此外，除非另有明确说明，本文使用的术语应当被理解为是以本领域中通常使用的含义而使用。因此，除非另有定义，本文使用的所有专门用语和科学技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如果出现矛盾，以本说明书(包括定义)为准。
[0070]
(定义)
[0071]
本文使用的“角膜内皮细胞”是以本领域中通常使用的含义使用。角膜是组成眼的薄层组织之一。角膜是透明的并且位于最接近于外部环境的部位。在人中，应当理解角膜是由五层组成，从外侧(身体表面)开始依次为角膜上皮、前弹性膜、固有层、后弹性膜(角膜内皮基底膜)和角膜内皮。除非另有具体说明，上皮和内皮以外的部分可一起被称为“角膜基质”并在本文中也如此命名。本文使用的“hcec”是人角膜内皮细胞的缩写。兔角膜内皮细胞缩写为“rcec”，猴角膜内皮细胞缩写为“mcec”。应当理解，天然存在的细胞以及分化自干细胞的细胞(例如由ips等诱导的分化细胞)可用作本发明的角膜内皮细胞。
[0072]
本文使用的“分离的”是指其中在正常环境中天然伴随实体(entity)的物质至少被减少的状态，优选其中所述实体基本上没有这类物质的状态。因此，分离的细胞、组织等是指基本上没有在天然环境中伴随它们的其他物质(例如，其他细胞、蛋白质或核酸等)的细胞、组织等。
[0073]
<层粘连蛋白>
[0074]
本文使用的“层粘连蛋白”是胞外基质的基底膜的组成蛋白。层粘连蛋白促进多细胞性/组织构建及其维持、细胞粘附、细胞迁移和细胞生长，并且与癌细胞关系密切。层粘连蛋白被认为在胚细胞样转化(blastogenesis)的早期(2细胞期)表达。层粘连蛋白是由α链、β链和γ链各一条组成的异源三聚体。对于层粘连蛋白的命名，已知按照发现次序的命名法(层粘连蛋白
‑
1、层粘连蛋白
‑
2等)。但是，未考虑与亚基的对应关系，因此本文使用一种更新的命名法，在该方法中共同描述亚类α、β或γ的名称(三位数编号，百位数表示为α，十位数表示为β，个位数表示为γ)。在α1、β1和γ1的情况下，这样的层粘连蛋白被称为层粘连蛋白111。对于层粘连蛋白，已发现五种类型的α链、三种类型的β链和三种类型的γ链。因此，理论上的最大组合数为5
×3×
3＝45，使得可能存在45种层粘连蛋白分子。但是，已认为并非所有组合都是天然存在的。例如，α链的每种亚基被称为lama1、lama2、lama3、lama4或lama5，β链的每种亚基被称为lamb1、lamb2或lamb3，且γ链的每种亚基被称为lamc1、lamc2或lamc3。用于本发明中的层粘连蛋白可以是天然存在的层粘连蛋白或具有其中一个或多个氨基酸残基被修饰当保持其生物学活性(特别是促进细胞粘附的活性)的修饰形式的蛋白。此外，本发明的层粘连蛋白的来源、其生产方法等不受限制，只要所述层粘连蛋白具有本文所述的特征。因此，本发明中所使用的层粘连蛋白可以是任何天然存在的蛋白、通过基因工程方法从重组dna表达的蛋白，或化学合成的蛋白。用于本发明中的层粘连蛋白的来源不受特别限制，但是优选地来自人。当出于获得医学材料的目的来培养人细胞时，优选地但不限于使用来自人的层粘连蛋白，以避免使用来自其他动物的材料。
[0075]
已知层粘连蛋白的结合分子。α1β1、α2β1、α2β2、α3β1、α6β1、α6β4、α7β1、α9β1、ανβ3、ανβ5和ανβ8是已知为层粘连蛋白受体的整联蛋白。
[0076]
下表描述了代表性的层粘连蛋白及对其的说明。
[0077]
[表1]
[0078][0079][0080]
本文使用的“α1链”(lama1)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lama1、lama、s
‑
lam
‑
α等。对于人lama1，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_005559和np_005550。使用登录号150320鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“α1链”或“lama1”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0081]
本文使用的“α2链”(lama2)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lama2、lamm等。对于人lama2，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_000426和np_000417。使用登录号156225鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“α2链”或“lama2”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0082]
本文使用的“α3链”(lama3)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lama3、bm600、e170、lamna、locs、lama3a等。对于人lama3，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_000227和np_000218。使用登录号600805鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“α3链”或“lama3”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0083]
本文使用的“α4链”(lama4)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lama4、lama3、lama4*
‑
1、cmd1jj等。对于人lama4，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_001105206和np_001098676。使用登录号600133鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“α4链”或“lama4”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或
由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0084]
本文使用的“α5链”(lama5)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lama5、kiaa1907等。对于人lama5，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_005560和np_005551。使用登录号601033鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“α5链”或“lama5”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0085]
本文使用的“β1链”(lamb1)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lamb1、clm、lis5等。对于人lamb1，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_002291和np_002282。使用登录号150240鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“β1链”或“lamb1”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0086]
本文使用的“β2链”(lamb2)(层粘连蛋白s)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lamb2、lams、nphs5等。对于人lamb2，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_002292和np_002283。使用登录号150325鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“β2链”或“lamb2”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0087]
本文使用的“β3链”(lamb3)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lamb3、bm600
‑
125kda、lam5、lamnb1等。对于人lamb3，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_000228和np_000219。使用登录号150310鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“β3链”或“lamb3”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0088]
本文使用的“γ1链”(lamc1)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lamc1、lamb2等。对于人lamc1，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_002293和np_002284。使用登录号150290鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“γ1链”或“lamc1”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0089]
本文使用的“γ2链”(lamc2)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lamc2、b2t、bm600、csf、ebr2、ebr2a、lamb2t、lamnb2等。对于人lamc2，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_005562和np_005553。使用登录号150292鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“γ2链”或“lamc2”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0090]
本文使用的“γ3链”(lamc3)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为lamc3、occm等。对于人lamc3，将基因和蛋白的序列分别登记为ncbi登记号nm_006059
和np_006050。使用登录号604349鉴定omim。当用于本文的目的时，应当理解“γ3链”或“lamc3”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码该蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。
[0091]
本文使用的“在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白”是指在角膜内皮细胞中具有以正常状态表达的基因或优选地在蛋白水平显著表达的层粘连蛋白类型。通过本文的分析确认表达α5、β1、β2和γ1(wo 2015/080297中的图2)。因此，确认了至少表达层粘连蛋白511和层粘连蛋白521。dev.dyn.218,213
‑
234,2000和j.biol.chem.277(15),12741
‑
12748,2002详细描述了层粘连蛋白511。因此，这些文件中公开的内容以引用的方式纳入本文。对于层粘连蛋白511等，可使用可商购的那些蛋白。例如，层粘连蛋白511和层粘连蛋白521的重组蛋白是可商购的并可获自biolamina ab。
[0092]
本文使用的基因、多核苷酸、多肽等的“表达”是指该基因等经历某种体内作用而成为另一种形式。优选地，所述表达是指基因、多核苷酸等经转录和翻译而成为多肽形式，但是转录产生mrna也可以是一种表达形式。更优选地，这样的多肽形式可以是经历翻译后加工的那些(在本文中被称为衍生物)。例如，可通过任何方法确定每种层粘连蛋白链的表达水平。具体地，可通过评估每种层粘连蛋白链的mrna的量，每种层粘连蛋白链的蛋白的量，以及每种层粘连蛋白链的蛋白的生物学活性来发现每种层粘连蛋白链的表达水平。可通过本文所述的方法来确定每种层粘连蛋白链的mrna或蛋白的量。
[0093]
本文使用的“功能等价物”是指具有与原来的实体相同的目标功能但不同的结构的任何物质。因此，应当理解，“层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链或其功能等价物”或“由层粘连蛋白、每种层粘连蛋白链及其功能等价物组成的组”涵盖：层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链本身，以及具有一种或多种对眼细胞等的细胞粘附能力、分化调控和/或生长促进作用的所述层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的片段、突变体或变体(例如，氨基酸序列变体等)；以及在作用时能转变为层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链本身，或所述层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的片段、突变体或变体的物质(包括，例如，编码层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链本身或者所述层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的片段、突变体或变体的核酸，以及包含所述核酸的载体、细胞等)。“层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链或其功能等价物”或“由层粘连蛋白、每种层粘连蛋白链及其功能等价物组成的组”的典型实例包括至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂。在本发明中，应当理解，层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的功能等价物与层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链可以相同地使用，而不对其进行任何特别说明。
[0094]
本文使用的“片段”是指相对于全长的多肽或多核苷酸(长度为n)序列长度为1至n
‑
1的多肽或多核苷酸。可根据目的对片段的长度进行适当的改变。对于多肽，其长度的下限的实例包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50和更多个氨基酸。此外，由本文中未具体列出的整数代表的长度(例如，11等)也适合作为下限。对于多核苷酸，其长度的下限的实例包括5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100或更多个核苷酸。由本文中未具体列出的整数代表的长度(例如，11等)也适合作为下限。应当理解，在本文中，当所述层粘连蛋白链的片段本身作为其活性(例如，生长促进或维持)的因子发挥作用时，这些片段在本发明的范围内。根据本发明，本文使用的术语“活性”是指最广义的分子功能。活性通常包括但不意在限于分子的生物学功能、生物化学功能、物理功能或化学功能。活性的实例包括，酶
活性，与另一分子相互作用的能力，激活、促进、稳定、抑制、遏制(suppress)或破坏(destabilize)另一分子的功能的能力，稳定性，以及定位细胞中的特定位置的能力。适用时，所述术语还涉及最广义的蛋白复合物的功能。涉及基因或相关的核酸或多肽时，本文使用的“生物学功能”是指在活体中所述基因、核酸或多肽可具有的特定功能。其实例包括但不限于产生特定的抗体、酶活性、给予抗性等。如本文所使用的，可通过“生物活性”发挥生物学功能。本文使用的“生物活性”是指在活体中某一试剂(例如，多核苷酸和蛋白等)可具有的活性，包含发挥多种功能的活性(例如，促进转录的活性)，例如，激活分子使其与另一分子相互作用或失活分子使其不能与另一分子相互作用的活性。当两个试剂相互作用时，其生物活性可视为所述两个分子之间的结合(bond)和由其产生的生物学改变，例如，当使用抗体沉淀一个分子导致另一分子共沉淀时，则两个分子结合在一起。因此，一种测定方法包括观察所述共沉淀。例如，当一种试剂是酶时，其生物活性包括其酶活性。一个实例包括：当一种试剂是配体时，使配体与对应的受体结合。可通过本领域中公知的技术来测量所述生物活性。因此，“活性”是指指示或显示所述结合(直接或间接地)或影响响应(即，具有响应于一些暴露或刺激的可测量的效应)的多种可测量的指标。其实例包括与本发明的多肽或多核苷酸直接结合的化合物的亲和性，在一些暴露或刺激后上游或下游的蛋白的量，或另一相似功能的量度(dimension)。
[0095]
本文使用的“功能活性的”是指根据与本发明的多肽、片段或衍生物相关的实施方案，具有蛋白的结构功能、调控功能或生物化学功能(例如生物活性)的多肽、片段或衍生物。
[0096]
本文使用的层粘连蛋白的“片段”是指层粘连蛋白的任何片段。作为本发明中使用的试剂，应当理解，不仅可使用层粘连蛋白的全长，还可使用层粘连蛋白的片段，只要所述片段具有全长层粘连蛋白的功能，特别是内皮细胞的细胞粘附能力。因此，本发明中使用的层粘连蛋白的片段通常具有层粘连蛋白的至少一种功能。具体而言，所述功能可包含内皮细胞的细胞粘附能力。
[0097]
下文将解释本发明中被发现在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白的序列。应当理解，这些层粘连蛋白为本发明的优选的代表性实例，本发明不限于这些具体的层粘连蛋白亚型。
[0098]
层粘连蛋白α5链的典型核苷酸序列可以是：
[0099]
(a)具有seq id no:1所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；
[0100]
(b)编码由seq id no:2所述的氨基酸序列组成的多肽或其片段的多核苷酸；
[0101]
(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自seq id no:2所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；
[0102]
(d)多核苷酸，其为seq id no:1所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体或其片段；
[0103]
(e)编码由seq id no:2所述的氨基酸序列组成的多肽的物种同源物或其片段的多核苷酸；
[0104]
(f)编码具有生物活性的多肽并且在严格条件下与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸杂交的多核苷酸；或
[0105]
(g)由与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸或其互补序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的碱基序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白α5链的活性。对于α5链，可参考doi m et al.,j.biol.chem.277(15),12741
‑
12748,2002和美国专利no.6,933,273。
[0106]
层粘连蛋白α5链的氨基酸序列可以是：
[0107]
(a)由seq id no:2所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；
[0108]
(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自seq id no:2所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；
[0109]
(c)由seq id no:1所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；
[0110]
(d)多肽，其为seq id no:2所述的氨基酸序列的物种同源物；或
[0111]
(e)具有与(a)
‑
(d)之一的多肽有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列，并且具有生物活性的多肽。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白α5链的活性。对于α5链，可参考doi m et al.,j.biol.chem.277(15),12741
‑
12748,2002和美国专利no.6,933,273。
[0112]
层粘连蛋白β1链的典型核苷酸序列可以是：
[0113]
(a)具有seq id no:3所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；
[0114]
(b)编码由seq id no:4所述的氨基酸序列组成的多肽或其片段的多核苷酸；
[0115]
(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自seq id no:4所述的氨基酸序列中置换、添加和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；
[0116]
(d)多核苷酸，其为seq id no:3所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体或其片段；
[0117]
(e)编码由seq id no:4所述的氨基酸序列组成的多肽的物种同源物或其片段的多核苷酸；
[0118]
(f)编码具有生物活性的多肽并且在严格条件下与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸杂交的多核苷酸；或
[0119]
(g)由与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸或其互补序列有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的碱基序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白β1链的活性。对于β1链，可参考pillarainen et al.,j.biol.chem.262(22),10454
‑
10462,1987和美国专利no.6,933,273。
[0120]
层粘连蛋白β1链的氨基酸序列可以是：
[0121]
(a)由seq id no:4所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；
[0122]
(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自seq id no:4所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；
[0123]
(c)由seq id no:3所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；
[0124]
(d)多肽，其为seq id no:4所述的氨基酸序列的物种同源物；或
[0125]
(e)具有与(a)
‑
(d)之一的多肽有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约
95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列，并且具有生物活性的多肽。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白β1链的活性。对于β1链，可参考pillarainen et al.,j.biol.chem.262(22),10454
‑
10462,1987和美国专利no.6,933,273。
[0126]
层粘连蛋白β2链的典型核苷酸序列可以是：
[0127]
(a)具有seq id no:5所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；
[0128]
(b)编码由seq id no:6所述的氨基酸序列组成的多肽或其片段的多核苷酸；
[0129]
(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自seq id no:6所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；
[0130]
(d)多核苷酸，其为seq id no:5所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体或其片段；
[0131]
(e)编码由seq id no:6所述的氨基酸序列组成的多肽的物种同源物或其片段的多核苷酸；
[0132]
(f)编码具有生物活性的多肽并且在严格条件下与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸杂交的多核苷酸；或
[0133]
(g)由与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸或其互补序列有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的碱基序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白β2链的活性。对于β2链，可参考wewer um et al.,genomics.nov 15,1994；24(2):243
‑
52.,1987和美国专利no.6,933,273。
[0134]
层粘连蛋白β2链的氨基酸序列可以是：
[0135]
(a)由seq id no:6所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；
[0136]
(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自seq id no:6所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；
[0137]
(c)由seq id no:5所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；
[0138]
(d)多肽，其为seq id no:6所述的氨基酸序列的物种同源物；或
[0139]
(e)具有与(a)
‑
(d)之一的多肽有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列，并且具有生物活性的多肽。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白β2链的活性。对于β2链，可参考wewer um et al.,genomics.nov 15,1994；24(2):243
‑
52.,1987和美国专利no.6,933,273。
[0140]
层粘连蛋白γ1链的典型核苷酸序列可以是：
[0141]
(a)具有seq id no:7所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；
[0142]
(b)编码由seq id no:8所述的氨基酸序列组成的多肽或其片段的多核苷酸；
[0143]
(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自seq id no:8所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；
[0144]
(d)多核苷酸，其为seq id no:7所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体或其片
段；
[0145]
(e)编码由seq id no:8所述的氨基酸序列组成的多肽的物种同源物或其片段的多核苷酸；
[0146]
(f)编码具有生物活性的多肽并且在严格条件下与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸杂交的多核苷酸；或
[0147]
(g)由与(a)
‑
(e)之一的多核苷酸或其互补序列有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的碱基序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白γ1链的活性。对于γ1链，可参考pillarainen et al.,j.biol.chem.263(14),6751
‑
6758,1988和美国专利no.6,933,273。
[0148]
层粘连蛋白γ1链的氨基酸序列可以是：
[0149]
(a)由seq id no:8所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；
[0150]
(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自seq id no:8所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；
[0151]
(c)由seq id no:7所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；
[0152]
(d)多肽，其为seq id no:8所述的氨基酸序列的物种同源物；或
[0153]
(e)具有与(a)
‑
(d)之一的多肽有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列，并且具有生物活性的多肽。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白γ1链的活性。对于γ1链，可参考pillarainen et al.,j.biol.chem.263(14),6751
‑
6758,1988和美国专利no.6,933,273。
[0154]
本文所用的“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”可以相同的含义互换使用，是指任意长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链或环链。氨基酸可以是天然存在或非天然存在的氨基酸，或可以是改变的氨基酸。该术语也可包括组装成具有多条多肽链的复合物的那些。该术语也包括天然或人工改变的氨基酸聚合物。所述改变的实例包括，例如，二硫键形成、糖基化、脂质化(lipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或改变(例如，与标记组分缀合)。该定义也包括，例如，包含一个或多个氨基酸类似物(例如，包含非天然存在的氨基酸等)的多肽，类肽化合物(例如，类肽)和其他本领域中公知的改变。对于本发明的蛋白(例如，每种层粘连蛋白链)，将编码每种目的链基因的dna整合至适合载体中，并且使用能够在各个宿主中表达的表达载体将其引入至真核细胞或原核细胞中，使各个链表达以获得所需的蛋白。可用于表达层粘连蛋白的宿主细胞没有特别限制。其实例包括：原核宿主细胞，例如大肠杆菌(escherichia.coli)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；以及真核宿主细胞，例如酵母、真菌、昆虫细胞、植物和植物细胞，以及哺乳动物细胞。使用转化、转染、缀合(conjugation)、原生质体融合、电穿孔、基因枪技术、磷酸钙沉淀、农杆菌(agrobacterium)法、直接显微注射等，可将所构建的用于表达目的层粘连蛋白链等的载体引入上述宿主细胞。使包含载体的细胞生长在适合的培养基中以产生用于本发明中的层粘连蛋白链，从细胞或培养基中纯化所述层粘连蛋白链以获得层粘连蛋白链等。使用分子筛色谱法、hplc、离子交换色谱法、免疫亲和色谱法等进行纯化。
[0155]
本文使用的“氨基酸”可以是天然存在的或非天然存在的，只要能实现本发明的目
的。
[0156]
本文使用的“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可以相同的含义互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物。这些术语也包括“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”。所述“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”是指可互换使用，并且是指包含其中核苷酸之间的键不同于正常键的核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸的衍生物。这类寡核苷酸的具体实例包括：2'
‑
o
‑
甲基
‑
核糖核苷酸；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯键被转化为硫代磷酸酯键；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯键被转化为n3'
‑
p5'氨基磷酸酯键；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖和磷酸二酯键被转化为肽核酸键；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶被c
‑
5丙炔基尿嘧啶取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶被c
‑
5噻唑尿嘧啶取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶被c
‑
5丙炔基胞嘧啶取代；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶被吩噁嗪修饰的胞嘧啶取代；寡核苷酸衍生物，其中dna中的核糖被2'
‑
o
‑
丙基核糖取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖被2'
‑
甲氧基乙氧基核糖取代。除非另有说明，特定的核酸序列意欲包括明确说明的序列，以及它们的保守性改变的变体(例如，简并密码子取代物)及互补序列。特别地，可通过产生其中一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列而获得简并密码子取代物(batzer et al.,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka et al.,j.biol.chem.260:2605
‑
2608(1985)；rossolini et al.,mol.cell.probes 8:91
‑
98(1994))。本文使用的“核酸”可与基因、cdna、mrna、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。本文使用的“核苷酸”可以是天然存在或非天然存在的。
[0157]
本文使用的“基因”是指定义遗传性状的试剂(agent)。通常，基因在染色体上以给定的次序排列。定义蛋白的一级结构的基因被称为结构基因，影响其表达的基因被称为调节基因。在本文中，“基因”可指“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”。
[0158]
在本文中可通过公知的三字母符号或iupac
‑
iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及氨基酸。类似地，可通过公认的单字母编码提及核苷酸。在本文中，通过使用默认参数和序列分析工具blast的计算来比较氨基酸序列和碱基序列的相似性、同一性和同源性。使用ncbi的blast 2.2.26(2011年10月30日发布)来检索同一性。本文中，同一性的值通常是指使用上述blast在默认条件下比对时的值。但是，当通过改变参数而获得更高的值时，则认为最高值为同一性的值。如果在多个区域评估同一性时，则认为其中的最高值为同一性的值。相似性是除同一性以外还考虑相似氨基酸时所计算的数值。
[0159]
本文使用的“在严格条件下杂交的多核苷酸”是指本领域中通常使用的公知条件。应当理解，与每种具体公开的层粘连蛋白的核酸序列“在严格条件下杂交的多核苷酸”编码的层粘连蛋白，也可用作本发明中使用的层粘连蛋白。这种多核苷酸可使用菌落杂交、噬菌斑杂交或dna印迹杂交等获得，并且使用选自本发明的多核苷酸的多核苷酸作为探针。具体而言，其是指可通过以下方式确定的多核苷酸：于65℃下，在存在0.7至1.0m nacl的情况下，使用固定有菌落或噬菌斑来源的dna的滤器进行杂交，然后在65℃的条件下使用0.1至2倍浓度的ssc(柠檬酸钠盐水)溶液(其中1倍浓度的ssc溶液的组成为150mm氯化钠和15mm柠檬酸钠)冲洗所述滤器。所述杂交可以根据实验文献(例如molecular cloning第二版,current protocols in molecular biology,supplement 1
‑
38,dna cloning 1:core techniques,a practical approach,第二版,oxford university press(1995))中所述的
ophthalmol 1982,26:264
‑
273；matsubara m,tanishima t:wound
‑
healing of corneal endothelium in monkey:an autoradiographic study,jpn j ophthalmol 1983,27:444
‑
450；van horn dl,hyndiuk ra:endothelial wound repair in primate cornea,exp eye res 1975,21:113
‑
124和van horn dl,sendele dd,seideman s,buco pj:regenerative capability of the corneal endothelium in rabbit and cat,invest ophthalmol vis sci 1977,16:597
‑
613)等。
[0164]
zo
‑
1和na

/k

‑
atp酶可以通过观察核酸水平的基因表达进行评估，如rt
‑
pcr或免疫学方法。对na

/k

‑
atp酶和zo
‑
1在与正常细胞相同的水平上的表达和/或功能的确认使得能够确认受试细胞是否具有正常功能。
[0165]
对于适应角膜移植的能力，可通过机械刮除角膜内皮作为使用实验动物(例如兔)的大疱性角膜病变模型，进行移植培养细胞的测试。但是，因为兔的角膜内皮细胞在体内生长，不能否认由于宿主角膜内皮细胞的生长而自然愈合的可能性(matsubara m et al.,jpn j ophthalmol 1982,26:264
‑
273；matsubara m et al.,jpn j ophthalmol 1983,27:444
‑
450；van horn dl et al.,exp eye res 1975,21:113
‑
124和van horn dl et al.，invest ophthalmol vis sci 1977,16:597
‑
613)。因此，为了更准确地评估适应移植的能力，优选地评估对灵长类动物的移植物植入。当评估适应对人的移植的能力时，例如，在至少1个月，优选地至少2个月，更优选地至少3个月，仍然更优选地至少6个月，还仍然更优选地至少12个月之后，在灵长类动物(例如食蟹猴)中评估适应性。对适应灵长类动物(例如猴)中的移植的能力的确认是重要的，特别是在应用于人时。
[0166]
一般技术
[0167]
本文使用的分子生物学方法、生物化学方法和微生物方法是本领域中公知的和常用的方法，其记载于，例如，sambrook j.et al.(1989).molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor及其第三版(2001)；ausubel,f.m.(1987).current protocols in molecular biology,greene pub.associates and wiley
‑
interscience；ausubel,f.m.(1989).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates and wiley
‑
interscience；innis,m.a.(1990).pcr protocols:a guide to methods and applications,academic press；ausubel,f.m.(1992).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates；ausubel,f.m.(1995).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates；innis,m.a.et al.(1995).pcr strategies,academic press；ausubel,f.m.(1999).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,wiley,and annual updates；sninsky,j.j.et al.(1999).pcr applications:protocols for functional genomics,academic press,gait,m.j.(1985).oligonucleotide synthesis:apractical approach,irl press；gait,m.j.(1990).oligonucleotide synthesis:a practical approach,irl press；eckstein,f.(1991).oligonucleotides and analogues:a practical approach,irl press；adams,r.l.et al.(1992).the biochemistry of the nucleic acids,
chapman&hall；shabarova,z.et al.(1994).advanced organic chemistry of nucleic acids,weinheim；blackburn,g.m.et al.(1996).nucleic acids in chemistry and biology,oxford university press；hermanson,g.t.(1996).bioconjugate techniques,academic press,bessatsu jikken igaku[experimental medicine,supplemental volume],idenshi donyu oyobi hatsugen kaiseki jikken ho[experimental methods for transgenesis&expression analysis],yodosha,1997等是公知的。由于如前所述的，长期培养和传代培养导致成纤维细胞样转化，因此现在仍在进行关于有效的培养方法的研究。上述文献的相关部分(其可以是完整的文献)以引用的方式纳入本文。
[0168]
优选的实施方案
[0169]
以下将描述优选的实施方案。应当理解，所述实施方案是本发明的实施例，本发明的范围不应限于这些优选的实施方案。还应当理解，本领域技术人员通过参考以下优选的实施方案可在本发明的范围内容易地进行改变和修饰。还应当理解，可组合任何实施方案。
[0170]
预防或治疗
[0171]
一方面，本发明提供了用于角膜(例如角膜内皮)的疾病、障碍或病症的治疗或预防试剂，所述试剂包含至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂。在这方面，本发明还提供了至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂，用于治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症。在这方面，本发明替代地提供了治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂给予需要该治疗或预防的受试者。在这方面，应当理解，对于角膜内皮和上皮等，可以类似地实现对于角膜的治疗或预防效果。
[0172]
在一个具体实施方案中，本发明提供了用于角膜内皮的疾病、障碍或病症的治疗或预防试剂，所述试剂包含至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂。
[0173]
在一个实施方案中，本发明中使用的试剂或层粘连蛋白包含rgd序列。虽然不希望受任何理论束缚，但rgd序列被认为与细胞粘附有关。应当理解，具有突出的细胞粘附能力的层粘连蛋白可用于治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症，或可对其加以改善。
[0174]
在另一个实施方案中，本发明中使用的试剂或层粘连蛋白包含α5链。虽然不希望受任何理论束缚，但是这是因为通过实施例等中所示的结果证明包含α5链的层粘连蛋白的类型能够治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症或对其加以改善，并且只要α5链存在，就认为β链和γ链具有一定程度的柔性。
[0175]
在另一个实施方案中，本发明中使用的试剂或层粘连蛋白包含γ1链。虽然不希望受任何理论束缚，但是这是因为通过实施例等中所示的结果证明包含γ1链的层粘连蛋白的类型能够治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症或对其加以改善，并且只要γ1链存在，就认为α链和β链具有一定程度的柔性。
[0176]
在另一个实施方案中，本发明中使用的试剂或层粘连蛋白包含α5链和/或γ1链。虽然不希望受任何理论束缚，但是这是因为通过实施例等中所示的结果证明包含α5链和/或γ1链的层粘连蛋白的类型能够治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症或对其加以改善，并且证明了层粘连蛋白511和层粘连蛋白521的作用，使得只要确定了α5链和/或γ1链，就证明β链具有一定程度的柔性。
[0177]
在一个优选实施方案中，所述层粘连蛋白包含层粘连蛋白511和层粘连蛋白521。
因此，本实施方案中，本发明的试剂可以是层粘连蛋白511，层粘连蛋白521或其片段。任何片段均可用作本发明的层粘连蛋白511或层粘连蛋白521的片段，只要所述片段能够治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症或对其加以改善。这样的片段的实例包括但不限于层粘连蛋白511
‑
e8片段和层粘连蛋白521片段(分别地，seq id no:9和10(核酸序列和氨基酸序列)及seq id no:11和12(核酸序列和氨基酸序列))(参见taniguchi y,ido h,sanzen n,hayashi m,sato
‑
nishiuchi r,futaki s,sekiguchi k.the c
‑
terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins.j biol chem.284:7820
‑
7831,2009；可从nippi.inc.获得)。层粘连蛋白511
‑
e8片段和层粘连蛋白521片段是通过弹性蛋白酶处理获得的片段，并由在异源三聚体的卷曲螺旋结构域的一部分和α链c末端区域中的3个lg结构域(lg1至lg3)组成。e8片段被认为对应于异源三聚体分子的整联蛋白结合位点，所述异源三聚体分子中层粘连蛋白的α链、β链和γ链经由卷曲螺旋结构域彼此组装的。因此，其中基本保持整联蛋白结合位点的全长层粘连蛋白的片段可以用作优选的片段。应当理解，可以通过基于层粘连蛋白511
‑
e8片段和层粘连蛋白521片段的信息的适当改变来制备这样的片段。
[0178]
此处，人层粘连蛋白α5β1γ1的e8片段(本文也称为“人层粘连蛋白511
‑
e8”)是指对应于鼠层粘连蛋白α1β1γ1的e8片段(以下也称为“鼠层粘连蛋白111
‑
e8”)的人层粘连蛋白α5β1γ1(以下也称为“人层粘连蛋白511”)的片段。如本文所用，术语“层粘连蛋白511
‑
e8片段”也表示为“层粘连蛋白511
‑
e8片段”，“层粘连蛋白511e8”或“层粘连蛋白511
‑
e8”。层粘连蛋白的e8片段已被鉴定为可通过用弹性蛋白酶消化鼠层粘连蛋白α1β1γ1(以下称为“鼠层粘连蛋白111”)获得的片段之中具有强细胞粘附活性的片段(edgar d.,timpl r.,thoenen h.the heparin
‑
binding domain of lamininis responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival.emboj.,3:1463
‑
1468,1984.,goodman sl.,deutzmann r.,von der mark k.two distinct cell
‑
binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading.j.cell biol.,105:589
‑
598,1987)。对于人层粘连蛋白511和人层粘连蛋白332，在用弹性蛋白酶消化时，假设存在与鼠层粘连蛋白111
‑
e8对应的片段。用于本发明的人层粘连蛋白511
‑
e8片段仅需要是具有与鼠层粘连蛋白111
‑
e8相同的细胞粘附活性、结构和近似分子量的人层粘连蛋白511的片段，而不需要是人层粘连蛋白511的弹性蛋白酶消化产物。制备人层粘连蛋白511
‑
e8片段的方法没有特别限定。这种方法的实例包括用蛋白水解酶(如弹性蛋白酶)消化全长人层粘连蛋白511以分级分离和纯化目标片段的方法，作为重组蛋白质的制备方法等。从制备量、质量一致性、制备成本等的角度出发，优选作为重组蛋白质的制备方法。重组人层粘连蛋白511
‑
e8片段可以通过适当地使用已知的遗传工程技术制备。制备重组人层粘蛋白511
‑
e8片段的方法可以通过以下方式制备：例如，获得编码人层粘连蛋白511
‑
e8片段的每种α链、β链和γ链的蛋白质的dna，将每种所获得的dna插入表达载体中，使所得到的三种表达载体通过共转染至合适的宿主细胞中而表达，并用公知的方法纯化形成三聚体的蛋白质(例如，参见hiroyuki ido et al.，"the requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the lamininγchains in integrin binding by laminins"the journal of biological chemistry,282,11144
‑
11154,2007)。关于具体的生产方法，可以参照日本专利申请2011
‑
78370。也可
以通过使用人层粘连蛋白521来生产相似的片段。这被称为层粘连蛋白521
‑
e8片段。应当理解，这样的片段可以以与层粘连蛋白511
‑
e8片段相同的方式制备，并保持与层粘连蛋白511
‑
e8片段相同的活性。在本发明中，应当理解，对于包含α5链和/或γ1链的任何层粘连蛋白，可以类似的方法制备e8片段。还应当理解，这种e8片段可以类似地用于本发明的全长层粘连蛋白。
[0179]
在优选的实施方案中，所述层粘连蛋白包含层粘连蛋白511(α5β1γ1)和层粘连蛋白521(α5β2γ1)，或者所述试剂是层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白511
‑
e8片段或层粘连蛋白521
‑
e8片段。
[0180]
在另一个实施方案中，本发明中使用的所述片段具有角膜细胞(角膜内皮细胞)的细胞粘附能力。
[0181]
在一个实施方案中，所使用的试剂(例如层粘连蛋白或其片段)的浓度可以是任何浓度，只要有治疗或预防效果即可(也称为有效浓度，或用于治疗的治疗有效浓度，或用于预防的预防有效浓度)。其实例包括但不限于约0.1nm或以上，约0.2nm或以上，约0.3nm或以上，约0.4nm或以上，约0.5nm或以上，约0.6nm或以上，约0.7nm或以上，约0.8nm或以上，约0.9nm或以上，约1nm或以上，约2nm或以上，约2.1nm或以上，约3nm或以上，约4nm或以上，约5nm或以上，约6nm或以上，约7nm或以上，约8nm或以上，约9nm或以上，约10nm或以上，约15nm或以上，约20nm或以上，约21nm或以上，约25nm或以上，约30nm或以上，约40nm或以上，约50nm或以上，约60nm或以上，约70nm或以上，约80nm或以上，约90nm或以上，约100nm或以上等。
[0182]
在一个实施方案中，本发明靶向的部位包括角膜内皮。因此，本发明靶向的疾病、障碍或病症包括但不限于本发明靶向的角膜内皮的疾病、障碍或病症。
[0183]
在一个实施方案中，所述眼科部位来自灵长类动物。在另一个实施方案中，所述眼科部位来自人。
[0184]
在一个实施方案中，所述眼细胞来自灵长类动物。在另一个实施方案中，所述眼的细胞来自人。
[0185]
在一个实施方案中，所述角膜内皮来自灵长类动物。在另一个实施方案中，所述角膜内皮来自人。
[0186]
在一个实施方案中，所述角膜内皮细胞来自灵长类动物。在另一个实施方案中，所述角膜内皮细胞来自人。虽然不希望受任何理论的束缚，但由于本说明书实施例中角膜内皮模型中的层粘连蛋白的治疗或预防效果不仅在兔子中而且在灵长类动物中也得以证明，本领域技术人员应当理解类似的治疗或预防效果可在任何哺乳动物中实现。
[0187]
本发明靶向的角膜内皮的疾病、障碍或病症的实例包括需要移植角膜内皮的疾病，例如大疱性角膜病变，角膜水肿，角膜白斑，特别是由起因于角膜营养不良、外伤或内部眼科手术导致的角膜内皮障碍导致的大疱性角膜病变。移植物可用于其治疗。这种大疱性角膜病变、角膜内皮障碍等的病因的实例包括手术，以及富克斯角膜内皮营养不良，外伤，假性表皮脱落综合征，角膜内皮炎等。
[0188]
在另一个实施方案中，角膜内皮的疾病、障碍或病症的实例包括畏光，视力模糊，视力缺损，眼痛，溢泪，充血，疼痛，大疱性角膜病变，眼部不适，对比度降低，眩光，角膜基质水肿，大疱性角膜病变和角膜混浊等。
[0189]
治疗或预防本发明的角膜内皮的疾病、障碍或病症的受试者的实例包括哺乳动物(例如，人，小鼠，大鼠，仓鼠，兔，猫，狗，牛，羊，猴等)，并且优选灵长类动物(例如人)。
[0190]
在一个实施方案中，本发明靶向的角膜内皮包含角膜内皮层、后弹性膜或两者。
[0191]
在优选的实施方案中，本发明靶向的角膜内皮包含后弹性膜。本发明靶向的角膜内皮包括具有处于脱离状态的后弹性膜的角膜内皮。发现本发明的技术能治疗用常规技术难以完全恢复的处于脱离状态的后弹性膜。本发明的技术也可理解为在这一点上的质的改进。
[0192]
组合治疗
[0193]
在另一方面，本发明提供一种用于角膜内皮的疾病、障碍或病症的治疗或预防试剂，所述试剂使用至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂和角膜内皮细胞。在这一点上，本发明的试剂和角膜内皮细胞可以作为混合物使用或独立给予。因此，在这方面，本发明提供了治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂给予需要该治疗或预防的受试者，以及将角膜内皮细胞和/或rock抑制剂给予所述受试者。应当理解，本方面的本发明方法中使用的试剂(层粘连蛋白，其片段等)、角膜内皮细胞、rock抑制剂等可以以本文所解释的任何形式使用。
[0194]
虽然不希望受任何理论束缚，但通过在治疗本身中使用角膜内皮细胞和至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂，如实施例所证明的，角膜的混浊变得澄清，角膜厚度减少，并且指示功能的标志物回到正常。此外，实现了以往无法实现的治疗结果。此外，治疗所需时间的特征在于显著更短，如其中在两至三天内显示显著效果并在一周内达到接近完全恢复的情况所证明的。
[0195]
另一方面，本发明提供一种用于角膜内皮的疾病、障碍或病症的治疗或预防试剂，所述试剂使用至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂和rock抑制剂(该术语与“rho激酶抑制剂”同义)。在这一点上，本发明的试剂和rock抑制剂可以作为混合物使用或独立给予。应当理解，本发明的方法中使用的试剂(层粘连蛋白，其片段等)可以本文所解释的任何形式使用。
[0196]
在本发明中，“rho激酶”是指通过激活rho而被活化的丝氨酸/苏氨酸激酶。其实例包括rokα(rock
‑
ii：leung,t.et al.,j.biol.chem.,270,29051
‑
29054,1995),p160rock(rokβ，rock
‑
i：ishizaki,t.et al.,the embo j.,15(8),1885
‑
1893,1996)和其它具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白质。
[0197]
rock抑制剂的实例包括以下文献中公开的化合物：美国专利4678783，日本专利3421217，国际公开wo 95/28387，国际公开wo 99/20620，国际公开wo 99/61403，国际公开wo 02/076976，国际公开wo 02/076977，国际公开wo 2002/083175，国际公开wo 02/100833，国际公开wo 03/059913，国际公开wo 03/062227，国际公开wo 2004/009555，国际公开wo 2004/022541，国际公开wo 2004/108724，国际公开wo 2005/003101，国际公开wo 2005/039564，国际公开wo 2005/034866，国际公开wo 2005/037197，国际公开wo 2005/037198，国际公开wo 2005/035501，国际公开wo 2005/035503，国际公开wo 2005/035506，国际公开wo 2005/080394，国际公开wo 2005/103050，国际公开wo 2006/057270，国际公开wo 2007/026664等。这些化合物可以通过其中公开了所述化合物的各篇文献中描述的方法来制备。其具体实例包括1
‑
(5
‑
异喹啉磺酰基)高哌嗪或其盐(例如法舒地尔(1
‑
(5
‑
异喹啉
磺酰基)高哌嗪))，( )
‑
反式
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑1‑
(4
‑
吡啶基氨甲酰基)环己烷((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺)或其盐(例如，y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)等)等。对于这些化合物，也可以适当地使用市售产品(wako pure chemical industries,ltd,asahi kasei pharma corporation等)。
[0198]
在优选的实施方案中，用于本发明的rock抑制剂(rho激酶抑制剂)的实例包括但不限于y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)等。
[0199]
任何角膜内皮细胞均可用作本文所用的“角膜内皮细胞”。所述角膜内皮细胞可以为分离的或培养的。角膜内皮细胞可以是通过使用本发明人开发的方法的正常培养方法培养的那些，或是通过其他方法培养的那些。例如，可以使用通过wo 2013/100208中描述的方法培养的角膜内皮细胞。例如，在所述角膜内皮细胞的培养过程中，纤维化抑制剂可以一直存在，而粘附促进剂可以存在一定时段(例如，24至72小时，或48小时等)，然后暂时除去，接着再存在一定时段(例如，24至72小时，或48小时等；此时段可每次变化或保持不变)。或者，这些培养方法可以任选地为不使用粘附促进剂的方法。例如，以下三种类型是其实例。
[0200]
培养方法1
[0201]
在原代培养和传代培养期间，添加作为具有粘附促进作用的rock抑制剂的y
‑
27632(例如，可获自wako，目录号：253
‑
00513)，持续48小时使最终浓度为10μmol/l。
[0202]
培养方法2
[0203]
在培养过程中持续添加rock抑制剂y
‑
27632使最终浓度为10μmol/l。
[0204]
培养方法3
[0205]
将细胞在补充有sb431542(例如，可获自merck millipore，billerica，ma)(1μmol/l)和sb203580(1μmol/l)的基础培养基中培养，而不添加y
‑
27632。
[0206]
所使用的培养基可以是已经出售并使用的培养基成分，或单独开发用于角膜内皮的成分。这种培养基成分的实例包括但不限于optimem，dmem，m199，mem等(这些可从invitrogen等获得)。典型实例包括：对于人类，opti
‑
mem i还原血清培养基，液体(invitrogen目录号：31985
‑
070) 8％fbs(biowest，目录号：s1820
‑
500) 200mg/ml cacl2·
2h2o(sigma目录号：c7902
‑
500g) 0.08％硫酸软骨素(sigma目录号：c9819
‑
5g) 20μg/ml抗坏血酸(sigma目录号：a4544
‑
25g) 50μg/ml庆大霉素(invitrogen目录号：15710
‑
064) 5ng/ml egf(invitrogen目录号：phg0311)驯化用于3t3饲养细胞作为基础培养基，以及sb431542(1μmol/l)和sb203580(1μmol/l)。
[0207]
<1>在试管中收集和培养角膜内皮细胞
[0208]
使用常规方法从受体自身或适合的供体的角膜收集角膜内皮细胞。考虑到本发明的移植条件，可制备来自相同物种(species)的角膜内皮细胞。例如，使角膜组织的后弹性膜和内皮细胞层从角膜基质脱离，然后将其转移至培养皿并用中性蛋白酶(dispase)等处理。因此，角膜内皮细胞从后弹性膜脱落。可通过移液(pipetting)等使残留在后弹性膜上的角膜内皮细胞脱落。移除后弹性膜之后，在培养液(例如wo2013/100208中所述)中培养角膜内皮细胞。可使用以下试剂作为培养物或培养溶液，例如，将fbs(胎牛血清)(例如，biowest，目录号：s1820
‑
500)、b
‑
fgf(碱性成纤维细胞生长因子)(例如，invitrogen，目录
号：13256
‑
029)和抗生素物质(例如，青霉素和链霉素)适当地添加到可商购的dmem(达尔贝科改良伊格尔培养基)(例如，invitrogen，目录号：12320等)中，然后添加wo2013/100208中所示的培养标准化物(culture normalizer)的组分。包被本发明的试剂以进行培养，促进角膜内皮细胞粘附到培养容器的表面，实现优良的生长。当通过将层粘连蛋白添加到培养溶液中进行培养时，优选地使用培养皿，所述培养皿的表面包被有i型胶原蛋白、iv型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或牛角膜内皮细胞的胞外基质等。或者，可使用以可商购的包被试剂(例如，fnc包被混合物(50ml(aes
‑
0407)，athena，目录号：0407))处理的常规培养容器。培养角膜内皮细胞的温度条件没有特别限制，只要角膜内皮细胞生长。例如，温度为约25℃
‑
约45℃，当考虑生长效率时，优选地为约30℃
‑
约40℃，更优选地约37℃。在常规细胞培养箱中，在增湿的情况下于约5
‑
10％co2浓度的环境中进行所述培养方法。
[0209]
<2>传代培养
[0210]
在使接受培养的角膜内皮细胞生长之后，可对所述细胞进行传代培养。优选地，在近汇合(subconfluence)或汇合时进行传代培养。可如下进行传代培养。首先，用胰蛋白酶
‑
edta等处理细胞，从而使得细胞从培养容器的表面脱附。然后收集细胞。将本发明的培养标准化物或培养基添加到所收集的细胞中以获得细胞悬液。优选地在收集细胞时或收集后对细胞进行离心处理。所述离心使得能够制备高密度的细胞悬液。优选的细胞密度为约1
‑2×
106个细胞/ml。所述离心条件的实例包括但不限于，例如，500rpm(30g)
‑
1000rpm(70g)，持续1至10分钟。
[0211]
将所述细胞悬液接种到培养容器中，并且以与上述原代培养同样的方式进行培养。尽管传代培养的稀释率根据细胞的状态而改变，但是所述稀释率为约1:2至1:4，优选1:3。可在与上述原代培养的条件类似的培养条件下进行传代培养。孵育时间根据待使用的细胞的状态等而改变。其实例包括7至30天。可根据需要多次进行上述传代培养。当使用rock抑制剂等时，可增强培养初期的细胞粘附，实现较短的培养期。
[0212]
使用密度梯度离心纯化高密度角膜内皮细胞
[0213]
在一个实施方案中，可在使用密度梯度离心法纯化高密度角膜内皮细胞后，将所述细胞用于本发明。其方法通常如下。可使用合适的方法(例如，optiprep
tm
)以800
×
g对培养的人角膜内皮细胞(低密度细胞和高密度细胞的混合物)进行密度梯度离心15分钟。可以收集沉淀(pellet)和上清液中含有的细胞，并将适当数目的每种细胞(例如420个细胞/mm2)分别作为沉淀组和上清液组接种并培养。30天后用相差显微镜观察形态，以通过免疫染色分析角膜内皮功能相关标记物的表达并测量细胞密度/细胞面积。离心后，培养的细胞在沉淀组和上清液组中均显示单层多角形细胞形态。获得表现出na

/k

‑
atp酶和zo
‑
1表达的细胞。此外，沉淀组通常具有显著更高的细胞密度。沉淀组中的细胞面积中间值(四分位距)通常较低，分散较小。因此，应当理解，高密度细胞可以通过密度梯度离心法纯化并用于本发明。
[0214]
包被
[0215]
在一个实施方案中，本发明提供用于角膜内皮的疾病、障碍或病症的治疗或预防试剂，其包含至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂，其中所述试剂被注射到眼内从而与眼内的组织相接触。因此，在这方面，本发明还提供治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂给予需要
该治疗或预防的受试者，其中将所述试剂注射到所述受试者的眼内从而与眼内的组织相接触。应当理解，本发明方法中使用的试剂(层粘连蛋白，其片段等)可以本文所解释的任何形式使用。在这一点上，应当理解，将所述试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触，导致在眼中形成至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂的包被(本文中也指层粘连蛋白包被)以促进角膜愈合。
[0216]
在一个实施方案中，包被时使用的所述试剂的浓度可以是任何浓度只要具有治疗或预防作用即可的(也称为有效浓度；也称为用于包被的有效包被浓度)。其实例包括但不限于约0.1nm或以上，约0.2nm或以上，约0.3nm或以上，约0.4nm或以上，约0.5nm或以上，约0.6nm或以上，约0.7nm或以上，约0.8nm或以上，约0.9nm或以上，约1nm或以上，约2nm或以上，约2.1nm或以上，约3nm或以上，约4nm或以上，约5nm或以上，约6nm或以上，约7nm或以上，约8nm或以上，约9nm或以上，约10nm或以上，约15nm或以上，约20nm或以上，约21nm或以上，约25nm或以上，约30nm或以上，约40nm或以上，约50nm或以上，约60nm或以上，约70nm或以上，约80nm或以上，约90nm或以上，约100nm或以上等。
[0217]
在一个优选的实施方案中，可以在将所述试剂注射到角膜内皮附近从而与构成角膜内皮的细胞或组织接触之前、同时或之后，进一步给予角膜细胞(如角膜内皮细胞)。因此，本发明中，可以将所述试剂与角膜内皮细胞分开给予。给予角膜细胞(如角膜内皮细胞)的时机优选地为在将所述试剂注射到眼内而与眼内的组织接触(包被)之后或同时，更优选地在将所述试剂注射到眼内而与眼内的组织接触之后。已揭示了，包被的存在促进了以这种方式给予到角膜内皮组织上的角膜细胞(如角膜内皮细胞)的移植物植入，而显著促进治疗效果。
[0218]
在另一方面，本发明是用于角膜内皮的疾病、障碍或病症的预防或治疗试剂，其包含至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂与角膜细胞(如角膜内皮细胞)的混合物，其中至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂(其不同于所述至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂)被注射到眼内从而与眼内的组织相接触，优选地与接受治疗或预防的组织的一部分(例如，角膜内皮等)相接触。因此，在这方面，本发明提供了治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂给予需要该治疗或预防的受试者，其中提供与角膜内皮细胞混合的所述试剂，并且将至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触。在这方面，可以在将至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触(包被)之前、同时或之后给予上述混合物。给予混合物的时机优选地为在将该试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触之后或同时，更优选地在将该试剂注射到眼内从而与眼内的组织相接触之后。尽管不希望受任何理论束缚，但是应当理解，这种包被提供了促进上述试剂和角膜细胞(如角膜内皮细胞)的混合物的建立的环境，从而促进角膜的治愈。应当理解，角膜细胞(如角膜内皮细胞)可以本文所解释的任何形式或任何公知形式使用。
[0219]
在优选的实施方案中，本发明的治疗或预防试剂(以包被的形式)进一步包含rock抑制剂。rock抑制剂和所述试剂可以同时、顺序地或独立给予。
[0220]
rock抑制剂可以是本文单独解释的任何形式，优选地为y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)等。
[0221]
在本发明的一个实施方案中，与角膜细胞(如角膜内皮细胞)混合的试剂为约
2.1nm或以上，并且待注射的所述试剂为约21nm或以上。
[0222]
用途
[0223]
另一方面，本发明提供至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂用于制备治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的药物的用途。或者在这方面，本发明提供至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂用于治疗或预防角膜内皮的疾病、障碍或病症的用途。应当理解，本发明的用途中所用的试剂(层粘连蛋白，其片段等)可以本文所解释的任何形式使用。
[0224]
本文引用的参考文献(例如科学文献、专利和专利申请)以引用的方式纳入本文，程度为与每篇文献全部被具体记载的相同程度。如本文所使用的，当使用在句子中列出的“至少一个或多个”事项时，使用“或”。当本文明确记载为“在两个值的范围内”时，这两个值本身也被包括在所述范围内。除非另有特别说明，如本文所使用的描述“约”表示四舍五入为有效数字的数值，或者对于具体值，表示该值
±
10％。
[0225]
如上所述，已对本发明进行了解释，同时提供优选的实施方案以有助于理解。在下文中，将根据实施例对本发明进行解释。但是，提供以上说明和以下实施例不是用于限制本发明，而仅仅是举例说明。因此，本发明的范围不限于本文中具体记载的实施方案和实施例，而是仅由权利要求来限定。
[0226]
实施例
[0227]
在下文中将公开本发明的实施例。当适用时，遵守厚生劳动省(ministry of health,labour and welfare)、文部科学省等规定的标准，对生物样品等进行处理。
[0228]
实验方法：培养的角膜内皮细胞的制备
[0229]
(方法)*(培养)
[0230]
兔角膜内皮细胞(rcec，细胞来源和培养方法)：对于以下实验中使用的兔角膜内皮细胞，使包含内皮细胞层的后弹性膜从角膜组织脱离并置于溶于dmem(gibco
‑
invitrogen)的1.2u/ml dispase i[(sanko pure chemical)目录号：gd81060]中，并在37℃下接种。1小时后，通过移液使角膜内皮细胞从后弹性膜上脱离并回收，并以1000rpm离心5分钟以除去上清液。加入培养基并与沉淀的角膜内皮细胞混合。将其总量接种到包被有fnc coating mix的6孔板上。使用的培养基是补充有10％fbs，50μg/ml庆大霉素(目录号：15710
‑
064；invitrogen)，10μg/ml y
‑
27632(目录号：6880005，calbiochem，la jolla，ca)和2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(目录号：13256
‑
029；bfgf；invitrogen)的dmem(目录号：12320；gibco
‑
invitrogen)。与猴一样，将以前报告的系(line)[koizumi n et al.，exp eye res.，2012；95：60
‑
67；koizumi n et al.，invest ophthalmol vis sci.2007；48：4519
‑
4526；okumura n et al.，am j pathol.2012；181:268
‑
277]用于培养兔角膜内皮细胞(cec)。
[0231]
培养基每两天换一次。传代培养是在50
‑
80％汇合时进行。传代培养方法包括用无ca
2
mg
2
的pbs(pbs
‑
；nissui pharmaceutical co.，ltd.，tokyo.japan)冲洗细胞，加入tryple
tm select(目录号：12563；invitrogen)，并在37℃下孵育5分钟。在使细胞从板上脱离并收集，且以1000rpm离心5分钟后，加入培养基以产生细胞悬液。将细胞以1：2的密度接种到包被有fnc coating mix的板上。
[0232]
这被用作培养的角膜内皮细胞。
[0233]
统计分析
[0234]
使用学生t检验确定用于比较两个样品时平均值中的统计学显著差异(p值)。使用dunnett’s多重比较检验来分析比较多个样品组时的统计学显著差异。图表中所示的值代表平均值
±
se。
[0235]
实施例1：使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植实验
[0236]
在本实施例中，使用层粘连蛋白511
‑
e8片段作为层粘连蛋白，并且使用兔大疱性角膜病变模型作为病理模型，进行培养的角膜内皮移植。
[0237]
材料和方法
[0238]
使用的试剂等
[0239]
在本实施例中使用以下试剂等。
[0240]
*培养的兔角膜内皮细胞(也简称为rcec；如上文所公开的制备)
[0241]
*层粘连蛋白511e8片段(nippi.inc.,382
‑
02413)
[0242]
*兔大疱性角膜病变模型(如以下“移植方法”中所述制备)
[0243]
*实验方法中提及的其他
[0244]
移植方法
[0245]
图1所示的实验如下进行。
[0246]
使用20号(gauge)硅酮针(soft tapered needle；inami&co.，ltd.，tokyo，japan)使兔角膜内皮机械脱离，以制备大疱性角膜病变模型。对照组为未注射细胞的制备的模型。对于rcec组，将培养的兔角膜内皮细胞注射到制备的模型的前房内并保持面朝下的姿势持续3个小时。对于rcec e8组，将培养的兔角膜内皮细胞与含有调节至浓度为2.1nm的层粘连蛋白511
‑
e8片段的dmem一起注射到制备的模型的前房内，并保持面朝下的姿势持续3个小时。
[0247]
角膜厚度的测量
[0248]
图2所示的测定实验是按照以下进行。
[0249]
用超声波厚度计(sp
‑
2000；tomey，nagoya，japan)依次测量图1中制备的个体的角膜厚度。当无法测量时，使用可测量的上限值1200μm。
[0250]
组织学检查
[0251]
图3的组织学检查是按照以下进行。该检查是通过使用na

/k

‑
atp酶和zo
‑
1进行的免疫染色来确认正常的功能。这是用于检查角膜内皮细胞的功能，即泵功能和屏障功能。na

/k

‑
atp酶和zo
‑
1分别表示作为角膜内皮细胞的功能的正常性，即泵功能和屏障功能。方法如下。
[0252]
细胞观察法(组织学检查)如染色
[0253]
用相差显微镜观察细胞。固定细胞后，使用zo
‑
1和na

/k

‑
atp酶作为功能相关的标记物，并进行免疫染色以用荧光显微镜进行观察。为了组织染色检查，将从兔中提取的角膜组织在室温(rt)下用4％甲醛固定10分钟，然后用1％牛血清白蛋白(bsa)孵育30分钟。为了找到再生的角膜内皮组织的表型，对粘附结合相关蛋白zo
‑
1和泵功能相关蛋白na

/k

‑
atp酶进行免疫组织化学分析。zo
‑
1和na

/k

‑
atp酶被用作细胞功能相关的标记物。将zo
‑
1和na

/k

‑
atp酶使用1:200稀释度的zo
‑
1多克隆抗体(zymed laboratories，inc.，south san francisco，ca)和na

/k

‑
atp酶单克隆抗体(upstate biotec，inc.,lake placid，ny)进行
染色。使用1:2000稀释度的alexa488标记(life technologies corp.，carlsbad，ca)作为二级抗体。然后用dapi(vector laboratories，inc.，burlingame，ca)对细胞核进行染色。细胞形态用1:400稀释度的alexa488缀合的鬼笔环肽(life technologies corp.，carlsbad，ca)进一步染色。然后在荧光显微镜(tcs sp2 aobs；leica microsystems，welzlar，germany)下观察载玻片。
[0254]
结果
[0255]
结果示于图1至图3中。图1示出了使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植后的眼前段图像。示出了的眼前段图像，从左起，对照：机械刮除兔角膜内皮细胞作为对照；rcec：在制备的模型中，将培养的兔角膜内皮细胞注射到前房内并保持面朝下的姿势持续3个小时；rcec e8：在制备的模型中，将培养的兔角膜内皮细胞与含有调节至浓度为2.1nm的层粘连蛋白511
‑
e8片段的dmem一起注射到前房内，并保持面朝下的姿势持续3个小时。上行表示一周后的图像，下行表示2周后的图像。对照组和rcec组中角膜混浊，而rcec e8组角膜透明且被治愈，表明当注射细胞和层粘连蛋白时角膜透明且被治愈。
[0256]
[图2]图2示出了使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜移植后角膜厚度的变化。如图所示，给药后角膜厚度开始显著降低。当用超声波厚度计测量角膜厚度时，在对照组和rcec组中，角膜被保持在约1200μm或以上(测量极限)的厚度状态，但在rcec e8组中，角膜厚度在第7天变薄至平均637μm。这可理解为由于细胞与层粘连蛋白的移植，再生了角膜内皮以及泵功能和屏障功能。
[0257]
[图3]图3示出了使用层粘连蛋白511
‑
e8片段的培养的角膜内皮移植后的组织学检查结果。如图所示，表达了在正常角膜内皮细胞中表达的基因产物。具体地，表达了指示泵功能的na

/k

‑
atp酶和指示紧密连接(屏障功能)的zo
‑
1。此外，证明了指示粘附连接的n
‑
钙粘蛋白是正常表达的。通过鬼笔环肽染色还证明了，细胞具有单层多角形形态，这与正常细胞相同。鉴于上述情况，已揭示了，细胞恢复正常功能。
[0258]
鉴于所述结果，应当理解，层粘连蛋白或其片段与角膜内皮细胞的给药，可以显著地治愈角膜内皮的疾病或障碍并恢复正常功能。
[0259]
实施例2：同时使用层粘连蛋白和rock抑制剂的兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植实验
[0260]
以前，已报告了通过将培养的角膜内皮细胞与rock抑制剂注射到前房内可以促进对基质的细胞粘附。在这方面，检查了同时使用层粘连蛋白和rock抑制剂的作用。
[0261]
材料和方法
[0262]
使用的试剂等
[0263]
在本实施例中使用以下试剂等。
[0264]
*培养的兔角膜内皮细胞(rcec；如上文所公开的制备)
[0265]
*层粘连蛋白511e8片段(与实施例1中的相同；nippi inc.，382
‑
02413)
[0266]
*y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)(目录号：6880005，calbiochem，la jolla，ca)
[0267]
*兔大疱性角膜病变模型(与实施例1中的相同；制备方法记载于“移植方法”中)
[0268]
*实验方法中提及的其他
[0269]
移植方法
[0270]
图4所示的实验如以下进行。
[0271]
将兔角膜内皮机械脱离以制备大疱性角膜病变模型。对将培养的兔角膜内皮细胞与rock抑制剂y
‑
27632( )(100μm)一起注射到前房内的个体以及将细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)一起注入的个体，比较24小时后所注射的细胞对基质的粘附。24小时后使兔子安乐死。提取角膜组织，进行鬼笔环肽染色，以评价粘附的细胞的形态和细胞数。
[0272]
图5至图8所示的测量实验如以下所述进行。
[0273]
移植方法
[0274]
以4组(每组4只兔子)进行测试，即角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离后，将培养的角膜内皮细胞与y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组；角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离后，将所述细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组；后弹性膜脱离的大疱性角膜病变模型中将细胞与y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组；后弹性膜脱离的大疱性角膜病变模型中将细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组。
[0275]
角膜厚度和眼压的测量
[0276]
用超声波厚度计(sp
‑
2000；tomey，nagoya，japan)测量角膜厚度。当无法测量时，使用可测量的上限值1200μm。此外，用tonovet(m.e.technica，tokyo)测量眼压。
[0277]
组织学检查
[0278]
以与实施例1相同的方式进行图8所示的组织学检查。
[0279]
结果
[0280]
图4示出了同时使用层粘连蛋白和rock抑制剂的兔大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植24小时后对基质的细胞粘附的结果。鬼笔环肽染色证明了，在注射细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的个体中，更多的细胞粘附。在注射细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)的个体中，粘附的细胞的密度也较高(在不存在层粘连蛋白时平均为717.3个细胞/mm2，其在存在层粘连蛋白时增加至1662.8个细胞/mm2)。这应当理解为，同时使用层粘连蛋白与rock抑制剂时，层粘连蛋白进一步促进活体中的细胞粘附。
[0281]
图5以下4组的眼前段图像，从左起，角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离后，将培养的角膜内皮细胞与y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组；角膜内皮细胞已脱离而后弹性膜未脱离后，将细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组；后弹性膜脱离的大疱性角膜病变模型中将细胞与y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组；后弹性膜脱离的大疱性角膜病变模型中将细胞与层粘连蛋白511
‑
e8片段(2.1nm)和y
‑
27632( )(100μm)一起注射的组。注射细胞一周后，与后弹性膜脱离与否、是否使用层粘连蛋白无关，角膜透明化。
[0282]
图6和图7分别为示出了角膜厚度和眼压的图。与后弹性膜未脱离的情况相比，后弹性膜脱离时角膜厚度的变薄被延迟，但是最终在两种情况下角膜厚度均变薄。整个观察期间眼压均在正常范围内。
[0283]
图8示出了使用层粘连蛋白511
‑
e8片段d的培养的角膜内皮移植后的组织学检查。
如图所示，已证明，在所有组中，表达了na

/k

‑
atp酶(泵功能)和zo
‑
1(屏障功能)，且也正常地表达了n
‑
钙粘蛋白。添加层粘连蛋白511
‑
e8片段的组中，鬼笔环肽染色证明了细胞具有与正常组织相同的正常的单层多角形形态。此外，在添加层粘连蛋白511
‑
e8片段的组中，泵功能和紧密连接均正常地表达，粘附连接也正常的表现出正常的形态。因此，以揭示了，添加层粘连蛋白511
‑
e8片段的组中的细胞恢复正常功能。
[0284]
鉴于所述结果，应当理解，将层粘连蛋白或其片段与rock抑制剂一起使用，并且与角膜内皮细胞一起给予，以显著地治愈角膜内皮的疾病或障碍，并进一步改善恢复正常功能的功能。
[0285]
实施例3：猴大疱性角膜病变模型中的实例
[0286]
接下来，使用猴大疱性角膜病变模型作为灵长类动物的实例，以类似地检查同时使用层粘连蛋白、rock抑制剂和角膜内皮细胞移植的作用。
[0287]
材料和方法
[0288]
使用的试剂等
[0289]
在本实施例中使用以下试剂等。
[0290]
*培养的猴角膜内皮细胞(以与兔的培养方法相同的方式制备，以下再次说明)
[0291]
*层粘连蛋白511e8片段(与实施例1相同；nippi.inc.，382
‑
02413)
[0292]
*y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)(与实施例2相同；目录号：6880005，calbiochem，la jolla，ca)
[0293]
*猴大疱性角膜病变模型(如以下“移植方法”中所述制备)
[0294]
培养方法
[0295]
可以如下获得并培养猴角膜内皮细胞(mcec)。具体地，使包含内皮细胞层的后弹性膜从角膜组织脱离并置于溶于dmem(gibco
‑
invitrogen)的1.2u/ml dispase i[(sanko pure chemical)目录号：gd81060]中，并在37℃下接种。1小时后，通过移液使角膜内皮细胞从后弹性膜脱离并回收，并以1000rpm离心5分钟以除去上清液。加入培养基并与沉淀的角膜内皮细胞混合。将其总量接种到包被有fnc coating mix的6孔板上。使用的培养基是补充有10％fbs，50μg/ml庆大霉素(目录号：15710
‑
064；invitrogen)，10μg/ml y
‑
27632(目录号：6880005，calbiochem，la jolla，ca)和2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(目录号：13256
‑
029；bfgf；invitrogen)的dmem(目录号：12320；gibco
‑
invitrogen)。与猴一样，将以前报告的系(line)[koizumi n et al.，exp eye res.，2012；95：60
‑
67；koizumi n et al.，invest ophthalmol vis sci.2007；48：4519
‑
4526；okumura n et al.，am j pathol.2012；181:268
‑
277]用于培养兔角膜内皮细胞(cec)。
[0296]
培养基每两天换一次。传代培养是在50
‑
80％汇合时进行。传代培养方法包括用无ca
2
mg
2
的pbs(pbs
‑
；nissui pharmaceutical co.，ltd.，tokyo.japan)冲洗细胞，加入tryple
tm select(目录号：12563；invitrogen)，并在37℃下孵育5分钟。在使细胞从板上脱离并收集，且以1000rpm离心5分钟后，加入培养基以产生细胞悬液。将细胞以1：2的密度接种到包被有fnc coating mix的板上。
[0297]
移植方法
[0298]
使用20号硅酮针(soft tapered needle；inami&co.，ltd.，tokyo，japan)使食蟹猴角膜内皮机械脱离，以制备大疱性角膜病变模型。在图9中，将5.0
×
105个培养的猴角膜
内皮细胞与含有调节至浓度为2.1nm的层粘连蛋白511
‑
e8片段的dmem一起注射到大疱性角膜病变模型的前房内，并保持面朝下的姿势持续3个小时。在图10中，在制备的大疱性角膜病模型中使后弹性膜脱离，并且类似地，将5.0
×
105个培养的猴角膜内皮细胞与含有调节至浓度为2.1nm的层粘连蛋白511
‑
e8片段的dmem一起注射到该大疱性角膜病变模型的前房内，并保持面朝下的姿势持续3个小时。
[0299]
角膜厚度的测量
[0300]
用超声波厚度计(sp
‑
2000；tomey，nagoya，japan)测量角膜厚度。当无法测量时，使用可测量的上限值1200μm。
[0301]
结果
[0302]
结果示于图9至10中。图9示出了同时使用层粘连蛋白511
‑
e8片段处理的猴大疱性角膜病变模型中培养的角膜内皮移植后的眼前段图像。已发现，在活体内的角膜内皮生长受到显著限制的灵长类模型中，本发明的层粘连蛋白或其片段可以通过与角膜内皮细胞和rock抑制剂一起给药而治愈大疱性角膜病变。另一方面，图10示出了在猴大疱性角膜病模型中，在使后弹性膜脱离并且同时使用层粘连蛋白511
‑
e8片段移植培养的角膜内皮细胞后的眼前段图像。在机械刮除食蟹猴角膜内皮细胞的模型中，角膜不透明或未被治愈。虽然在兔大疱性角膜病变模型中角膜透明并被治愈，但在食蟹猴模型中没有观察到治疗效果。这表明后弹性膜脱离时，由于移植的细胞对角膜的粘附降低，根据动物物种的不同存在角膜内皮不会再生的可能性。图11在图中示出了后弹性膜未脱离而进行移植的个体的角膜厚度变化以及后弹性膜脱离而进行移植的个体的角膜厚度变化。后弹性膜脱离组中，角膜厚度并未变薄，而后弹性膜未脱离组中，角膜厚度变薄。
[0303]
实施例4：后弹性膜脱离的受试者中具有层粘连蛋白包被的治疗的实例
[0304]
接下来，通过单独地用层粘连蛋白包被因后弹性膜脱离而暴露的角膜里侧的基质，确认了同时使用层粘连蛋白、rock抑制剂和角膜内皮细胞移植的效果的提高。
[0305]
材料和方法
[0306]
使用的试剂等
[0307]
在本实施例中使用以下试剂等。
[0308]
*培养的猴角膜内皮细胞(以与实施例3相同的方式制备)
[0309]
*层粘连蛋白511
‑
e8片段(与实施例1相同；nippi.inc.，382
‑
02413)
[0310]
*y
‑
27632((r)
‑
( )
‑
反式
‑
(4
‑
吡啶基)
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物)(与实施例2相同；目录号：6880005，calbiochem，la jolla，ca)
[0311]
方法
[0312]
使用20号硅酮针(soft tapered needle；inami&co.，ltd.，tokyo，japan)使食蟹猴角膜内皮机械脱离，以制备大疱性角膜病变模型。在制备的大疱性角膜病变模型中，后弹性膜脱离。将层粘连蛋白511
‑
e8片段以21nm的浓度注射到大疱性角膜病变模型的前房内，并将该模型放置1小时。由此，在活体内包被由于后弹性膜脱离而暴露的角膜基质。然后如实施例3一样，将5.0
×
105个培养的猴角膜内皮细胞与含有调节至浓度为2.1nm的层粘连蛋白511
‑
e8片段的dmem一起注射到大疱性角膜病变模型的前房内，并保持面朝下的姿势持续3个小时。
[0313]
结果
[0314]
结果如图12所示。如图12所示，在后弹性膜脱离后，将层粘连蛋白511
‑
e8片段以21nm的浓度注射到前房内，以包被角膜基质，导致角膜透明并被治愈，而这种效果在没有包被时无法获得(图10)。这证明了，注射层粘连蛋白与细胞悬液，不仅可以促进细胞粘附，而且可以通过在活体内用作包被试剂而促进细胞在活体内的移植物植入。
[0315]
实施例5：整联蛋白对角膜内皮细胞粘附的作用
[0316]
在本实施例中，检测了各种整联蛋白对角膜内皮细胞粘附的作用。
[0317]
材料和方法
[0318]
使用的试剂等
[0319]
在本实施例中使用以下试剂等。
[0320]
*对照是指不添加层粘连蛋白511
‑
e8片段的组。
[0321]
*小鼠igg(dako，x0931)
[0322]
*抗整联蛋白α3(millipore，mab1952z
‑
20)
[0323]
*抗整联蛋白α6(millipore，mab1378
‑
20)
[0324]
*抗整联蛋白α2(millipore，mab1950z
‑
20)
[0325]
*抗整联蛋白β1(r&d systems，mab17781)
[0326]
*对于抗整联蛋白α3β1和抗整联蛋白α6β1，使用上述的组合。
[0327]
*层粘连蛋白511
‑
e8片段(与上述实施例相同)
[0328]
方法
[0329]
将培养基从培养人角膜内皮细胞的培养皿中完全除去。用pbs(
‑
)冲洗细胞两次。冲洗后，加入磷酸盐缓冲液，混合物在37℃(5％co2)下孵育5分钟。随后，除去pbs(
‑
)，加入tryple
tm select(10x)(life technologies，a12177
‑
01)。将混合物在37℃(5％co2)下孵育10分钟。然后加入opti
‑
memi(life technologies，31985
‑
070)以收集细胞。收集细胞后，将细胞以1200rpm离心3分钟，以使用opti
‑
mem i制备细胞悬液。此时，制备无层粘连蛋白511
‑
e8片段的组作为对照，以及添加层粘连蛋白511
‑
e8片段以使最终浓度为2.1nm的组。同时，将小鼠igg和整联蛋白中和抗体加入到添加层粘连蛋白511
‑
e8片段的组中，以将最终浓度调节至2μg/ml。调节后，以5000个细胞/孔将细胞接种到96孔板上，并在37℃(5％co2)下孵育24小时。接种24小时后，将培养基完全去除，将细胞用pbs(
‑
)冲洗两次。冲洗后，以1:1的比例加入培养基和celltiter
‑
glo luminescent cell viability assay(promega corporation，madison，wi)。将混合物在黑暗中振荡2分钟，然后静置10分钟。之后进行测量。24h，*p<0.01，dunnet's检验，n＝6。
[0330]
结果
[0331]
结果如图13所示。如图所示，相对于对照，在接种时将层粘连蛋白511
‑
e8片段加入到培养基中促进了角膜内皮细胞的粘附，但通过整联蛋白β1的中和抗体将细胞粘附抑制到与对照相同的水平。
[0332]
实施例6：细胞粘附相关蛋白的激活与整联蛋白之间的关系
[0333]
接下来，该实施例证明细胞粘附相关蛋白的激活是由整联蛋白介导。
[0334]
材料和方法
[0335]
试剂等
[0336]
原则上，使用与实施例5相同的条件。
[0337]
*小鼠igg(与实施例5相同)
[0338]
*抗整联蛋白α3(与实施例5相同)
[0339]
*抗整联蛋白α6(与实施例5相同)
[0340]
*抗整联蛋白α2(与实施例5相同)
[0341]
*抗整联蛋白β1(与实施例5同样)
[0342]
*抗整联蛋白α3β1(与实施例5相同)
[0343]
*抗整联蛋白α6β1(与实施例5相同)
[0344]
方法
[0345]
将培养基从培养人角膜内皮细胞的培养皿中完全除去。用pbs(
‑
)冲洗细胞两次。冲洗后，加入磷酸盐缓冲液，混合物在37℃(5％co2)下孵育5分钟。随后，除去pbs(
‑
)，并加入tryple
tm
select(10x)(life technologies，a12177
‑
01)。将混合物在37℃(5％co2)下孵育10分钟。然后加入opti
‑
memi(life technologies，31985
‑
070)以收集细胞。收集细胞后，将细胞以1200rpm离心3分钟，以使用opti
‑
mem i制备细胞悬液。此时，制备无层粘连蛋白511
‑
e8片段的组作为对照，以及添加层粘连蛋白511
‑
e8片段以使最终浓度为2.1nm的组。同时，将小鼠igg和整联蛋白中和抗体加入到添加层粘连蛋白511
‑
e8片段的组中，以将最终浓度调节至2μg/ml。调节后，以1
×
105个细胞/孔将细胞接种到12孔板上，并在接种3小时后收集蛋白质。使用蛋白质印迹法检测phospho
‑
fak(cell signaling technology，8556s)、fak(cell signaling technology，3285s)和p
‑
桩蛋白(cell signaling technology，2541s)。每种抗体的稀释率为1:1000。密度测定是使用image j进行定量。
[0346]
结果
[0347]
结果如图14所示。如图所示，在接种3小时后，p
‑
fak被层粘连蛋白511
‑
e8片段所促进，但被整联蛋白β1的中和抗体抑制到与对照组相同的水平。p
‑
桩蛋白也被层粘连蛋白511
‑
e8片段所促进，但被整联蛋白β1的中和抗体抑制到与对照组相同的水平。鉴于上述结果，应当理解，e8通过经由整联蛋白激活粘附相关蛋白从而促进细胞粘附。
[0348]
考虑到实施例5和6，通过添加层粘连蛋白511
‑
e8片段，观察到与无片段的细胞相比较早的细胞粘附。24小时后粘附细胞的数目显著增加至137.3
±
2.8％(p<0.01)。此外，整联蛋白α3β1和α6β1的中和抗体抑制层粘连蛋白511
‑
e8片段的细胞粘附作用，使得作用水平与无层粘连蛋白511
‑
e8片段的细胞相同(p<0.01)。fak的磷酸化被层粘连蛋白511
‑
e8片段所促进，但被整联蛋白中和抗体所抑制。因此，应当理解，层粘连蛋白511结合整联蛋白并促进fak的磷酸化，以促进角膜内皮细胞的基质粘附。因此，应当理解，层粘连蛋白(如层粘连蛋白511
‑
e8片段)可用于角膜内皮细胞移植。
[0349]
实施例7：制剂实例：层粘连蛋白
‑
细胞混合制剂
[0350]
在本实施例中，如下所述制备含有本发明的试剂的治疗溶液作为制剂实例。
[0351]
通过常规方法制备以下溶液。
[0352]
层粘连蛋白511、层粘连蛋白521和/或其片段(0.75μg/cm2)
[0353]
最终浓度为2.1nm
[0354]
培养的角膜内皮细胞
[0355]
根据实施例1等制备的适量的细胞
[0356]
合适的缓冲液
[0357]
适量
[0358]
总量
[0359]
100ml
[0360]
实施例8：制剂实例：层粘连蛋白包被组合物
[0361]
在本实施例中，如下所述制备含有本发明的试剂的包被溶液作为制剂实例。
[0362]
通过常规方法如下所示制备包被溶液。
[0363]
层粘连蛋白511、层粘连蛋白521和/或其片段(0.75μg/cm2)
[0364]
最终浓度为21nm
[0365]
合适的缓冲液
[0366]
适量
[0367]
总量
[0368]
100ml
[0369]
每种组分可以如实施例1至4中所述获得。
[0370]
如上所述，已经使用本发明的优选实施方案对本发明进行了举例说明。然而，应当理解，本发明的范围仅应由权利要求的范围来解释。应当理解，本文引用的专利、专利申请和文献以引用的方式纳入本文，如同所述内容具体记载于本文中的方式一样。本技术要求2014年10月31日提交的日本专利申请2142
‑
222947的优先权，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
[0371]
工业实用性
[0372]
本发明使新的眼科治疗、尤其是新的角膜内皮细胞(尤其是人角膜内皮细胞)治疗成为可能。特别地，本发明可使大疱性角膜病变接近完全恢复，使得本发明在制药工业中特别有用。
[0373]
序列表独立文本
[0374]
seq id no：1：层粘连蛋白α5链核酸序列(nm_005560)
[0375]
seq id no：2：层粘连蛋白α5链氨基酸序列(np_005551)
[0376]
seq id no：3：层粘连蛋白β1链核酸序列(nm_002291)
[0377]
seq id no：4：层粘连蛋白β1链氨基酸序列(np_002282)
[0378]
seq id no：5：层粘连蛋白β2链核酸序列(nm_002292)
[0379]
seq id no：6：层粘连蛋白β2链氨基酸序列(np_002283)
[0380]
seq id no：7：层粘连蛋白γ1链核酸序列(nm_002293)
[0381]
seq id no：8：层粘连蛋白γ1链氨基酸序列(np_002284)