鸡白细胞介素17B重组乳酸菌免疫制剂的制备和应用的制作方法

鸡白细胞介素17b重组乳酸菌免疫制剂的制备和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡白细胞介素17b重组乳酸菌免疫制剂的制备和应用。


背景技术：

2.畜禽集约化养殖厂是市场上畜产品的主要来源。随着全球人口增长，对畜禽产品的需求也在逐年增加。全球范围内每年鸡肉的消耗量占所有肉类产品的40％左右，直接经济效益高达数千亿美元。
3.鸡通常在有利于机会性病原体感染的密集环境下饲养。家禽养殖业面临的主要问题是由于疾病导致的生产力下降，必须利用大量资源来维持动物的健康状况。疫苗和抗菌素(特别是抗生素)主要用于控制疾病。传统的灭活疫苗和减毒活疫苗对某些病原菌的灭活效果不够，包括传统的ibv疫苗由于其变异性等。因此，dna疫苗、rna疫苗、多表位疫苗等新型疫苗成为疫苗研究的热点。
4.然而，传统的佐剂并不能显著增强这些新型疫苗的体液免疫和细胞免疫。目前市场上许可的兽用疫苗佐剂最常见的是铝胶佐剂和油乳佐剂。由于氢氧化铝(铝)佐剂的安全性，它们已普遍用于许多兽医和人类疫苗中；但铝胶佐剂几乎不能诱导细胞介导的免疫，特别是细胞毒性t细胞反应，这对于将其用于抗细胞内寄生虫和某些病毒的疫苗而言是一个重大缺陷；此外，铝胶佐剂具有诱导ige介导的免疫反应的趋势，并可能促进ige介导的过敏反应。油乳佐剂的使用受其产生的副作用和不良反应的限制；例如，油乳佐剂cfa会引起注射部位的炎症、溃疡以及发烧和过敏反应。禽肉外观质量对家禽养殖业来说非常重要，铝胶佐剂和油乳佐剂引起的免疫鸡只疫苗注射点的这些不良反应会影响肉的外观品质，也会导致动物不适，不利于动物福利。所以家禽疫苗产业需要有效的佐剂要满足既不会给家禽带来痛苦，也不会导致禽肉品质降低的需求。而且，抗生素在畜禽养殖中的滥用对环境和人类的生存构成了极大的威胁。在中国，政府从2020年1月1日起禁止在饲料中添加抗生素。因此，迫切需要寻找添加剂或治疗药物来代替抗生素用于畜禽养殖。细胞因子(ck)是免疫细胞和一些非免疫细胞合成和分泌的一种低分子量可溶性蛋白。细胞因子与特异性受体结合后，可激活细胞因子网络的基因表达，调节免疫功能。因此，细胞因子被认为是高效的并且仅存在很少的副作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种鸡白细胞介素17b重组乳酸菌免疫制剂的制备和应用。
6.本发明提供了特异蛋白的应用，为如下(a1)或(a2)：
7.(a1)制备免疫促进剂；
8.(a2)作为免疫促进剂；
9.所述特异蛋白为如下(b1)或(b2)或(b3)：
10.(b1)序列表的序列1中第28至199位氨基酸残基组成的蛋白质；
11.(b2)序列表的序列1中第1至199位氨基酸残基组成的蛋白质；
12.(b3)序列表的序列1所示的蛋白质。
13.本发明还提供了特异重组菌的应用，为如下(a1)或(a2)：
14.(a1)制备免疫促进剂；
15.(a2)作为免疫促进剂；
16.所述特异重组菌为表达所述的特异蛋白的重组菌。
17.所述特异重组菌是将特异dna分子或具有所述特异dna分子的重组质粒导入出发菌得到的；所述特异dna分子为表达所述的特异蛋白的dna分子。
18.所述出发菌具体可为植物乳杆菌。
19.所述出发菌具体可为植物乳杆菌nc8。
20.所述特异重组菌具体可为将重组质粒pmg36e
‑
rchil17b导入植物乳杆菌nc8，得到重组植物乳杆菌，命名为重组菌nc8
‑
chil17b。将pmg36e载体中salⅰ和sphⅰ酶切识别序列中的小片段取代为序列表的序列2所示的双链dna分子，得到重组质粒pmg36e
‑
rchil17b。
21.所述特异重组菌的发酵产物或所述特异重组菌的菌体总蛋白的应用，为如下(a1)或(a2)：
22.(a1)制备免疫促进剂；
23.(a2)作为免疫促进剂。
24.本发明还提供了疫苗和免疫促进剂在制备产品中的应用；
25.所述免疫促进剂为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
26.(c1)所述特异蛋白；
27.(c2)所述特异重组菌；
28.(c3)所述特异重组菌的发酵产物；
29.(c4)所述特异重组菌的菌体总蛋白。
30.具体的，所述疫苗可为ibv h120疫苗。
31.所述产品的功能为预防和/或治疗鸡传染性支气管炎。
32.本发明还保护特异蛋白，为如下(b1)或(b2)或(b3)：
33.(b1)序列表的序列1中第28至199位氨基酸残基组成的蛋白质；
34.(b2)序列表的序列1中第1至199位氨基酸残基组成的蛋白质；
35.(b3)序列表的序列1所示的蛋白质。
36.本发明还保护特异dna分子、含有所述特异dna分子的表达盒、含有所述特异dna分子的重组载体或含有所述特异dna分子的重组微生物；所述特异dna分子为编码所述特异蛋白的dna分子。
37.所述特异dna分子具体可为序列表的序列2所示的dna分子。
38.所述重组载体具体可为将pmg36e载体中salⅰ和sphⅰ酶切识别序列中的小片段取代为序列表的序列2所示的双链dna分子，得到重组质粒pmg36e
‑
rchil17b。
39.所述重组微生物是将所述特异dna分子或具有所述特异dna分子的重组质粒导入出发微生物得到的。
40.所述出发微生物具体可为植物乳杆菌。
41.所述出发微生物具体可为植物乳杆菌nc8。
42.所述重组微生物具体可为将重组质粒pmg36e
‑
rchil17b导入植物乳杆菌nc8，得到重组植物乳杆菌，命名为重组菌nc8
‑
chil17b。
43.本发明还保护所述重组微生物的发酵产物。
44.本发明还保护所述重组微生物的总蛋白。
45.本发明还保护产品甲。所述产品甲中含有所述特异蛋白、所述特异dna分子、所述表达盒、所述重组载体、所述重组微生物、所述重组微生物的发酵产物或所述重组微生物的总蛋白。所述产品为免疫促进剂。
46.本发明还保护产品乙。所述产品乙中含有疫苗和免疫促进剂；所述免疫促进剂为所述特异蛋白、所述特异dna分子、所述表达盒、所述重组载体、所述重组微生物、所述重组微生物的发酵产物或所述重组微生物的总蛋白。具体的，所述疫苗可为ibv h120疫苗。所述产品的功能为预防和/或治疗鸡传染性支气管炎。
47.所述免疫促进剂的用途具体为提高动物免疫能力。所述动物非人动物或人。
48.所述免疫促进剂的用途具体为促进免疫相关基因的表达。所述免疫相关基因可为如下基因的任意一种或组合：nf
‑
κb、myd88、socs
‑
1、stat1、il
‑
1β、il
‑
12p40、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
10、inf
‑
α、ifn
‑
β、tgf
‑
β4、ccl
‑
3、ccl
‑
20和litaf。
49.所述提高动物免疫能力为下述m1
‑
m5中的至少一种：
50.m1、抑制致病微生物的生长；
51.m2、促进免疫细胞的增加；
52.m3、促进疫苗诱导的免疫应答；
53.m4、促进细胞免疫和/或体液免疫；
54.m5、提高动物发育和生长增重。
55.所述致病微生物具体为鸡传染性支气管炎病毒。
56.所述动物具体可为禽类，例如鸡。
57.本发明提供的融合蛋白rchil17b分子及表达rchil17b基因的重组菌的发酵产物具有以下作用：促进动物淋巴细胞增殖，施用rchil17b的动物体内淋巴细胞含量可提高10％以上；明显抑制致病微生物的生长，施用rchil17b的致病微生物的量可降低达20％以上；促进特异性抗体(igg、iga)和非特异性siga的分泌，施用rchil17b的动物体内特异性抗体和疾病特异抗体的含量可提高40％
‑
60％；促进免疫相关基因的表达，进而提高动物的免疫抗感染能力，施用rchil17b的动物攻毒存活率明显提高至少60％，生长增重率10％以上。实验证明，本发明的rchil17b可以促进淋巴细胞增殖，抑制致病微生物的生长，促进特异性抗体分泌，促进黏膜抗体分泌，提高动物的免疫能力与存活率。
附图说明
58.图1为重组质粒pmg36e
‑
rchil17b的结构示意图。
59.图2为实施例1中mrna水平检测的电泳图。
60.图3为实施例1中蛋白水平检测的电泳图。
61.图4为实施例2中荧光定量pcr的结果。
62.图5为实施例3的步骤一的结果。
63.图6为实施例4的体液免疫指标检测结果(采用ibv特异性抗体elisa检测试剂盒检
测)。
64.图7为实施例4的体液免疫指标检测结果(采用鸡源细胞因子il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6和ifn
‑
γ对应的elisa试剂盒检测)。
65.图8为实施例4的黏膜免疫指标检测结果。
66.图9为实施例4的细胞免疫指标检测结果(外周血淋巴细胞中cd4 t细胞和cd8 t细胞的变化)。
67.图10为实施例4的细胞免疫指标检测结果(免疫相关基因的表达变化)。
68.图11为实施例4的攻毒保护试验的结果。
具体实施方式
69.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
70.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
71.rchil17b浓度(蛋白浓度)采用his标签elisa试剂盒(his tag elisa detection kit，南京金斯瑞生物科技有限公司，cat.no.:l00436)检测。pmg36e载体：biovector公司，货号为biovectorpmg36e。hd11细胞(鸡巨噬细胞)：上海泽叶生物科技有限公司。df
‑
1细胞(鸡成纤维细胞)：武汉普诺塞生命科技有限公司。
72.dmem生长液：含10％56℃灭活补体的胎牛血清和0.1％青链双抗的dmem基础培养基。维持液：含2％56℃灭活补体的胎牛血清和0.1％青链双抗的dmem基础培养基。
73.植物乳杆菌nc8，记载于如下文献：比较滴鼻与口服植物乳杆菌nc8对雏鸡t淋巴细胞的影响；刘玉颖，杨文涛，赵亮，杨桂连，王春凤；中国兽医杂志2017年(第53卷)第1期。
74.鸡传染性支气管炎病毒b株(ibv b株)(ibv beaudette strain)，记载于如下文献：infectious bronchitis virus infection induces apoptosis during replication in chicken macrophage hd11 cells；xiaoxiao han,yiming tian,ru guan,wenqian gao,xin yang,long zhou,hongning wang*.[j].viruses,2017,9(8):198。
[0075]
鸡传染性支气管炎病毒m41株(ibv m41株)，记载于如下文献：禽传染性支气管炎病毒m41株反向遗传株的构建；李然、许记刚、吴暄、姬高升、杨鑫、王红宁；基础科学，中国畜牧兽医文摘，2015年，31卷，第5期。
[0076]
荧光定量pcr检测基因的表达量时，动物试验采用的内参基因为β
‑
actin，细胞实试验采用的内参基因为gapdh。
[0077]
表1实时定量pcr的引物序列
[0078]
[0079][0080]
实施例1、制备重组菌
[0081]
一、融合蛋白rchil17b及其编码基因的设计
[0082]
鸡白细胞介素17b，添加信号肽和his6标签，命名为融合蛋白rchil17b。融合蛋白rchil17b如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第1
‑
27位氨基酸残基组成信号肽，第28
‑
199位氨基酸残基组成鸡白细胞介素17b，第200
‑
205位氨基酸残基组成his6标签。
[0083]
将融合蛋白rchil17b的编码基因命名为rchil17b基因。
[0084]
序列表的序列2所示的dna分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。序列表的序列2中，第1
‑
81位编码信号肽，第82
‑
597位编码鸡白细胞介素17b，第598
‑
615位编码his6标签。
[0085]
二、重组质粒的构建
[0086]
将pmg36e载体中salⅰ和sphⅰ酶切识别序列中的小片段取代为序列表的序列2所示的双链dna分子，得到重组质粒pmg36e
‑
rchil17b。重组质粒pmg36e
‑
rchil17b已进行测序验证。重组质粒pmg36e
‑
rchil17b的结构示意图见图1。
[0087]
三、制备重组菌
[0088]
将重组质粒pmg36e
‑
rchil17b导入植物乳杆菌nc8，得到重组植物乳杆菌，命名为重组菌nc8
‑
chil17b。
[0089]
将pmg36e载体导入植物乳杆菌nc8，得到重组植物乳杆菌，命名为重组菌nc8
‑
p。
[0090]
四、mrna水平检测
[0091]
1、挑取供试菌(重组菌nc8
‑
chil17b或重组菌nc8
‑
p或植物乳杆菌nc8)单菌落接种至1ml含10μg/ml红霉素的液体mrs培养基，37℃静置培养过夜；然后以1％的接种量接种至含10μg/ml红霉素的液体mrs培养基，静置培养12h
‑
16h；然后4℃、4000g离心10min，收集菌体沉淀。
[0092]
2、mrna水平检测
[0093]
取步骤1得到的菌体，提取rna，然后反转录得到cdna；以cdna为模板，采用pe
‑
f和pe
‑
r组成的引物对进行pcr扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图2,泳道m代表marker,泳道1代表植物乳杆菌nc8,泳道2代表重组菌nc8
‑
p，泳道3代表重组菌nc8
‑
chil17b。只有泳道3显示特异性扩增条带。
[0094]
pe
‑
f：atgaaaaaaaagattatctcagc；
[0095]
pe
‑
r：ttagtggtggtggtggtgg。
[0096]
五、蛋白水平检测
[0097]
1、将活化后的供试菌(重组菌nc8
‑
chil17b或重组菌nc8
‑
p)菌液以1:100的体积比接种至含10μg/ml红霉素的液体mrs培养基，37℃、180rpm振荡培养培养24h；然后10000g离心5min，收集菌体；然后用溶菌酶处理(溶菌酶的工作浓度为1mg/ml)；然后进行超声破碎，离心收集上清液，即为总蛋白溶液。重组菌nc8
‑
chil17b得到的总蛋白溶液命名为nc8
‑
rchil17b蛋白溶液。重组菌nc8
‑
p得到的总蛋白溶液命名为nc8
‑
p蛋白溶液。
[0098]
2、取步骤1得到的总蛋白溶液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行western blot(采用的一抗为his
‑
tag mouse igg单克隆抗体)，结果见图3。nc8
‑
rchil17b蛋白溶液电泳显示约20.17kda的阳性蛋白条带，与rchil17b预测大小相符。nc8
‑
p蛋白溶液不显示所述阳性蛋白条带。
[0099]
实施例2、融合蛋白rchil17b对鸡成纤维细胞系的生物活性研究
[0100]
1、将长满t75细胞瓶的df
‑
1细胞用胰酶消化分散，然后均匀铺到6孔细胞板中(每板铺约1.0
×
106个细胞)，采用dmem生长液培养至汇合度为70％
‑
80％。
[0101]
2、完成步骤1后，每孔加入蛋白稀释液(使体系的蛋白浓度为0.5μg/ml，以蛋白稀释液提供的总蛋白计)，孵育2h后补充维持液继续培养。分别于作用48h时收获细胞(从加入蛋白稀释液开始计时)。将等体积pbs缓冲液代替蛋白稀释液，作为pbs对照组。每个时间点
的每个处理至少设置3个复孔。
[0102]
用pbs缓冲液将供试蛋白溶液稀释，得到蛋白稀释液。供试蛋白溶液为实施例1的步骤五制备的nc8
‑
rchil17b蛋白溶液或实施例1的步骤五制备的nc8
‑
p蛋白溶液。
[0103]
3、取步骤2得到的细胞，提取总rna，然后反转录得到cdna。以cdna为模板，进行荧光定量pcr，检测各个免疫相关基因的表达调控情况。检测各个基因的引物序列见表1。各基因的表达水平通过几何均数法和以下公式计算：相对mrna表达水平＝2
‑
δδct
。
[0104]
荧光定量pcr的结果见图4。图4中，pbs代表pbs对照组，nc8
‑
chil17b代表nc8
‑
rchil17b处理组，nc8代表nc8
‑
p处理组。采用graphpad prism 6(graphpad软件)对数据进行统计和单因素方差分析(anova
‑
tukey)，*p<0.05，或**p<0.01。rchil17b刺激df
‑
1细胞可使nf
‑
κb、myd88、socs
‑
1、stat1、il
‑
1β、il
‑
12p40、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
10、inf
‑
α、ifn
‑
β、tgf
‑
β4、ccl
‑
3、ccl
‑
20和litaf的表达水平明显高于pbs对照组和nc8
‑
p处理组(p<0.05或p<0.01)。
[0105]
实施例3、融合蛋白rchil17b对鸡传染性支气管炎病毒增殖的影响
[0106]
一、融合蛋白rchil17b对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡巨噬细胞系活性的影响
[0107]
1、将长满t75瓶的hd11细胞用胰酶消化分散后，均匀接种到96孔板中，每板大约1.0
×
106个细胞，采用dmem生长液培养至70％
‑
80％汇合度。
[0108]
2、用pbs缓冲液将供试蛋白溶液稀释，得到各个蛋白稀释液，使蛋白浓度分别为800ng/ml、400ng/ml或200ng/ml。供试蛋白溶液为实施例1的步骤五制备的nc8
‑
rchil17b蛋白溶液或实施例1的步骤五制备的nc8
‑
p蛋白溶液。
[0109]
3、完成步骤1后，用pbs缓冲液洗涤细胞2次，然后加入ibv b株(moi＝2)并采用dmem生长液继续培养1.5h，然后加入步骤2得到的蛋白稀释液并继续培养24h(体系中的蛋白浓度分别为200ng/ml、100ng/ml或50ng/ml，以蛋白稀释液提供的总蛋白计)。设置用等体积pbs缓冲液代替蛋白稀释液的ibv对照组。
[0110]
4、完成步骤3后，每孔加入20μl cck
‑
8溶液，继续培养0.5
‑
4小时。设置未加细胞只加cck8的空白对照孔。
[0111]
5、完成步骤4后，在酶标仪450nm波长下测定吸光度。根据od
450
值计算各孔细胞的抑制百分比，比值越低，说明细胞活性越好。细胞活性抑制百分比(％)＝(pbs对照组od
450
‑
实验组od
450
)/(pbs对照组od
450
‑
空白组od
450
)
×
100。
[0112]
每个处理至少设置3个复孔。
[0113]
结果见图5。图5中，ibv代表ibv对照组，nc8
‑
p ibv代表nc8
‑
p试验组，nc8
‑
rchil17b ibv代表nc8
‑
rchil17b试验组。与ibv对照组相比，体系中总蛋白浓度为200ng/ml(其中rchil17b浓度为220pg/ml)使得细胞活性抑制率显著降低，差异极显著(p<0.01)。随着蛋白浓度降低，细胞活性抑制率增高，说明融合蛋白rchil17b对ibv的抑制作用是呈剂量依耐性的。
[0114]
二、融合蛋白rchil17b对ibv在hd11细胞上增殖滴度的影响结果
[0115]
1、将长满t75瓶的hd11细胞用胰酶消化分散后，均匀接种到6孔板中，每板大约1.0
×
106个细胞，采用dmem生长液培养至70％
‑
80％汇合度。
[0116]
2、完成步骤1后，用pbs缓冲液洗涤细胞2次，然后加入ibv b株(moi＝2)并采用dmem生长液继续培养1.5h，然后加入蛋白稀释液并继续培养24h(体系中的蛋白浓度为200ng/ml，以蛋白稀释液提供的总蛋白计)。设置用等体积pbs缓冲液代替ibv b株的pbs对
照组。设置用等体积pbs缓冲液代替蛋白稀释液的ibv对照组。
[0117]
用pbs缓冲液将供试蛋白溶液稀释，得到蛋白稀释液。供试蛋白溶液为实施例1的步骤五制备的nc8
‑
rchil17b蛋白溶液或实施例1的步骤五制备的nc8
‑
p蛋白溶液。
[0118]
每个处理至少设置3个复孔。
[0119]
3、完成步骤2后，
‑
80℃反复冻融两次，收集冻融后的细胞和上清液，即为待测病毒液，测定tcid
50
毒价。
[0120]
测定毒价的具体方法：按10倍梯度稀释病毒液后接种长满约70％hd11细胞的96孔细胞板，每个稀释度6个重复；37℃培养，每日记录病变孔数，培养72h后，判定最终病变孔数，并用reed
‑
muench法测定tcid
50
；重复测定3次后，进行统计，统计方法为one
‑
way anova的多重比较。
[0121]
结果见表2。ibv代表ibv对照组，pbs代表pbs对照组，nc8
‑
p ibv代表nc8
‑
p试验组，nc8
‑
rchil17b ibv代表nc8
‑
rchil17b试验组。pbs对照组的tcid
50
为0；ibv对照组的tcid
50
为6.58，与nc8
‑
p ibv组相比，差异显著(p<0.05)，说明nc8
‑
p蛋白溶液可抑制ibv在hd11细胞上增殖。nc8
‑
rchil17b ibv组，体系中总蛋白浓度为200ng/ml(其中rchil17b浓度为220pg/ml)，tcid
50
值更低，与nc8 ibv组相比，差异极显著(p<0.01)，说明融合蛋白rchil17b可显著抑制ibv b株在hd11细胞上的增殖。
[0122]
表2不同处理条件下ibv在hd11细胞上的增殖滴度变化
[0123] lg tcid
50
/mlpbs0ibv6.58
±
0.11
c
nc8
‑
p ibv6.08
±
0.11
b
nc8
‑
chil17b ibv4.65
±
0.05
a
[0124]
不同的大写字母表示差异极显著，p<0.01；不同的小写字母表示差异显著，p<0.05。
[0125]
实施例4、重组菌nc8
‑
chil17b对鸡传染性支气管炎病毒疫苗的免疫调节效应
[0126]
一、nc8
‑
chil17b菌液的制备
[0127]
将活化后的重组菌nc8
‑
chil17b接种至50ml液体mrs培养基中，37℃静置培养24h，然后4000g离心10min，收集菌体；取菌体，用冷的无菌pbs缓冲液洗涤2次，然后用冷的无菌pbs缓冲液重悬，使菌浓度为5
×
109cfu/ml，得到nc8
‑
chil17b菌液，冰上保存备用。
[0128]
二、nc8
‑
p菌液的制备
[0129]
将活化后的重组菌nc8
‑
p接种至50ml液体mrs培养基中，37℃静置培养24h，然后4000g离心10min，收集菌体；取菌体，用冷的无菌pbs缓冲液洗涤2次，然后用冷的无菌pbs缓冲液重悬，使菌浓度为5
×
109cfu/ml，得到nc8
‑
p菌液，冰上保存备用。
[0130]
三、spf鸡分组及免疫
[0131]
spf雏鸡为购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司的spf白来航鸡胚孵化获得。将spf雏鸡转移至spf隔离器进行饲喂和免疫。ibv疫苗全称为ibv h120疫苗(ibv h120口服弱毒疫苗，冻干剂)：四川华派生物工程集团有限公司；使用方法：用无菌pbs缓冲液稀释至108eid
50
/ml，现配现用，冰上保存，每只鸡的单次使用剂量为200μl。
[0132]
供试菌液为步骤一制备的nc8
‑
chil17b菌液或步骤二制备的nc8
‑
p菌液。
[0133]
免疫程序：7日龄时，同时口服供试菌液和ibv h120疫苗；14日龄时，口服供试菌液；21日龄时，同时口服供试菌液和ibv h120疫苗；28日龄时，口服供试菌液；34日龄时，口服供试菌液。
[0134]
分组情况见表3。每组10羽spf雏鸡，分组时采用随机分组方式将公母雏鸡均等分配到4个组中。
[0135]
表3 spf鸡分组情况
[0136]
编号分组描述免疫剂量anc8
‑
chil17b ibv组nc8
‑
chil17b菌液(1
×
109cfu)/羽/次 200μl ibv h120疫苗/羽/次bnc8
‑
p ibv组nc8
‑
p菌液(1
×
109cfu)/羽/次 200μl ibv h120疫苗/羽/次c1ibv对照组200μl pbs缓冲液/羽/次 200μl ibv疫苗/羽/次c2pbs对照组200μl pbs缓冲液/羽/次
[0137]
按照表4中的指标进行评价。
[0138]
表4免疫增强效果评价指标
[0139][0140]
四、各指标的评价结果
[0141]
1、增重变化
[0142]
根据0时刻体重(首免当天免疫前的体重)和首免后28天体重计算净增重。结果见表5。在首免后28天时，nc8
‑
chil17b ibv组的雏鸡比nc8
‑
p ibv组的雏鸡体重增加更多(p<0.0001)。
[0143]
表5免疫28d鸡只平均增重情况统计(n＝10)
[0144]
分组初始体重(g)终体重(g)净增重(g)pbs对照组62.0
±
0.761
b
360.0
±
5.791298.0
±
2.631
c
ibv对照组61.0
±
0.955
b
350.0
±
5.924294.0
±
3.166
c
nc8
‑
p ibv组67.0
±
0.494
a
375.0
±
4.292309.0
±
2.252
b
nc8
‑
il17b ibv组66.0
±
0.471
a
380.0
±
7.263314.0
±
2.974
a
[0145]
2、体液免疫指标
[0146]
分别于0时刻(首免当天免疫前)以及首免后7、14、21和28天通过翅下静脉采集血液，37℃静置1h后4℃放置过夜并离心取血清，冻存于
‑
20℃。
[0147]
采用ibv特异性抗体elisa检测试剂盒(idexx公司，货号为99
‑
09262)检测。结果见图6。结果统计为各组的平均s/p值 s.d。阈值为0.2。s/p＝[样品a(650)
–
nc a(650)]/[样品a(650)
–
nc a(650)]。tukey的多重比较测试用于统计；*p<0.05，**p<0.01。首免后第7天开始，ibv对照组、nc8
‑
p ibv组和nc8
‑
chil17b ibv组的ibv特异性抗体s/p值均>0.2，说明ibv疫苗诱导机体产生抗体。在免疫期内，nc8
‑
chil17b ibv组的ibv特异性抗体滴度明显高于
ibv对照组和nc8
‑
p ibv组，在7、28天时p<0.05，在14、21天时p<0.01。首免后14天，ibv特异性抗体水平最高。
[0148]
分别采用鸡源细胞因子il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6和ifn
‑
γ对应的elisa试剂盒(上海优选生物科技有限公司，il
‑
2货号为yx
‑
091202c，il
‑
4货号为yx
‑
091204c，il
‑
6货号为yx
‑
091206c，ifn
‑
γ货号为yx
‑
090617c)检测0时刻(首免当天免疫前)以及首免后14和28天血清样品中细胞因子il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6和ifn
‑
γ的浓度变化。结果见图7。图7中，浓度显示为各组的平均值 s.d；*p<0.05，**p<0.01。在0时刻时，各组il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6和ifn
‑
γ的浓度无明显差异。在首免后14和28天：nc8
‑
chil17b ibv组的il
‑
2浓度明显高于ibv对照组和nc8
‑
p ibv组(p<0.05)；ibv对照组和nc8
‑
p ibv组的il
‑
2浓度也明显高于pbs对照组。此外，与ibv对照组、nc8
‑
p ibv组和pbs对照组相比，nc8
‑
chil17b组在首免后14和28天的il
‑
4、il
‑
6和ifn
‑
γ浓度显著升高。
[0149]
3、黏膜免疫指标
[0150]
首免后28天，将部分实验鸡只心脏采血处死，分别取新鲜气管和肠道(包含peyers’patch)各8cm，置于冰上，用1ml含有蛋白酶抑制剂的冷pbs缓冲液反复灌洗，然后4℃、10000g离心10min，收集上清，即为含有黏膜抗体的灌洗液。
‑
20℃保存备用。
[0151]
采用鸡siga抗体检测试剂盒(基于直接夹心elisa原理)检测灌洗液中总siga抗体的含量。
[0152]
检测ibv特异性黏膜抗体siga滴度的方法：将获取的灌洗液，加入包被了ibv特异性抗原的酶标板(上海优选生物科技有限公司，货号为yx
‑
090814c)中(每孔100μl)，每个样品重复3孔，37℃孵育1h，洗涤5次，最后一次拍干后，加入1:2000稀释的hrp
‑
标记的山羊抗鸡iga抗体(每孔100μl)，37℃孵育1h，洗涤5次，拍干后，加入底物显色液，室温孵育10min后，用酶标仪读取630nm波长下的吸光度od
630
。
[0153]
结果见图8。图8中，总siga浓度(a，b)，ibv特异性siga滴度(c，d)；黏膜抗体浓度和滴度显示为各组的平均值 s.d；统计用tukey多重比较，*p<0.05，**p<0.01。在气管中，nc8
‑
chil17b ibv组总siga和ibv特异siga显著高于ibv对照组、nc8
‑
p ibv组。在肠道中，nc8
‑
chil17b ibv组总siga和ibv特异siga均显著高于对照组。ibv对照组和nc8
‑
p ibv组的气管和肠道总siga和ibv特异性siga浓度无显著性差异。
[0154]
4、细胞免疫指标
[0155]
(1)外周血淋巴细胞中cd4 t细胞和cd8 t细胞的变化
[0156]
分别于首免后14d和28d用按1：9的比例添加了抗凝剂柠檬酸钠的注射器采集实验鸡群的翅下静脉血，混匀后放于冰上，采用tbd公司的鸡外周血淋巴细胞分离试剂盒分离外周血淋巴细胞(pblc)。
[0157]
取外周血淋巴细胞，采用facscan流式细胞仪进行分析(获得的实验数据通过flowjo7.6.1软件分析)，得到外周血淋巴细胞中cd4 t细胞和cd8 t细胞的含量。结果见图9。图9中：(a)实验鸡外周血cd4 t细胞百分率，(b)实验鸡外周血cd8 t细胞百分率；(c)cd4 /cd8 比值；tukey's多重比对进行统计；*p<0.05，**p<0.01。在首免后14天和28天，与ibv对照组和nc8
‑
p ibv组相比，nc8
‑
chil17b ibv组的雏鸡cd4 t细胞和cd8 t细胞均显著上调(p<0.001)。
[0158]
(2)免疫鸡只各组织中免疫相关基因的表达变化(qpcr)
[0159]
首免后第28天，通过心脏采血杀死4只实验鸡，观察鸡只的组织器官状态以评估安全性，并采集胸腺(thymus)和盲肠扁桃体(cecum tonsil)立即冻于液氮中。
[0160]
取0.1g组织加入1ml预冷pbs缓冲液，研磨匀浆后取200μl组织匀浆液加入trizol溶液，提取rna，然后反转录得到cdna。以cdna为模板，进行实时定量pcr，以分析供试菌在细胞免疫水平对ibv疫苗的免疫调节效应。
[0161]
图10中，统计用tukey’多重比较；*p<0.05，**p<0.01。结果显示，nc8
‑
chil17b ibv组细胞因子il
‑
1β、il
‑
6和bcl
‑
6的表达明显高于其他组，p<0.05或p<0.01。il
‑
22的表达对黏膜屏障的形成具有重要意义。在胸腺中，nc8
‑
chil17b ibv组、nc8
‑
p ibv组和ibv对照组的il
‑
22较pbs对照组显著升高(p<0.05)，但三组间无显著差异。在盲肠扁桃体中，nc8
‑
chil17b ibv组il
‑
22的表达明显高于3个对照组(p<0.05)。nc8
‑
chil17b ibv组胸腺和盲肠扁桃体中tlr
‑
3和tlr
‑
7的表达水平均显著高于其它3个对照组(p<0.05或p<0.01)。nc8
‑
chil17b ibv组参与维持免疫平衡的细胞因子tgf
‑
β4的表达也明显高于三个对照组(胸腺p<0.05，盲肠扁桃体p<0.01)。nc8
‑
chil17b ibv组记忆性cd8 t细胞标志物cd127较对照组显著上调(胸腺p<0.01，盲肠扁桃体p<0.05)，胸腺基因表达倍数高于盲肠扁桃体。
[0162]
5、攻毒保护试验
[0163]
35日龄时，攻毒ibv m41株。免疫鸡群称重后，用ibv m41株通过滴鼻、点眼和口服的方式攻毒(鼻给予三分之一体积、眼给予三分之一体积，口服三分之一体积)，攻毒剂量为每羽1ml eid
50
为10
5.8
的ibv m41株。每天早晚观察鸡群的状况，包括采食、饮水的情况和是否有咳嗽、气喘等ibv感染症状。攻毒10天后，称量体重后，扑杀所有鸡只，观察ibv靶器官是否有组织病理变化，并采集组织样本。组织样本包括肺、肝、脾、肾、法氏囊和气管淋巴结(tln)。
[0164]
组织采集后立即冻存于液氮中，然后取0.1g组织样本加入0.5μl冷pbs缓冲液并匀浆。将200μl组织匀浆添加到800μl trizol溶液中提取rna，反转录得到cdna。取1μl的cdna(即总rna的十分之一)用作模板，同时根据ibv m41(genbank登录号ay851295.1)和ibv h120(genbank登录号fj888351.1)的基因组序列，找到ibv m41株与疫苗ibv h120之间的碱基差异较多的基因片段，根据差异基因片段设计可鉴定m41和h120的引物，用于rt
‑
qpcr。引物p
ibv
‑
f/p
ibv
‑
r由成都擎科生物合成。
[0165]
p
ibv
‑
f 5
’‑
acggattcaggtgatgctgagg
‑3’
；
[0166]
p
ibv
‑
r 5'
‑
tttgttacttgccgggtcttgtgt
‑
3'。
[0167]
标准品质粒是将序列表的序列3所示的dna分子插入pmd18
‑
t载体得到的。用标准质粒制作标准曲线方程。标准曲线方程为y＝3.2771x 37.947.e＝102.0％,r2＝0.9971。
[0168]
检测得到各组织中的ibv m41病毒载量，每个样品进行六次重复。
[0169]
统计用多重t
‑
检验，*p<0.05,**p<0.01。
[0170]
结果见图11。与pbs对照组相比，免疫组ibv、nc8
‑
p ibv和nc8
‑
chil17b ibv的平均ibv m41拷贝数显著减少(p<0.01)。nc8
‑
chil17b ibv组气管、肺、脾、肾、法氏囊的平均ibv m41拷贝数与对照组相比，均极显著或极显著降低。
[0171]
在强毒ibv毒株攻击下，pbs对照组鸡在早晨出现明显的咳嗽和哮喘。但ibv组、nc8
‑
p ibv组和nc8
‑
chil17b ibv组均未见明显症状。
[0172]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和
范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。