一种外泌体的保存方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种外泌体的保存方法。


背景技术：

2.外泌体(exosomes)是细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)的一种，大小在30～150nm，由细胞内的多泡小体(multivesicularbodies,mvb)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用。此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。
3.外泌体具有双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好，可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响，从而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌体的完整性和生物活性可能受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。外泌体被提取后一般悬浮于磷酸盐(pbs)缓冲液。目前，最常用的储存方法为冷冻保存，但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变，也可能导致多层囊泡的形成和聚集，反复冻融会导致外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化。虽然
‑
80℃被公认是各种生物标本，如精液、尿、牛奶、血液和支气管肺泡灌洗液的最适宜的保存温度，但是冻融过程容易造成囊泡破坏，使外泌体中含有大量“污染物”，而且在处理或运输过程中有时很难维持这种低温条件。4℃保存虽然能够使囊泡保持良好的完整性，但是容易导致外泌体中蛋白和核酸的损失。因此，如何有效保存外泌体，一直以来都是外泌体研究领域的一个难题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提出一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶在较低温条件下长期保存外泌体，可以保持外泌体的稳定性。
5.为此，本发明采用以下技术方案：
6.一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶与外泌体混合，得到混合液进行保存。
7.优选的，所述四氢嘧啶使用前预冷30min以上。
8.优选的，所述混合液中的外泌体的粒子浓度为106～1012/ml。
9.优选的，所述混合液中的所述四氢嘧啶的质量分数为0.5～5％。
10.优选的，所述混合液中的所述四氢嘧啶的质量分数为3％。
11.优选的，所述混合液的保存温度为
‑
80～4℃。
12.优选的，所述混合液的保存温度为4℃，周期为2周。
13.优选的，所述混合液的保存温度为
‑
20℃，周期为2个月。
14.本技术方案的有益之处在于：使用四氢嘧啶作为保护剂，成分简单，新鲜的外泌体使用四氢嘧啶保护剂在较低温条件下进行保存，可以提高保存效果，保持外泌体的稳定性，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化。
附图说明
15.图1为实验例1、3、4和对照例的外泌体粒径分布图；
16.图2为实验例1、3、4和对照例的外泌体的增殖能力图；
17.图3为实验例3在4℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；
18.图4为实验例3在
‑
20℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；
19.图5为对照例在
‑
80℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；
20.图6为在4℃条件下保存2周的实验例3的外泌体的透射电镜检测图；
21.图7为在
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20℃条件下保存6个月的实验例3的外泌体的透射电镜检测图。
具体实施方式
22.为了使本发明的目的、特征和优点更加的清晰，以下结合附图及实施例，对本发明的具体实施方式做出更为详细的说明，在下面的描述中，阐述了很多具体的细节以便于充分的理解本发明，但是本发明能够以很多不同于描述的其他方式来实施。因此，本发明不受以下公开的具体实施的限制。
23.实施例一
24.现有技术中，用于制备间充质干细胞外泌体的间充质干细胞包括：脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等。在本实施例中，选择脐带间充质干细胞为实验对象。
25.首先，本实施例提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
26.步骤a、将p3代的脐带间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴中解冻2分钟。待内容物完全融化后，用75％酒精擦拭冻存管壁，然后将冻存管置于生物安全柜中。
27.步骤b、将复苏后的脐带间充质干细胞悬液转移到t75培养瓶中，然后将已经温育好的30ml细胞培养基(组成成分为：dmem/f12 10％fbs 2mm l
‑
谷胱甘肽 100u/ml青霉素 100μg/ml链霉素，dmem/f12的基础培养基可以使用α
‑
mem或l
‑
dmem培养基)加入t75培养瓶中，使干细胞的浓度为4
×
106/ml，将t75培养瓶置于37℃，5％co2条件下的培养箱内，过夜培养，第二天观察细胞贴壁情况与细胞形态，然后用温育的新培养基换液。
28.步骤c、用显微镜观察结果，待70％～85％细胞融合后，即可开始传代培养，具体操作为：用pbs缓冲液清洗贴壁生长的细胞两遍，然后用0.25％的胰酶消化至细胞脱壁，接着加入新鲜的培养基中和胰酶，按照1:3的比例进行细胞传代培养，接种后以20％细胞融合为宜。
29.步骤d、3天左右后换液，观察到70％～80％细胞融合后，更换培养基为已经温育好的30ml外泌体收集培养基(dmem/f12 10％无外泌体fbs 2mm l
‑ꢀ
谷胱甘肽 100u/ml青霉素 100μg/ml链霉素 7μm多能菌素，基础培养基可以用α
‑
mem或l
‑
dmem培养基)，再培养48～72小时，并观察细胞的融合情况与形态。当细胞融合率达到90％以上时，即得到细胞培养液。
30.本实施例还提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
31.步骤a、将上述得到的细胞培养液的上清液置于离心管中，在4℃条件下，以500g离心力离心5min后，收集离心管上清液。
32.步骤b、将步骤a收集的离心管上清液置于离心管中，在4℃条件下，以2000g 离心
力离心30min，去除细胞碎片和蛋白聚合物后，再次收集离心管上清液。
33.步骤c、将步骤b收集的离心管上清液过0.22μm滤膜，得到外泌体粗提液。
34.步骤d、将外泌体粗提液，在4℃条件下，以10000g离心力离心1h，去除大的细胞凋亡体，收集离心管上清液。
35.步骤e、将步骤d收集的离心管上清液置于离心管中，在4℃条件下，以 100000g离心力离心2h后，用200μl pbs缓冲溶液重悬沉淀，即分离得到间充质干细胞外泌体。将分离得到的间充质干细胞外泌体在
‑
80℃条件下冻存备用。
36.制备的间充质干细胞外泌体采用颗粒跟踪分析技术(nta)测量粒径与浓度，测试结果如表1所示：
37.表1外泌体的粒径与浓度
38.粒子浓度(109/ml)标准差nta粒径(nm)标准差2.80.99515.2
39.由表1可知，通过超速离心法提取得到的间充质干细胞外泌体的浓度与粒径与文献报道一致，即得到的间充质干细胞外泌体可应用于后续的实验。
40.实施例二
41.本实施例比较不同浓度的保护剂的保存效果。
42.分别将实施例一制备的外泌体分装使用不同的保护剂进行保存，包括：
43.实验例1：添加四氢嘧啶保护剂混合后，混合液中的四氢嘧啶质量分数为 0.5％；
44.实验例2：添加四氢嘧啶保护剂混合后，混合液中的四氢嘧啶质量分数为1％；
45.实验例3：添加四氢嘧啶保护剂混合后，混合液中的四氢嘧啶质量分数为 3％；
46.实验例4：添加四氢嘧啶保护剂混合后，混合液中的四氢嘧啶质量分数为 5％；
47.对照例1：不添加四氢嘧啶保护剂。
48.四氢嘧啶保护剂使用前需要预冷30min以上。
49.保存条件：
‑
20℃。
50.一个月后复溶，通过动态光散射(dls)检测分析实验例1、3、4和对照例的外泌体的浓度和粒径大小，测试结果表明实施例3的保存效果最好，实施例3 的外泌体复溶后与冻存前比较，其浓度无太大变化，同时，测试的粒径分布结果如图1所示，实施例3的外泌体粒径保存完好。
51.实施例三
52.本实施例采用cck
‑
8法检测外泌体的增殖能力。
53.取第12代的人脐带间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，以每孔5
×
103个细胞接种于96孔板中，分别加入实验例1～4和对照例的外泌体各10μl。取第1d、3d、5d、7d的细胞作检测，添加10μl染色剂，培养2h。用酶标仪在450nm处检测od值，每组取6个重复样，取平均值。测试结果如表 2以及图2所示，外泌体的增殖能力随天数增加而加强，实验例1～4的外泌体的增殖能力强于对照例，其中实验例3的外泌体的增殖能力最强。
54.表2外泌体增殖能力的平均值
[0055] 1d3d5d7d0％ectoin0.250.320.540.590.5％ectoin0.230.380.680.72
1％ectoin0.250.420.760.853％ectoin0.260.430.770.895％ectoin0.270.430.780.88
[0056]
实施例四
[0057]
本实施例比较不同温度条件下保护剂的保存时间。
[0058]
试验组1：分别将实验例3分装以不同的保存条件进行保存，包括：
[0059]
温度：4℃，时间：2周；
[0060]
温度：4℃，时间：1个月；
[0061]
温度：4℃，时间：3个月；
[0062]
温度：4℃，时间：6个月。
[0063]
试验组2：分别将实验例3分装以不同的保存条件进行保存，包括：
[0064]
温度：
‑
20℃，时间：2周；
[0065]
温度：
‑
20℃，时间：1个月；
[0066]
温度：
‑
20℃，时间：3个月；
[0067]
温度：
‑
20℃，时间：6个月。
[0068]
对照组：分别将对照例分装以不同的保存条件进行保存，包括：
[0069]
温度：
‑
80℃，时间：2周；
[0070]
温度：
‑
80℃，时间：1个月；
[0071]
温度：
‑
80℃，时间：3个月；
[0072]
温度：
‑
80℃，时间：6个月。
[0073]
试验组1、2和对照组完成后，通过动态光散射检测分析每组内不同的保存条件下的外泌体的浓度和粒径大小，测试结果如图3～5所示，实验例3的外泌体在4℃条件下保存2周后，粒径完好，即可以保持其粒径分布的稳定性。
[0074]
对照例的外泌体在
‑
80℃条件下冷冻保藏保存，其粒径会随保存时间增加而变大。而实验例3的外泌体在
‑
20℃条件下保存6个月后，仍然粒径完好。
[0075]
对在4℃条件下保存2周的实验例3的外泌体进行透射电镜检测，检测结果如图6所示，外泌体的结构形态完整。
[0076]
对在
‑
20℃条件下保存6个月的实验例3的外泌体进行透射电镜检测，检测结果如图7所示，外泌体的结构形态完整。
[0077]
因此，新鲜的外泌体使用四氢嘧啶保护剂在较低温条件下进行保存，可以提高保存效果，保持外泌体的稳定性，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化。
[0078]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。