一种基于生殖隔离性状的单倍体诱导系遗传保纯方法与流程

1.本发明属于植物遗传育种领域，具体涉及一种基于生殖隔离性状的单倍体诱导系遗传保纯方法。


背景技术：

2.玉米是典型杂种优势和异花授粉作物，其育种核心是获取优良自交系。传统方法采取杂交和多代回交得到纯系，周期较长，所耗人力财力物力较大。单倍体育种技术通过诱导、鉴别、加倍等流程能够在1
‑
2年内获得纯系，大幅度缩短育种周期，提高育种效率，已成为玉米育种主流技术之一。作为单倍体育种技术流程中关键材料之一，诱导系的保纯工作是重中之重。玉米qhir1上关键诱导基因zmpla1是第一个被发现的影响单倍体诱导率关键位点(liu et al.,2017；kelliher et al.,2017；gilles et al.,2017)；qhir8上另一关键诱导基因zmdmp被证明可在zmpla1存在基础上实现单倍体诱导率倍增效应(zhong et al.,2019)。生殖隔离性状存在于多种植物之中，这一性状受基因控制，表现出不同材料间间的现杂交不亲和性。在玉米上，爆裂玉米存在控制生殖隔离的ga基因具有单向杂交不亲和的特点，具有该基因的材料做父本与其他普通材料授粉可以结实，而反交则一般不结实。
3.单倍体育种技术的发展与应用能够大大提高育种效率，其技术应用依赖于诱导系为父本诱导母本材料产生单倍体。诱导系的单倍体诱导性能依赖于诱导基因的纯合性，而其繁殖过程中的保纯虽然可以通过严格的自交实现，但通过生殖隔离性状与诱导性状的聚合，将可以简化繁殖过程中的遗传保纯流程，保持诱导系的诱导性能，为诱导系的高效利用提供新的手段。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何保纯玉米的单倍体诱导系或如何对玉米单倍体诱导系进行保纯繁育。
5.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了植物单倍体诱导系保纯繁育的方法。所述方法包括如下步骤：
6.a1、以携带单倍体诱导相关基因的诱导系材料作为母本和携带生殖隔离基因的植物作为父本进行杂交，获得f1代的杂交种；
7.a2、种植所述f1代的杂交种得到所述f1代的杂交植株，将所述f1代的杂交植株进行自交或以所述诱导系材料作为轮回亲本进行回交，检测所述自交或回交得到的每代植株中所述单倍体诱导相关基因和所述生殖隔离基因的基因型，最终得到携带所述单倍体诱导相关基因和所述生殖隔离基因的基因型均为纯合基因型的所述自交或回交的植株，该植株即为保纯繁育得到的植物单倍体诱导系。
8.上文所述方法中，所述植物可为下述任一种：
9.1)双子叶植物；
10.2)单子叶植物，
11.3)禾本目植物，
12.4)禾本科植物，
13.5)玉蜀黍属植物，
14.6)玉米。
15.所述双子叶植物可包括但不限于油菜、向日葵、花生、番茄等。所述单子叶植物可包括但不限于小麦、水稻等。
16.上文所述方法中，所述单倍体诱导相关基因可为玉米zmpla1和zmdmp基因。所述生殖隔离基因可为玉米ga1
‑
s基因。所述单倍体诱导相关基因还可为其他单倍体诱导基因，如cenh3基因，ig基因或pld3基因。所述生殖隔离基因(杂交不亲和基因)还可为其他生殖隔离基因，如spri1、atlure1、ui3a等。
17.上文所述方法中，所述植物单倍体诱导系可为玉米单倍体诱导系cau5。所述植物单倍体诱导系还可为其他玉米单倍体诱导系材料。所述植物单倍体诱导系还可为其他植物单倍体的诱导系材料。
18.上文所述方法中，所述携带生殖隔离基因的植物可为玉米材料401d。所述携带生殖隔离基因的植物材料还可为其他含有生殖隔离基因的玉米材料。所述携带生殖隔离基因的植物材料还可为携带生殖隔离基因的其他植物材料。所述生殖隔离基因还可为其他生殖隔离基因，如spri1、atlure1、ui3a等。
19.上文所述方法中，a2中所述检测所述自交或回交得到的每代植株中所述单倍体诱导相关基因和所述生殖隔离基因的基因型的方法可包括使用引物对待测植株进行pcr扩增检测。所述pcr扩增产物中含有所述生殖隔离基因的片段的植株可为携带a1所述生殖隔离基因的植株。
20.上文所述引物可为p1和/或p2所述的引物对：
21.p1、序列表中序列1和序列2所示的dna分子组成的引物对；
22.p2、序列表中序列3和序列4所示的dna分子组成的引物对。
23.上文所述方法中，所述引物可为p1所述引物对，所述生殖隔离基因的片段可为序列表中序列5所示的dna分子。所述引物也可为p2所述引物对，所述生殖隔离基因的片段可为序列表中序列6所示的dna分子。
24.上文所述的方法的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
25.d1、上文所述的方法在植物诱导系保纯繁育中的应用；
26.d2、上文所述的方法在植物单倍体生产过程中的应用；
27.d3、上文所述的方法在植物单倍体育种技术的推广中的应用。
28.上文所述的方法中的所述生殖隔离基因在构建植物保纯单倍体诱导系中的应用也属于本发明的保护范围。
29.上文所述的方法中的所述生殖隔离基因在植物诱导系保纯繁育中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的目的是提供一种利用生殖隔离基因对专用玉米单倍体诱导系开展保纯工作的方法。
30.实验证明：本发明利用中国农大选育的高频单倍体诱导系cau5作为母本，以具有单向生殖隔离性能的爆裂玉米材料401d作为父本，在分子标记辅助选择的基础上，通过回交的方法将爆裂玉米中生殖隔离配子体基因导入到单倍体诱导系中，构建了一种单向杂交
不亲和的单倍体诱导系pcau5。经田间验证，该单倍体诱导系自交或作为父本向其它材料(包括马齿型、硬粒型和部分爆裂玉米)授粉时结实良好，但用普通玉米(不含生殖隔离基因)花粉对其授粉时不结实。另利用zd958测验得出该诱导系诱导率可达10％。
31.本发明将生殖隔离性状应用于诱导系的遗传保纯工作中，形成只接受自身花粉、具有生物学隔离功能的诱导系材料。该材料在商业化dh育种应用上，有助于避免外来花粉对诱导系诱导性能的影响，解决诱导系繁育过程中遗传保纯难题。
32.本发明所提供的方法为解决单倍体育种过程中关键诱导系材料的保纯工作提供了一个可行的方案，可有效降低诱导系等关键材料繁育工作中田间受杂的几率，并可减少诱导系繁育工作任务，提高玉米育种效率。
附图说明
33.图1为分子标记检测关键基因位点琼脂糖电泳图。a为zmpla1基因型鉴定，b为zmdmp基因型鉴定，c为生殖隔离基因鉴定。
34.图2为构建的含生殖隔离基因的新型目标诱导系关键基因位点琼脂糖电泳图。a为zmpla1基因型鉴定，b为zmdmp基因型鉴定，c为生殖隔离基因鉴定。
35.图3为新型目标诱导系pcau5植株及果穗图。
具体实施方式
36.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
37.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.下述实施例中所用单倍体诱导系cau5由中国农业大学陈绍江课题组提供，其平均诱导率在10％左右，且具有r1
‑
nj颜色标记，在文献“陈绍江,黎亮,李浩川玉米单倍体育种技术[m].中国农业大学出版社2009”中公开过，公众可以从中国农业大学获得，以重复本发明。
[0039]
爆裂玉米系401d由中国农业大学陈绍江课题组保存(相关文献：缪金珂，郭明欣，陈绍江.“玉米杂交不亲和基因ga1
‑
s选择性杂交亲和现象观察”.2012年全国玉米遗传育种学术研讨会暨新品种展示观摩会论文及摘要集.ed.{4}，2012，47.公众可从申请人获得，只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用)，根据分子标记检测确保生殖隔离基因位点存在，且田间验证具有单向杂交不亲和性。
[0040]
下述实施例中的tris饱和酚、氯仿、酒精、异丙醇和琼脂糖均为北京吉普腾生物技术有限公司产品。
[0041]
下述实施案例中的pcr扩增mix试剂为北京艾德莱生物科技有限公司产品。
[0042]
实施例1、具有单向生殖隔离性能单倍体诱导系的构建
[0043]
一、具有单向生殖隔离性能单倍体诱导系选育流程
[0044]
为使单向生殖隔离性状与单倍体诱导性状聚合，将生殖隔离性状基因导入单倍体
诱导系，最终使得玉米单倍体诱导系得到保纯繁育，首先将以cau5(分子标记检测其含有的关键诱导位点基因zmpla1和zmdmp均隐性纯合)为母本、爆裂玉米系401d(分子标记检测其含有的生殖隔离基因即单向杂交不亲和基因ga1
‑
s显性纯合)为父本进行杂交，获得关键诱导位点及杂交不亲和基因位点均为杂合的f1代的杂交种子；种植f1代杂交种子得到f1代杂交玉米植株，以cau5为轮回亲本(母本)，与f1代杂交玉米(父本)回交3代，每代检测生殖隔离基因位点基因型，选择ga1
‑
s基因型为纯合或杂合的玉米进行回交，观察并记录田间表型及籽粒性状，得bc3f1代；选择ga1
‑
s基因型为纯合或杂合且zmpla1和zmdmp基因隐性纯合的bc3f1单株自交2代，每代对ga1
‑
s、zmpla1和zmdmp基因的基因型进行分子标记检测，最终选择其中ga1
‑
s位点的基因型为显性纯合，zmpla1和zmdmp基因的基因型为隐性纯合的植株为单向杂交不亲和单倍体诱导系，命名为pcau5。
[0045]
其中，分子标记检测关键诱导位点基因zmpla1和zmdmp和生殖隔离位点基因ga1
‑
s的基因型方法见下述步骤四。
[0046]
二、分子标记引物设计
[0047]
cau5诱导系qtl位点qhir1上zmpla1和qhir8上zmdmp诱导位点检测引物分别使用中国农业大学陈绍江课题组自主开发引物序列检测：
[0048]
pla1
‑
f：5'
‑
acgtggagacagggaggtac
‑
3'；
[0049]
pla1
‑
r：5'
‑
gcttctggggttgatggcag
‑
3'。
[0050]
pla1
‑
f：5'
‑
acgtggagacagggagcgag
‑
3'；
[0051]
pla1
‑
r：5'
‑
gcttctggggttgatggcag
‑
3'。
[0052]
chr9
‑
76s1f：5'
‑
caaaaccacttcaatccaggt
‑
3'；
[0053]
chr9
‑
76s1r：5'
‑
gtacgtcaggagtccggaga
‑
3'。
[0054]
单向杂交不亲和基因ga1
‑
s(zm00001d048936)序列通过ncbi网站下载。自主设计引物cg17
‑
f/r对亲本材料cau5和401d的dna进行pcr扩增并双向测序得到二者基因序列，再根据测序结果利用ncbi网站上的primer
‑
blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer
‑
blast/)工具设计引物对cg19
‑
f/r和cg13
‑
f/r，用于检测ga1
‑
s基因，具体序列如下：
[0055]
cg17
‑
f：5'
‑
acacgaccattagcgagtcc
‑
3'；
[0056]
cg17
‑
r：5'
‑
atcccgagaaagggtattgcc
‑
3'。
[0057]
cg19
‑
f：5'
‑
acacgaccattagcgagtcc
‑
3'(序列表中序列1)；
[0058]
cg19
‑
r：5'
‑
acctttcgactgtctggacg
‑
3'(序列表中序列2)。
[0059]
cg13
‑
f：5'
‑
acacgaccattagcgagtcc
‑
3'(序列表中序列3)；
[0060]
cg13
‑
r：5'
‑
cggcgtatacaacgtcgtaacc
‑
3'(序列表中序列4)，其中cg13
‑
r5'端4碱基cggc为根据引物序列cg含量需求补充)。
[0061]
三、dna提取
[0062]
五叶期对玉米材料进行单株叶片取样，并严格编号，低温冷藏，基因组dna提取方法参照murray和thompson(1980)所提供的方法。
[0063]
四、基因型鉴定
[0064]
以上述提取dna为模板，采用上述步骤二中的各f/r引物对进行pcr扩增。
[0065]
pcr扩增反应体系：dna 1μl，f/r引物各0.5μl，mix 5μl，ddh2o 3μl，加入10μl石蜡
油。
[0066]
pcr扩增反应条件如表1所示。
[0067]
表1.不同引物对pcr扩增反应条件
[0068][0069][0070]
琼脂糖凝胶电泳：配制2％的琼脂糖凝胶，电泳检测上述pcr扩增产物并测序验证，电压160v，电泳时间12分钟。
[0071]
pla1
‑
f/r：野生型zmpla1/zmpla1(即显性纯合基因型)及杂合基因型zmpla1/zmpla1材料存在条带(155bp)，隐性纯合基因型zmpla1/zmpla1材料则无条带。具体见图1中a1和图2中a；
[0072]
pla1
‑
f/r：隐性纯合基因型zmpla1/zmpla1及杂合基因型zmpla1/zmpla1材料存在条带(141bp)，野生型即显性纯合基因型zmpla1/zmpla1材料则无条带。具体见图1中a2和图2中a；
[0073]
chr9
‑
76s1f/r：野生型即显性纯合基因型zmdmp/zmdmp材料存在上带(491bp)，杂合基因型zmdmp/zmdmp材料表现出上下双带(491bp和333bp)，隐性纯合基因型为zmdmp/zmdmp材料则仅有下带(333bp)。具体见图1中b和图2中b。
[0074]
cg17
‑
f/r：显性纯合基因型ga1
‑
s/ga1
‑
s大小约965bp条带，隐性纯合基因型ga1/ga1材料则存在大小约为860bp条带。具体见图1中c3。
[0075]
cg19
‑
f/r：显性纯合基因型ga1
‑
s/ga1
‑
s及杂合基因型ga1
‑
s/ga1材料存在大小747bp条带(序列表中序列5)，基因型为ga1/ga1材料则无条带。具体见图1中c1和图2中c。
[0076]
cg13
‑
f/r：隐性纯合基因型ga1/ga1及杂合基因型ga1
‑
s/ga1材料存在大小741bp条带(序列表中序列6)，显性纯合基因型ga1
‑
s/ga1
‑
s材料则无条带。具体见图1中c2和图2中c。
[0077]
实施例2、单向不亲和单倍体诱导系pcau5性状评价
[0078]
一、单向不亲和性验证
[0079]
2020年5月，在中国农业大学上庄试验站分地块种植实施例1得到的目标诱导系pcau5和多种常规材料(包括商业杂交种zd958、nd678和jk968和陈绍江课题组选育的常规自交系c229、chen04_065、chen04_125。其中zd958购于北京德农种业有限公司，nd678、c229、chen04_065、chen04_125由中国农业大学陈绍江课题组提供，jk968购于北京顺鑫农业股份有限公司，以上常规材料均不含有ga1
‑
s基因和r1
‑
nj颜色标记基因)。
[0080]
地块一：设置三个重复区，每个重复区种植100株pcau5，商业杂交种zd958、nd678和jk968各50株，错期种植保证花期相遇。地块周围不包含携带ga1
‑
s基因的材料。散粉前对
pcau5严格去雄并对雌穗套袋；花期取三个杂交种zd958、nd678和jk968(作为父本)的花粉等比例混合后对pcau5材料(作为母本)授粉，授粉后25天观察pcau5结实情况，pcau5结实为0；
[0081]
地块二：设置三个重复区，每个重复区种植100株pcau5，商业杂交种zd958、nd678和jk968各50株，其中，杂交种分布于pcau5周围，错期种植保证花期相遇。地块周围不包含携带ga1
‑
s基因的材料。散粉前对pcau5严格去雄且雌穗不套袋，进行开放授粉；杂交种散粉后约25天观察pcau5结实情况，pcau5结实为0；
[0082]
地块三：设置三个重复区，每个重复区种植100株pcau5，常规自交系c229、chen04
‑
065、chen04
‑
125各50株，其中，自交系与pcau5间隔种植，错期种植保证花期相遇。地块周围不包含其他诱导系材料。所有材料开放授粉。果穗收获后对常规自交系和pcau5籽粒糊粉层颜色进行观察，其中pcau5结实正常且籽粒糊粉层均带r1
‑
nj颜色标记(r1
‑
nj颜色标记基因为显性标记，杂合基因型或显性纯合基因型籽粒糊粉层均带颜色)，糊粉层表现为紫色；常规自交系的籽粒中既包含带r1
‑
nj颜色标记籽粒，也有无r1
‑
nj颜色标记即正常黄色籽粒。
[0083]
地块四：设置三个重复区，每个重复区种植100株pcau5，散粉前对pcau5严格去雄并对雌穗套袋，所有材料严格自交。果穗收获后对pcau5结实情况及籽粒糊粉层颜色进行观察，所有单株结实正常且籽粒糊粉层均带r1
‑
nj颜色标记，糊粉层表现为紫色。
[0084]
以上结果说明该单倍体诱导系pcau5诱导系携带生殖隔离基因，为具有生物学隔离功能的诱导系材料，在与常规材料混种开放授粉时可排除外源花粉影响，实现诱导系保纯。
[0085]
二、诱导率测验
[0086]
2020年5月，在中国农业大学上庄试验站设置三个重复区，每个重复区种植100株pcau5和500株zd958，错期种植保证花期相遇。散粉前通过对pcau5进行基因型检测，选取两个关键诱导位点zmpla1和zmdmp基因型为隐性纯合基因型、生殖隔离基因ga1
‑
s基因型为显性纯合基因型的材料(该材料三个基因的对应的基因型组合为zmpla1/zmpla1 zmdmp/zmdmp ga1
‑
s/ga1
‑
s)对zd958授粉进行诱导率测验，每个pcau5对5株zd958进行授粉，共计500株。果穗收获后利用r1
‑
nj颜色标记对单倍体籽粒进行鉴别(利用pcau5给zd958授粉时，所得二倍体的胚和糊粉层均有紫色的颜色标记，而单倍体的糊粉层有颜色但是胚无颜色，根据胚上颜色的差异就能够将单倍体籽粒从二倍体籽粒中鉴别出来)。舍弃单穗结实低于100粒及含多个无r1
‑
nj颜色标记籽粒的果穗，统计pcau5对zd958的平均单倍体诱导率可达10
±
1.5％。其中，单株单倍体诱导率计算公式为：诱导率＝单倍体数/结实总数。
[0087]
三、农艺性状调查
[0088]
2020年5月，在中国农业大学上庄试验站设置三个重复区，每个重复区种植pcau5、cau5和401d各100株。对pcau5、cau5、401d的株高、穗位、花期、散粉持续时间、雄穗分支、雄穗主枝长等农艺性状进行调查(图3)，数据如下：
[0089]
表2.含生殖隔离基因新型诱导系pcau5、cau5、401d农艺性状对比(平均值
±
标准差)
[0090][0091]
结果表明，通过本发明中的方法得到的具有生殖隔离性能的单倍体诱导系pcau5也具有生育期短、穗位低、雄穗分支数多等优良的农艺性状。因此，该诱导系材料既具有生物学隔离功能，又具有优良的农艺性状，在生产中具有广阔的应用前景。
[0092]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。