一种提高先导编辑效率的载体和方法与流程

专利2022-05-10  3



1.本发明涉及生物技术领域中,一种提高先导编辑效率的载体和方法。


背景技术:

2.精确基因编辑在作物育种和基因组功能研究中发挥着重要作用。然而单碱基编辑器(abe和cbe)编辑窗口比较窄,传统的同源重组修复(hdr)需要外源的dna模板,系统复杂且效率较低,这极大地限制了相关工作的开展。自2019年10月以来出现的精准基因编辑新工具pe(prime editors)为基因编辑领域带来了重大突破(anzalone,randolph et al.)。新工具pe以crispr

cas9系统为基础,其先导编辑引导rna是在单链引导rna(sgrna)的3’末端增加一段含有新遗传信息的逆转录模板(rtt)和引物结合位点(pbs)序列,将cas9切口酶(h840a)与逆转录酶(m

mlv)融合形成新的融合蛋白,在逆转录酶的作用下可以实现将逆转录模板中携带的新的遗传信息“写入”到植物基因组中。
3.在动物细胞中,pe系统在不引入双链断裂(dsb)和无需供体dna模板情况下,可有效实现12种单碱基的自由转换和多碱基的精准插入与删除。2020年,国内已有多组科研团队相继发表文章阐述该dna先导编辑系统在植物中的应用,但其编辑效率却有待进一步提高(lin,zong et al.2020)。因此,需要开发出一种能显著提高先导编辑效率的方法,以提高该系统的可用性和友好度,让精确编辑发挥更大的作用。


技术实现要素:

4.本发明所要解决的技术问题是如何提高pe系统的精确编辑效率。
5.为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种dna先导编辑系统,所述系统含有pegrna,所述pegrna为由靶向目的dna片段的sgrna、逆转录模板和引物结合位点(pbs)连接得到的rna分子,所述引物结合位点的3’端和/或其中间与sgrna的spacer的核苷酸不匹配。
6.上述系统中,所述引物结合位点的3’末端的三个核苷酸中的一个、两个或三个核苷酸与sgrna的spacer的相应核苷酸不匹配;和/或,所述引物结合位点的3’末端起第七个核苷酸或其其他序列与sgrna的spacer的相应核苷酸不匹配。
7.所述其他序列是指pbs的除3’末端的三个核苷酸与3’末端起第七个核苷酸外的其他核苷酸。
8.上述系统中,所述dna先导编辑系统还可含有cas9切口酶(h840a)与逆转录酶m

mlv融合所形成的融合蛋白。
9.本发明还提供了一种载体,所述载体含有转录所述pegrna的dna分子。
10.所述dna分子的序列可为序列4的第515

639位。
11.所述载体可含有大于1个的含有转录所述pegrna的dna分子。
12.所述载体中,含有转录所述pegrna的dna分子的转录可由序列表中序列3的第1

994位所示的dna分子驱动或由序列表中序列4的第1

437位所示的dna分子驱动和/或由序列表中序列4的第811

1334位所示的dna分子驱动。
13.所述载体还可含有所述融合蛋白的编码基因。
14.所述融合蛋白的编码基因可为序列1的第2006

8359位。
15.所述载体还可含有trna基因和rna核酶基因,可选的,位于同一基因表达框中的trna基因、pegrna基因及rna核酶基因依次相连。
16.所述载体还可含有抗性标记基因。
17.所述系统或所述载体在基因编辑中的应用,也属于本发明的保护范围。
18.本发明还提供了一种基因编辑的方法,所述方法包括将所述载体导入待编辑体中实现基因的编辑。
19.所述待编辑体可为植物,如水稻。
20.所述系统或所述载体或所述基因编辑的方法在植物育种中的应用,也属于本发明的保护范围。
21.实验证明,本发明通过在pbs的中间位置引入突变碱基或者在pbs的3'端引入突变碱基可以有效提高植物中先导编辑系统的编辑效率,通过该方法得到的先导编辑系统具有很好的应用前景。
附图说明
22.图1为包含pegrna的载体pg3h

pe2

35c和载体pg3h

pe2

u3结构示意图及进一步的载体构建过程示意图。
23.图2为序列分析。上图为在i1879位点引入突变时,rtt&pbs的序列、长度和靶点序列;osacc基因为水稻乙酰辅酶a羧化酶基因;target指pegrna的靶点、rtt指逆转录模板、pbs指引物结合位点。第2部分为在pbs中引入不同突变核苷酸的rtt&pbs序列。
24.图3为基于突变pbs策略的不同载体在原生质体中精确编辑效率。
具体实施方式
25.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
26.下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。下述实施例中,如无特殊说明,序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5

末端核苷酸,末位均为相应dna/rna的3

末端核苷酸。
27.pegrna是在单链引导rna(sgrna)的3’末端增加一段含有新遗传信息的逆转录模板(rtt)和引物结合位点(pbs)序列,pegrna根据需要编辑的靶位点设计。在下述实施例中,pegr1和pegr2相同。spacer与sgrna支架组成完整的sgrna。
28.下表1为实施例中所用的引物、先导编辑引导rna(pegrna)相关序列:
29.表1引物、先导编辑引导rna(pegrna)相关序列
[0030][0031][0032]
实施例1、先导编辑双元载体的构建
[0033]
一、u3启动子驱动pegrna表达的载体构建
[0034]
1、分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp0(puc57

1879rp0为序列表中序列5所示的1879rp0片段反向插入到puc57

simple的lacz中组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp0

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879rp02。puc57

1879rp02的pegrna相关结构如下:bsai

pegr1

hdv

osu3t

tau3p

tmet

pegr2

bsai。
[0035]
分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp1b(puc57

1879rp1b为序列表中序列6所示的1879rp1b片段反向插入到puc57

simple的lacz中组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp1b

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)
为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,将得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879

rp1b2。puc57

1879

rp1b2与puc57

1879rp02的pegrna相关结构相同,pbs序列不同。
[0036]
分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp2b(puc57

1879rp2b为序列表中序列7所示的1879rp2b片段反向插入到puc57

simple的lacz组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp2b

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,将得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879

rp2b2。puc57

1879

rp2b2与puc57

1879rp02的pegrna相关结构相同,pbs序列不同。
[0037]
分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp3b(puc57

1879rp3b为序列表中序列8所示的1879rp3b片段反向插入到puc57

simple的lacz组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp3b

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,将得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879

rp3b2。puc57

1879

rp3b2与puc57

1879rp02的pegrna相关结构相同,pbs序列不同。
[0038]
分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp4b(puc57

1879rp4b为序列表中序列9所示的1879rp4b片段反向插入到puc57

simple的lacz组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp4b

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,将得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879

rp4b2。puc57

1879

rp4b2与puc57

1879rp02的pegrna相关结构相同,pbs序列不同。
[0039]
分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp5b(puc57

1879rp5b为序列表中序列10所示的1879rp5b片段反向插入到puc57

simple的lacz组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp5b

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中
hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,将得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879

rp5b2。puc57

1879

rp5b2与puc57

1879rp02的pegrna相关结构相同,pbs序列不同。
[0040]
分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp6b(puc57

1879rp6b为序列表中序列11所示的1879rp6b片段反向插入到puc57

simple的lacz组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp6b

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,将得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879

rp6b2。puc57

1879

rp6b2与puc57

1879rp02的pegrna相关结构相同,pbs序列不同。
[0041]
分别使用引物mamp

bsf/tmet

bsf(即表1中mamp

bsf与tmet

bsf组成的引物对)和引物hdv

bsr2/mamp

bsr(即表1中hdv

bsr2与mamp

bsr组成的引物对),以合成载体puc57

1879rp7b(puc57

1879rp7b为序列表中序列12所示的1879rp7b片段反向插入到puc57

simple的lacz组成的克隆载体,该片段中所包含的逆转录模板和引物结合位点序列如表1中1879rp7b

rtt/pbs所示)为模板进行pcr扩增,利用引物hdv

bsf2/tmet

bsr(表1中hdv

bsf2与tmet

bsr组成的引物对),以合成片段osws2(其序列如序列表中序列2所示)为模板进行pcr扩增。混合回收所得三种pcr产物,利用bsai酶切后再次纯化回收酶切产物,得到纯化后的酶切产物,将得到的纯化后的酶切产物进行自连接,将得到的序列正确的重组载体命名为puc57

1879

rp7b2。puc57

1879

rp7b2与puc57

1879rp02的pegrna相关结构相同,pbs序列不同。
[0042]
其中,序列5的第3

8位为bsai的识别序列,第14

33位为spacer序列,第34

109位为sgrna骨架序列,第110

132位为rtt序列,第133

145位为pbs序列,第146

213位为hdv序列,第222

293位为tmet序列,第294

313位为spacer序列,第314

389位为sgrna骨架序列,第390

412位为rtt序列,第413

425位为pbs序列,第431

436位为bsai序列识别序列。
[0043]
序列6

12分别为将序列5的第133

145位和413

425位的pbs由“caagtccatcttc”依次替换为“caagtcgatcttc”、“caagtcgatcttg”、“caagtcgatctag”、“caagtcgatcaag”、“caagtccatcaag”、“caagtccatctag”、“caagtccatcttg”,图2。
[0044]
2、构建u3启动子驱动的含有pegrna的先导编辑双元载体:建立含bsai的golden gate反应,具体过程如下:
[0045]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3(jiang et al.genome biology(2020)21:257,prime editing efficiently generates w542l and s621i double mutations in two als genes in maize),将得到的载体骨架与bsai酶切的步骤1所得puc57

1879rp02连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp02。p1879

rp02中pegrna表达框的结构特征如下:osu3p

tgly

pegr1

hdv

osu3t

tau3p

tmet

pegr2

hdv

tau3t。p1879

rp02的结构特征
如下:rb

osu3p

pegr

osu3t

tau3p

pegr

tau3t

ubi1p

cas9n

rt

e9t

hyg

lb。
[0046]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3,将得到的载体骨架与步骤1所得puc57

1879

rp1b2经bsai酶切所得的片段连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp1b2。
[0047]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3,将得到的载体骨架与步骤1所得puc57

1879

rp2b2经bsai酶切所得的片段连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp2b2。
[0048]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3,将得到的载体骨架与步骤1所得puc57

1879

rp3b2经bsai酶切所得的片段连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp3b2。
[0049]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3,将得到的载体骨架与步骤1所得puc57

1879

rp4b2经bsai酶切所得的片段连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp4b2。
[0050]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3,将得到的载体骨架与步骤1所得puc57

1879

rp5b2经bsai酶切所得的片段连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp5b2。
[0051]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3,将得到的载体骨架与步骤1所得puc57

1879

rp6b2经bsai酶切所得的片段连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp6b2。
[0052]
利用bsai酶切pg3h

pe2

u3,将得到的载体骨架与步骤1所得puc57

1879

rp7b2经bsai酶切所得的片段连接,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp7b2。
[0053]
二、35u6融合型启动子驱动pegrna表达的载体构建
[0054]
1、构建35u6融合型启动子驱动的含有pegrna的先导编辑双元载体:建立含bsai的golden gate反应,具体步骤如下:
[0055]
利用golden gate反应,将含有i1879v的靶点,逆转录模板等序列的pegr1

hdv

tmet

pegr2片段(即上文的1879rp0片段,其序列如序列表中序列5所示)的两个bsai酶切位点间的dna片段替换pg3h

pe2

35c(jiang et al.genome biology(2020)21:257,prime editing efficiently generates w542l and s621i double mutations in two als genes in maize)两个bsai酶切位点间的dna小片段,将得到的序列正确的重组载体命名为p1879

rp0。p1879

rp0的pegrna表达框结构特征如下:35s

cmylcv

u6

tgly

pegr1

hdv

tmet

pegr2

hdv

polyt

hspt。p1879

rp0结构特征如下:rb

35u6p

pegrna

hspt

ubi1p

cas9n

rt

e9t

hyg

lb。
[0056]
同样,利用golden gate反应,分别将含有不同突变核苷酸的pbs片段1879rp1b、1879rp2b、1879rp3b、1879rp4b和1879rp5b的两个bsai酶切位点间的dna片段替换pg3h

pe2

35c两个bsai酶切位点间的dna小片段,将得到的序列正确的重组载体分别命名为p1879

rp1b、p1879

rp2b、p1879

rp3b、p1879

rp4b和p1879

rp5b。
[0057]
其中,包含pegrna的pg3h

pe2

35c载体t

dna的物理图谱如图1上部分所示。lb和rb分别为t

dna的左右边界,35s

cmylcv

u6p为35sen

cmylcv与u6的融合启动子,35sen为camv35s增强子,35sen

cmylcv为融合聚合酶ii启动子,u6为截短的u6

26聚合酶iii启动子,pegrna基因表达框如图中以及序列表中序列3所示。zmubi1p为玉米ubi1启动子,cas9h840a为密码子优化的spcas9切口酶(h840a);rt为优化的逆转录酶(m_mlv),e9t为豌豆rbcs

e9终止子;hyg为潮霉素抗性基因。cas9h840a表达盒序列如序列表中序列1所示。
[0058]
序列3中,第1

435位为35sen的序列,第436

898位为cmylcv的序列,即第1

898位为融合聚合酶ii启动子,第907

994位为截短的u6

26聚合酶iii启动子序列,第1002

1072为tgly的序列,第1073

1092位为spacer序列,第1093

1168位为sgrna骨架序列,第1169

1197位为rtt

pbs的序列,第1198

1265位为hdv的序列,第1274

1345位为tmet的序列,第1346

1365位为spacer的序列,第1366

1441位为sgrna的骨架序列,第1442

1470位为rtt

pbs的序列,第1471

1538位为hdv的序列,第1539

1817位为polyt

hspt的序列。
[0059]
包含pegrna的pg3h

pe2

u3载体t

dna的物理图谱如图1下部分所示,osu3p为启动子,pegrna基因表达框如图中以及序列表中序列4所示;zmubi1p为玉米ubi1启动子,cas9h840a为密码子优化的spcas9切口酶(h840a)基因;rt为优化的逆转录酶(m_mlv),e9t为豌豆rbcs

e9终止子;hyg为潮霉素抗性基因。
[0060]
序列4中,第1

437位为osu3p的序列,第444

514位为tgly的序列,第515

534位为spacer的序列,第535

610位为sgrna的骨架序列,第611

639位为rtt

pbs的序列,第640

707位为hdv的序列,第708

801位为osu3t的序列,第811

1334位为tau3p的序列,第1344

1415位为tmet的序列,第1416

1435位为spacer的序列,第1436

1511位为sgrna的骨架序列,第1512

1540位为rtt

pbs的序列,第1541

1608位为hdv的序列,第1609

1667位为tau3t的序列。
[0061]
实施例2、水稻原生质体转化及先导编辑效率分析
[0062]
1、利用威格拉斯试剂盒大提p1879

rp0、p1879

rp1b等6个35u6融合型启动子驱动pegrna的先导编辑双元载体以及p1879

rp02、p1879

rp1b2等6个u3启动子驱动pegrna的先导编辑双元载体,将上述载体通过peg介导的原生质体转化方法进行3次独立的水稻原生质体转化实验。原生质体来源于日本晴。
[0063]
2、分析水稻原生质体中基因osacc的突变情况,以i1879v

f/i1879v

r为引物,以转化后的水稻原生质体基因组为模板pcr扩增包含靶点的片段,对该片段进行高通量测序,分析突变情况。
[0064]
通过高通量测序分析的原生质体编辑效率,如表2和图3所示,启动子35u6驱动或者u3驱动pegrna表达,含有1879rp1b片段的载体突变效率较高。
[0065]
实施例3、水稻稳定转化及先导编辑效率分析
[0066]
1、分别将载体p1879

rp02、p1879

rp1b2、p1879

rp2b2等8个u3启动子驱动的载体导入含有辅助载体pvs1

vir2的工程农杆菌lba4404(zhang,zhang et al.2019,a novel ternary vector system united with morphogenic genes enhances crispr/cas delivery in maize)中,以形成含有三元载体系统的菌株。用上述农杆菌株转化水稻中花11品种,利用50mg/l的潮霉素筛选转基因株系。
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2、分析水稻转基因株系中基因osacc的突变情况,以i1879v

idf/i1879v

idr为引物,以水稻转基因株系基因组为模板pcr扩增包含靶点的片段,以i1879v

idf为检测引物进行sanger测序,检测突变情况。
[0068]
水稻稳定转化结果如表3所示,转化对照载体p1879

rp02的37个转基因株系中,1个株系发生精确编辑,编辑效率为2.7%(1/37);相较于对照载体(p1879

rp02),有4个实验组编辑效率提高。其中在36个p1879

rp1b2的转基因株系中,3个株系发生精确编辑,精确编辑效率为8.3%(3/36),为对照组的3倍左右;在36个p1879

rp5b2的转基因株系中,4个株系发生精确编辑,精确编辑效率为11.1%(4/36),为对照组效率的4倍左右,同时有1个株系发生非精确编辑,即载体p1879

rp5b2总的编辑效率为13.9%(5/36);p1879

rp6b2的总编辑效率为9.5%,p1879

rp7b2的总基因编辑效率为6.9%,均显著高于对照。
[0069]
实验结果表明通过在pbs的中间位置引入突变碱基或者在pbs的3'端引入突变碱基可以有效提高植物中先导编辑系统的编辑效率。
[0070]
表2高通量方法分析原生质体中精准编辑效率
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注:平均值为3次独立转化实验数据的平均数(n=1,2,3)
[0074]
表3水稻转基因株系的先导编辑效率
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注:本表根据转基因株系pcr产物的直接测序结果统计计算。
[0077]
上文中,精确编辑是指将osacc的第1879位的密码子由ata突变为gta以及为了引入酶切位点而引入的g

c,g

c的突变。
[0078]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本技术中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
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