斑马鱼抑郁模型的建立及吗拉贝胺抗抑郁活性的测定方法与流程

专利2022-05-10  3



1.本发明属于生物学与医学领域,具体涉及一种斑马鱼抑郁模型的建立及吗 拉贝胺抗抑郁活性的测定方法。


背景技术:

2.抑郁症是一类较普遍的心理疾病,症状主要表现为:心情低落、语言活动 减少、思维活动缓慢。中度或深度抑郁症患者容易产生自杀倾向和昏迷。相关 调查显示,有些抑郁症病例出现了严重的焦虑情绪、暴躁情绪;也有部分抑郁 症深度患者可能会存在幻觉与妄想等精神症状。
3.抑郁症的发作除了受心理、社会因素的影响,还与生化因素有关。1965 年,schildkraut提出“单胺假说”,其认为抑郁症这一心理疾病的发作与人体 大脑中三种类型的单胺神经递质功能的减弱存在一定联系,这三种神经递质分 别是多巴胺(da)、去甲肾上腺素(ne)以及5

羟色胺(5

ht)。
4.单胺氧化酶(monoamine oxidase,mao)又叫黄素胺氧化酶,是一种可催 化人及其他生物体内单胺类神经递质代谢失活(氧化脱氨)的酶,全称为单胺氧 化还原酶。mao在人体中枢神经系统中起着非常重要的作用,单胺氧化酶的 活性异常会引起单胺类神经递质代谢异常,从而引发身体出现各种功能障碍, 导致疾病状态。
5.临床上药物治疗为主要治疗手段,抗抑郁药物主要通过抑制mao活性来 达到抗抑郁的效果,从而对抑郁症进行治疗。吗拉贝胺(malabemide,mla, 已申请专利201710725730.1,201710191955.3)是以吗氯贝胺和拉扎贝胺为先 导化合物,运用生物电子等排原理和拼合原理设计并合成出的一种具有酰胺基 团的新型化合物,吗拉贝胺在高温度、高湿度以及光照环境下均能保持稳定状 态。
6.mla虽然具有良好的稳定性,并和目前被报导的抗抑郁药物一样,拥有 对mao的活性有抑制作用的酰胺基结构,但缺乏一种方法对mla的抗抑郁 活性进行测定。


技术实现要素:

7.本发明提供了一种斑马鱼抑郁模型的建立及吗拉贝胺抗抑郁活性的测定 方法,本发明的目的在于,提供一种检测mla抗抑郁活性的方法。
8.本发明首先涉及一种斑马鱼抑郁模型的建立及吗拉贝胺抗抑郁活性的测 定方法,操作步骤如下:
9.s1.培育试验用鱼:在水温28
±
0.5℃,光周期(8:00a.m.—20:00p.m.光照) 环境下驯养斑马鱼14天;
10.s2.建立斑马鱼抑郁模型:随机选取204尾体长相似、体重为0.4
±
0.03g 的斑马鱼雌性成鱼,随机分成4组,每组51尾鱼,然后用不同浓度的吗拉贝 胺暴露斑马鱼,暴露28天;
11.s3.记录斑马鱼行为:斑马鱼暴露期结束后,每组取15尾鱼放到透明鱼缸 内,1尾鱼对应一只鱼缸,相邻鱼缸间蒙有白纸,鱼缸内加有10cm深的脱氯 自来水,距鱼缸底部5cm
处画有线,然后从侧面用高清相机拍摄斑马鱼从放 入鱼缸中开始15min内的游动视频,分析相关数据,并进行统计检验;
12.s4.解剖取材:材料1,从步骤s2暴露结束的4组鱼中分别取若干条鱼, 并擦干鱼表面的水分,然后断头取血,同组3尾鱼的等量血浆混合为一个平行 样本,每组设置多个平行样本,然后用抗凝毛细血管吸取血液,于冷冻离心机 4℃离心15min,转速13000rpm,之后取出上清液于

20℃保存备用;
13.材料2,用高温灭菌后的解剖器材取出材料1取血后的斑马鱼全部脑组织, 同组3尾鱼的脑混合为一个平行样本,每组设置多个平行样本,放入预冷的离 心管中;
14.材料3,用高温灭菌后的解剖器材取出材料1取血后的斑马鱼全部脑组织, 放入预冷装有1ml triol的无酶离心管中,每3尾鱼的脑混合为一个平行样本, 每组设置有多个平行样本;
15.s5.物质检测:取出步骤s4制备的材料,检测mao的活性,检测神经递 质5

ht、da、cortisol的含量;
16.s6数据分析:用spss软件分析步骤s5测得的数据,进行差异性分析。
17.进一步,步骤s2中,吗拉贝胺的浓度分别为0mg/kg/d、25mg/kg/d、 50mg/kg/d和100mg/kg/d,吗拉贝胺均用丙酮进行溶解,与饲料混匀后通风, 饲料为斑马鱼体重的1.5%。
18.进一步,步骤s3中,在检测斑马鱼行为之前,先对斑马鱼禁食12h。
19.进一步,步骤s3中的相关数据:包括斑马鱼从底部到跨越中线所用的时 间;斑马鱼在上层水体逗留的总时间;斑马鱼在15min内从底部跨越中线的 总频次;斑马鱼在水体中悬停的次数;斑马鱼在水体中悬停的总时间。
20.进一步,步骤s4制备材料2和材料3的过程中,取出的脑组织需立即放 入液氮速冻,然后置于

80℃超低温冰箱中备用。
21.与现有技术相比,本发明的有益效果是:
22.1、本发明方法可通过药物处理后斑马鱼的行为变化,斑马鱼脑组织中 mao活性、神经递质5

ht和da的含量、应激激素cortisol水平直接测定 mla的抗抑郁活性,直观准确,并从分子的水平探讨了mla抗抑郁的内在 分子机理,并对mla的毒性、抗抑郁效应进行了探讨,为后续的研究提供了 方向和理论基础。
23.2、本发明方法取健康雌性成鱼脑组织进行匀浆,检测mla在体外实验 中对mao活性的抑制作用,为抑郁/抗抑郁模型的构建提供了理论基础。
24.3、本发明方法用不同浓度的mla暴露斑马鱼胚胎,进一步检测了mla 对斑马鱼胚胎的抗抑郁效果,检测了mla对斑马鱼胚胎抗抑郁作用最大的浓 度。
附图说明
25.图1为本发明斑马鱼行为学拍摄实验示意图;
26.图2为本发明ml、mla和r暴露后对斑马鱼抑郁行为的影响;
27.图3为本发明ml、mla和r暴露后对斑马鱼脑中mao活性的影响;
28.图4为本发明ml、mla和r暴露后对斑马鱼脑中5

ht含量的影响;
29.图5为本发明ml、mla和r暴露后对斑马鱼脑中da含量的影响;
30.图6为本发明ml、mla和r暴露后对斑马鱼血清中cortisol含量的影 响。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明:
32.实施例一
33.一种斑马鱼抑郁模型的建立及吗拉贝胺抗抑郁活性的测定方法,先准备实 验所需的材料:1.实验动物,从国家斑马鱼资源中心购买的ab系斑马鱼作为 亲本繁殖的f2代雌性成鱼(4月龄)306尾,作为抑郁模型实验用鱼。
34.2.实验仪器与试剂
35.表1实验仪器
[0036][0037]
表2实验试剂
[0038][0039]
材料准备好后,进行实验测定,操作步骤如下:
[0040]
s1.培育试验用鱼:用28
±
0.5℃的脱氯自来水(水质:ph为6.9~7.2;总 硬度为53.7~71.6mg/l caco3)驯养斑马鱼14天,饲养条件:水温28
±
0.5℃, 光暗比12:12h(8:00a.m.—20:00p.m.光照),用斑马鱼商业饲料(产自山东 升索有限公司)进行喂食,每天喂食3次,日喂食量为平均体重的1.5%
[0041]
s2.建立斑马鱼抑郁模型:随机选取204尾体长相似、体重为0.4
±
0.03g 的斑马鱼雌性成鱼,随机分成4组,每组51尾鱼,然后分别用浓度为0mg/kg/d、 25mg/kg/d、50mg/kg/d和100mg/kg/d的mla对斑马鱼进行暴露,对照组 (control,0mg/kg/d)、mla

l组(25mg/kg/d)、mla

m组(50mg/kg/d)、 mla

h(100mg/kg/d),暴露过程中,吗拉贝胺均用丙酮进行溶解,和饲料 混匀后放在通风橱中,使丙酮充分挥发备用,连续暴露28天。实验所用的斑 马鱼全部饲养于50cm
×
25cm
×
30cm的透明玻璃水缸内,以sb

948氧气泵 提供氧气,用泵气后的养鱼水浸泡,每天换水一次(20l);每天固定时间进 行喂食。
[0042]
s3.记录斑马鱼行为:于斑马鱼暴露结束期的前一天,准备15个大小相同 (25cm
×
19cm
×
16cm)的透明新鱼缸,距离鱼缸底部5cm处画线,如图1 所示,相邻的鱼缸之间蒙有白纸;在检测斑马鱼的行为之前,先对斑马鱼禁食 12h,次日9:00a.m.,向每个鱼缸加脱氯自来水,加至最高水位10cm,然后 将待测斑马鱼放到鱼缸内,1尾鱼对应一只鱼缸,之后从侧面50cm外,用高 清相机(a7m3 nikon)拍摄斑马鱼从放入鱼缸中开始15min内的游动视频, 并分析相关数据:如斑马鱼从底部到跨越中线所用的时间,斑马鱼在上层水体 逗留的总时间,斑马鱼在15min内从底部跨越中线的总频次,斑马鱼在水体 中悬停的次数,斑马鱼在水体中悬停的总时间;最后进行统计检验。
[0043]
s4.解剖取材:用步骤s2视频拍摄外的斑马鱼进行解剖取材。
[0044]
材料1,从步骤s2暴露结束的4组鱼中分别取9鱼,并擦干鱼表面的水 分,然后断头取血,同一组3尾鱼的等量血浆混合为一个平行样本,每组设置 3个平行样本,然后用抗凝毛细血管吸取血液于准备好的离心管中,放入冻离 心机4℃离心15min,离心机转速13000rpm,之后取出上清液于

20℃保存备 用;
[0045]
材料2,用高温灭菌后的解剖器材取出材料1取血后的斑马鱼全部脑组织, 放入预冷的离心管中,同组3尾鱼的脑混合为一个平行样本,每组设置3个平 行样本,取出的脑组织需立即放入液氮速冻,然后置于

80℃超低温冰箱中备 用;
[0046]
材料3,用高温灭菌后的解剖器材取出材料1取血后的斑马鱼全部脑组织, 放入预冷装有1ml triol的无酶离心管中,每3尾鱼的脑混合为一个平行样本, 每组设置有3个平行样本,取出的脑组织需立即放入液氮速冻,然后置于

80℃ 超低温冰箱中备用。
[0047]
s5.物质检测:取出步骤s4制备的材料进行检测。
[0048]
1、mao的活性检测:分别提取出暴露后雌性斑马鱼脑组织(指步骤s4 制备的材料2),从材料1中提取mao粗酶液,并在562nm波长处检测样品 的od值,根据mao活性检测试剂盒说明书(南京建成)的公式计算出mao 的活性。计算公式如下:
[0049]
mao(nmol/min/mg prot)=3333a
÷
cpr
[0050]
2、5

ht含量的检测
[0051]


80℃冰箱中取出材料2,放在冰盒上进行解冻,并对斑马鱼脑组织进行 称重,然后在每个离心管中放入5个灭菌后的钢珠,并加入9倍体积的生理盐 水进行冰浴匀浆。以低温3000rpm,离心10min为离心条件,将匀浆后的组 织液放在冷冻离心机上进行离心,之后取上清液作为备用。
[0052]
把5

ht检测试剂盒(上海优选)从以4℃为恒温状态的冰箱中取出,置 于室温下平衡。取出所需板条,向标准孔中加入浓度依次为0、7.5、15、30、 60、120pg/ml的标准品50μl,样品孔中先加10μl待测样品,再加入40μl 的样品稀释剂,然后分别向标准孔和样品孔中各加100μl辣根过氧化物(hrp) 标记过的检测抗体。
[0053]
剪下合适大小的封板膜进行封板,放在37℃的恒温箱中孵育1h,然后将 液体甩干,并加满洗涤液于各个孔,静置1分钟后再次甩干液体,此操作重复 5次后,向各个孔中加入各50μl的a、b底物,然后于37℃恒温箱中进行15 分钟的温育。向每个孔中加入50μl的终止液,孔内液体的颜色由蓝色变为黄 色,用多功能酶标仪(瑞士tecan)在15min内测450nm下每个孔的吸光度 (od值),并根据标准曲线计算出5

ht的含量。
[0054]
3、da含量的检测
[0055]


80℃冰箱中取出材料2,放在冰盒上进行解冻,将斑马鱼脑组织进行称 重后,在每个离心管中放入5个灭菌后的钢珠,并加入9倍体积的生理盐水进 行冰浴匀浆。以低温3000rpm,离心10min为离心条件,将匀浆后的组织液 放在冷冻离心机上进行离心,之后取上清液作为备用。
[0056]
把5

ht检测试剂盒(上海优选)从以4℃为恒温状态的冰箱中取出,置 于室温下平衡。取出所需板条,向标准孔中加入浓度依次为0、7.5、15、30、60、120pg/ml的标准品50μl,样品孔中先加10μl待测样品,再加入40μl 的样品稀释剂,然后分别向标准孔和样品孔中各加100μl辣根过氧化物(hrp) 标记过的检测抗体。
[0057]
剪下合适大小的封板膜进行封板,放在37℃的恒温箱中进行孵育1h后。 将液体甩干,并加满洗涤液于各个孔,静置1min后再次甩干液体,此操作重 复5次后,向各个孔中加入各50μl的a、b底物,然后进行15分钟的温育 于37℃恒温箱中。向每个孔中加入50μl的终止液,孔内液体的颜色由蓝色 变为黄色,用多功能酶标仪(瑞士tecan)在15min内测450nm下每个孔的 吸光度(od值),并根据标准曲线计算出da的含量。
[0058]
4、cortisol含量的检测
[0059]
取出材料1,用cortisol测定试剂盒(上海优选)检测血浆中cortisol的 含量。具体操作步骤为:取150μl原倍标准品进行稀释,得到浓度梯度依次 为2400、1200、600、300、150pg/ml的标准品,根据说明书上的操作步骤, 利用多功能酶标仪(瑞士tecan)检测各孔在450nm波长下的吸光度(od值), 绘制标准曲线。
[0060]
取30倍浓缩洗涤液1ml,加入29ml的蒸馏水进行稀释,摇匀备用。在 酶标包被板上准确加入样品稀释液40μl,再加待测样品10μl,轻轻晃动使 样品混匀。用封板膜封板后放置于37℃温箱中温育30min。从37℃温箱中取 出酶标板,小心揭掉封板膜,弃去液体,每孔加1.5ml洗涤液,静止30s后 弃去,重复此操作5次,弃去洗涤液。随后,每孔加入酶标试剂50μl,37℃ 温育30min。洗涤酶标板后,每孔先分别加入显色剂a 50μl,再加入显色剂 b 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10min,每孔加入终止液50μl,终止 反应。随后,利用多功能酶标仪(瑞士team)在450nm波长下检测各孔的吸 光度(od值)。
[0061]
s6数据分析:使用spss 20.0软件(spss,chicago)进行分析,数据以 mean
±
sem方差分析表示,差异性比较采用单因素方差分析和tukey极差 检验,并应用graphpad prism6(graphpad software usa)软件绘制柱形图,p<0.05代表有显著性差异,p>0.05代表无显著性差异。
[0062]
对比例一
[0063]
从s1中随机选取51尾与s2体型相同的鱼,以ml为阳性对照药物,建 立ml组斑马鱼模型,其余操作与实施例一相同,进一步探讨mla的抗抑郁 活性。
[0064]
吗氯贝胺(moclobemide,ml),其化学名称是4



n

[2

(4

吗啉基乙 基)]苯甲酰胺,是一种白色或是类白色结晶性粉末。该药物的主要功效是依 靠可逆性对人体大脑种的a型单胺氧化酶进行有效抑制,由此扩大大脑中的 da、5

ht以及ne的含量程度,发挥有效缓解抑郁症的效果。
[0065]
对比例二
[0066]
从s1中随机选取51尾与s2体型相同的鱼,以r为阳性对照药物,建立 r组斑马鱼模型,其余操作与实施例一相同,进一步探讨吗拉贝胺抗的抑郁活 性。
[0067]
利血平(reserpine,r),主要是由蛇纹石内提取出来的一类天然植物生 物碱,依靠对囊泡中单胺转运体进行完全切断,由此实现单胺的消耗,其把递 质遗留于囊泡外部,让其更加容易、更加有效地被单胺氧化酶进行分解、消耗, 由此不断降低多巴胺等神经递质的含量,造成生物体出现生理和行为两方面的 明显改变。利血平具有降低血压和减慢心率的作用,可用于降压和镇静的,但 长期使用这些药物会导致抑郁症。
[0068]
数据分析
[0069]
对实施例一、对比例一和对比例二测得的数据进行分析,ml、mla和r 暴露后对斑马鱼抑郁行为的影响,如图2所示,首次上浮时间(a)、越过中 线的次数(b)、冻结时间(c)、
冻结次数(d)、中线以上时间(e)。与 对照组相比,ml组斑马鱼潜游期显著降低,r组和mla组的斑马鱼潜游期 与对照组相比无显著性变化,但随着mla浓度的增大,潜游期出现降低的趋 势。与对照组相比,r组斑马鱼越过中线的次数显著降低,ml组斑马鱼越过 中线的次数与对照组相比无显著性差异,mla组斑马鱼越过中线的次数随着mla剂量的递增呈现明显增多的趋势。r组斑马鱼冻结时间显著增长,ml 组斑马鱼冻结时间显著降低,低剂量mla组斑马鱼冻结时间出现降低的趋势, 且随着mla剂量的递增,mla组斑马鱼冻结时间呈现明显的降低趋势。r 组斑马鱼冻结次数显著增长,ml组斑马鱼冻结次数显著降低。低剂量mla 组冻结次数与对照组相比无显著差异,但随着mla剂量的递增,斑马鱼冻结 次数出现明显的降低趋势,呈现剂量依赖性关系。与对照组相比,r组斑马鱼 中线以上总时间显著降低,ml组斑马鱼中线以上时间显著增高,低剂量的 mla组中线以上时间出现增高的趋势,且随着mla剂量的递增,斑马鱼中 线以上总时间出现明显的增高趋势。
[0070]
ml、mla和r暴露后对斑马鱼脑中mao活性的影响,如图3所示,与 对照组相比,r组斑马鱼脑内mao的活性显著升高,ml组斑马鱼脑内mao 的活性显著降低,mla组斑马鱼脑内mao的活性随着mla浓度的升高呈剂 量依赖性降低的趋势。
[0071]
ml、mla和r暴露后对斑马鱼脑中5

ht含量的影响,如图4所示,与 对照组相比,ml暴露后的斑马鱼脑内5

ht的含量显著升高,r组斑马鱼脑 内5

ht的含量显著降低,mla组斑马鱼脑内5

ht的含量随着mla浓度的 升高呈剂量依赖性升高的趋势,并在高剂量组时显著升高。
[0072]
ml、mla和r暴露后对斑马鱼脑中da含量的影响,如图5所示,与对 照组相比,ml暴露后的斑马鱼脑组织中da的含量显著升高,r组斑马鱼脑 组织中da的含量显著降低,mla组斑马鱼脑组织中da的含量随着mla浓 度的升高呈剂量依赖性升高的趋势,并在高剂量组时显著升高。
[0073]
ml、mla和r暴露后对斑马鱼血清中cortisol含量的影响,如图6所示, 与对照组相比,ml暴露后的斑马鱼血清中cortisol的含量显著降低,r组 cortisol的含量显著升高,mla暴露后的斑马鱼血清中cortisol的含量随着 mla浓度的升高呈降低的趋势,并在高剂量组时显著降低。
[0074]
综上所述,可知ml和mla均能抑制mao的活性,升高5

ht和da 的含量,降低皮质醇水平,使斑马鱼出现欣快行为。与之相反,r能升高mao 的活性,降低5

ht和da的含量,升高皮质醇水平,使斑马鱼出现抑郁样行 为,故可使用r构建抑郁模型,进而探讨mla的抗抑郁机理。
[0075]
以上所述的仅是本发明的实施例,方案中公知的具体结构及特性等常识在 此未作过多描述。应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明结 构的前提下,还可以作出若干变形和改进,这些也应该视为本发明的保护范围, 这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应 当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权 利要求的内容。
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