本发明涉及动物组织包埋技术领域，具体地说，涉及一种制备全脑组织石蜡切片的方法与应用。
背景技术：
脑作为最重要的组织器官之一，一直以来是生物医学研究的重点与难点。许多疾病与脑组织的病变有关，例如一些神经退行性疾病脑损伤(bi)、阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)等，目前的医学技术对一些脑部疾病仍然束手无策。病理切片是观察病理变化，作出病理诊断，为临床诊断和治疗提供帮助的有效手段。如何获得高质量的病理切片就变得至关重要。
影响切片制作质量的因素很多，包括取材、固定液的选择、切片的存储等。固定是切片制作的关键步骤之一，固定液的选择极其重要，只有在固定过程中对样品进行良好的处理才能保证获得高质量的切片。
目前在脑组织的固定中常常使用4％甲醛作为固定液。但在胚胎发育的不同时期，由于脑的组织形态变化快速，仅以该固定液对胚胎所有时期的脑组织进行固定，效果并不理想。而在其他组织切片制作过程中固定液的使用主要还有carnoy固定液、添加一定量戊二醛固的4％甲醛固定液等。但由于动物组织固定时，不同组织的生理学特性差异巨大，尤其是脑组织结构主要是神经细胞和神经胶质细胞，具有含水较丰富、质地较软、结构疏松、韧性低、极易自溶等独有的特点，因此也无法直接借鉴现有固定其他组织的方案。
鉴于切片在研究脑病理变化中的重要作用，如果能够找到一种适合各个时期胚胎脑组织的固定液和切片制作方法将有很大的实际意义，对于更好的研究脑部发育或者相关病理情况大有裨益。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种能够适合胚胎发育不同时期的脑组织的固定液及切片制作方法，以解决因胚胎脑组织固定不理想等问题所导致的切片质量不佳的问题。
为了实现本发明的发明目的，本发明的技术方案如下：
一种制备全脑组织石蜡切片的方法，在固定步骤所采用的固定液为含3.8-4.2％的甲醛和0.9-1.1％的戊二醛的固定液。
优选，所述固定液为含4％的甲醛和1％的戊二醛的固定液。
本发明根据全脑组织的生理学和结构特性，尤其是关注各胚胎发育时期全脑组织变化，经研究发现了一种可获得各发育时期效果理想的石蜡切片的固定液及石蜡切片制备方法。
本发明中，在脱水步骤，用于脱水的乙醇浓度梯度依次为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％。
本发明中，所述脱水步骤具体为：以20％的乙醇处理55-65分钟，以30％的乙醇处理55-65分钟，以40％的乙醇处理55-65分钟，以50％的乙醇处理55-65分钟，以60％的乙醇处理55-65分钟，以70％的乙醇处理9-10小时，以80％的乙醇处理55-65分钟，以90％的乙醇处理55-65分钟，以95％的乙醇处理55-65分钟，以无水乙醇处理28-32分钟，再以更换后的无水乙醇再次处理28-32分钟。
优选，所述脱水步骤具体为：以20％的乙醇处理1小时，以30％的乙醇处理1小时，以40％的乙醇处理1小时，以50％的乙醇处理1小时，以60％的乙醇处理1小时，以70％的乙醇处理10小时，以80％的乙醇处理1小时，以90％的乙醇处理1小时，以95％的乙醇处理1小时，以无水乙醇处理0.5小时，再以更换后的无水乙醇再次处理0.5小时。
本发明在研究时发现，由于鸡胚胎脑发育很快，组织结构变化迅速，加上含水与含脂较多，常规甲醛固定方法效果并不好。详细而言，鸡胚胎发育的时间只有21天，在整个发育过程中脑的发育伴随着快速的变化，如经观察发现在孵化的第8天、12天、18天脑的大小就发生了显著的变化，重量明显增多(参见图5和图6)。在第8天鸡胚胎脑的整体组织结构并没有发育完全，全脑切片甚至观察不到小脑结构，而在第12天时就观察到了小脑结构。此外，鸡胚胎在发育过程中会经历两次关键的呼吸模式的改变，第一个在孵化前期，包括孵化期4-10天，胚胎快速发育并发生显著的形态学变化以及各种胎膜开始形成；另一个在孵化后期，位于孵化期15-20天，胚胎呼吸产生由尿囊呼吸到肺呼吸的转变，这是一个主要的生理转折点。呼吸方式的改变会影响机体氧气的供应，而脑组织却是高耗氧的，势必影响其发育。以上原因的存在会导致鸡胚胎发育不同时期脑组织的明显差异，这为找到一种可同时适用于制作不同鸡胚胎时期的脑组织的切片方法增加了难度。
而且，本领域公知脱水时，低浓度酒精可以使组织收缩减少，更好切；高浓度酒精可使组织脱水更彻底，以保证组织的透明度和切片形态。但在针对特定组织时，如何找到一种既省时、又理想的脱水方式，仍是需要进行反复摸索研究的。
一般认为柔软的组织(如，脑)在95％的乙醇处理时停留时间要长，才能保证切片效果，但本发明经大量研究发现，以本发明的特定固定液，配合目前调整后的脱水浓度梯度和处理时间，既可实现各时期脑部切片的理想观察效果。
本发明在固定时，先将全脑组织在固定液中固定2.8-3.2小时，之后再从全脑组织正中线切开，继续固定至23.5-24.5小时。
优选，在固定时，先将全脑组织在固定液中固定3小时，之后再从全脑组织正中线切开，继续固定至24小时。
本发明经研究发现，将固定步骤分为两个阶段，先进行初步固定，再使用刀片从全脑正中线小心切开后继续进行固定，可使固定液充分、快速渗入脑组织，避免细胞肿胀或塌陷，保证后续切片的效果。
切开时所使用的刀片不限于锋利的剃须刀，只要是足够锋利，不损伤组织的刀片工具均可。
本发明中，全脑组织来自于鸡不同胚胎时期。
取材的时期包括但不限于鸡胚胎发育的第8、12、18天。
作为一个具体实施方式，本发明的制作不同胚胎时期全脑石蜡切片的方法，具体包括样本取材、固定液固定及固定时的样本处理、石蜡切片的制作及切片的he染色等，其中样本取材及固定处理包括以下步骤：
(1)完整取出不同胚胎发育阶段的全脑；
(2)将取出的全脑小心放入固定液中固定；
(3)固定3h后用锋利的剃须刀片将脑组织从正中线小心切开；
(4)继续固定至24小时后进行梯度乙醇脱水。
本发明另提供一种上述方法在全脑组织he染色和免疫荧光实验中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明利用特定固定液固定胚胎发育不同时期脑组织，配合脱水等步骤，可以很好的获得满足相关实验要求的切片。并且不需要额外的特殊处理就能解决脑快速发育过程中因固定不佳导致的切片质量不高的问题，保证了后续实验结果的可靠性。本发明方法无论是组织的完整性、细胞的基本形态、he染色后的效果等，均实现了理想的效果。通过本发明获得的脑组织石蜡切片为下一步对脑组织进行he染色、免疫荧光等实验提供了高质量的保证，也为研究胚胎时期脑的发育以及有关神经疾病的临床诊断提供了符合要求的切片，具有重要的科学意义。本发明制备全脑组织石蜡切片的方法还可适用于非疾病诊断目的，例如，法医学检验等。
附图说明
图1为本发明以实施例1方法处理后的不同时期脑组织的he染色结果。上下两行照片分别表示不同时期脑组织同一区域不同视野；其中，第一行为20倍镜下的观察结果，比例尺代表180μm；第二行为40倍镜下的观察结果，比例尺代表90μm。
图2为本发明对比例1方法处理后的不同时期脑组织的he染色结果。上下两行照片分别表示不同时期脑组织同一区域不同视野；其中，第一行为20倍镜下的观察结果，比例尺代表180μm；第二行为40倍镜下的观察结果，比例尺代表90μm。
图3为本发明对比例2方法处理后的不同时期脑组织的he染色结果。上下两行照片分别表示不同时期脑组织同一区域不同视野；其中，第一行为20倍镜下的观察结果，比例尺代表180μm；第二行为40倍镜下的观察结果，比例尺代表90μm。
图4为本发明对比例3方法处理后的不同时期脑组织的he染色结果。上下两行照片分别表示不同时期脑组织同一区域不同视野；其中，第一行为20倍镜下的观察结果，比例尺代表180μm；第二行为40倍镜下的观察结果，比例尺代表90μm。
图5为不同时期的鸡全脑照片。
图6为不同时期的鸡全脑重量统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种本发明的制作鸡不同胚胎时期全脑石蜡切片的方法，按照以下步骤具体实施：
样本的取材及处理方法：
1、在鸡胚胎发育的第8、12、18天，分别收集鸡脑组织，要求为完整的、未损伤的脑组织，为了保证取样的完整性，在发育早期直接取脖子以上的整个部分。
2、将取好的样本分别小心的浸泡固定于固定液中，固定液的体积大约是样本体积的10倍。
所述固定液(1％戊二醛 4％甲醛固定液)由市售甲醛(40％)100毫升、市售戊二醛(25％)40毫升、pbs溶液860毫升混合搅拌均匀组成。
3、固定液固定3小时后，小心取出样本，利用锋利刀片沿脑正中线将样本分为左右两部分后，重新放入固定液中继续固定至24小时。
石蜡切片的制作：
1、将上述固定后的样本取出进行梯度乙醇脱水，具体过程见表1，脱水完成后以二甲苯：乙醇(1:1)处理1小时进行透明。采用乙醇ⅰ、ⅱ标记表示以乙醇梯度脱水处理过程中同一浓度的乙醇溶液多次处理，乙醇ⅰ、ⅱ分别表示第n次处理，每次处理完成以后需更换新鲜溶液进行后续处理。
表1
2、将脱水、透明后的样本进行浸蜡，总共进行三次浸蜡，每次1小时。用石蜡包埋机在温度为63℃下包埋组织。
3、采用轮转式石蜡切片机切片，使用多聚赖氨酸处理的载玻片以防止组织切片脱片。
he染色、封片过程：
1、将上述步骤获得的切片取出后进行脱蜡处理，首先以二甲苯处理2次，每次10分钟；
2、无水乙醇处理2分钟；
3、95％乙醇处理2分钟；
4、80％乙醇处理2分钟；
5、利用苏木素染色10分钟；
6、1％的盐酸酒精溶液(100毫升95％酒精 1毫升浓盐酸)分化10-15秒，此时切片由蓝变红；
7、自来水返蓝20-25分钟，此时切片由红变蓝；
8、蒸馏水洗1分钟；
9、0.5％伊红处理30秒；
10、95％乙醇处理1分钟；
11、无水乙醇处理1分钟；
12、二甲苯透明处理1分钟；
13、中性树脂封片。
对比例1
本对比例提供一种制作鸡不同胚胎时期全脑石蜡切片的方法，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，所述固定液为4％甲醛固定液，由市售甲醛(40％)100毫升和pbs溶液900毫升，混合搅拌均匀组成。
对比例2
本对比例提供一种制作鸡不同胚胎时期全脑石蜡切片的方法，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，所述固定液为2％戊二醛 4％甲醛固定液，由市售甲醛(40％)100毫升、市售戊二醛(25％)80毫升、pbs溶液820毫升混合搅拌均匀组成。
对比例3
本对比例提供一种制作鸡不同胚胎时期全脑石蜡切片的方法，其与实施例1的方法相同，区别仅在于，所述固定液为carnoy固定液(市售)，由乙醇、氯仿和乙酸按照6:3:1的比例混合而成。
实验例1
对实施例1和对比例1-3制作而成的切片进行观察。四种固定液固定后脑组织的he染色结果，分别依次如图1、图2、图3、图4所示，从图中结果可以看出在不同时期实施例1的固定液效果均为最好，组织完整，细胞形态正常，整体效果更好。carnoy固定液(对比例3)处理后脑整体缩小严重，组织皱缩，细胞呈现脱水严重，原始形态发生改变，4％甲醛固定液(对比例1)处理后组织发生破裂，细胞间出现空洞，虽然细胞形态正常，但整体组织不完整。2％戊二醛 4％甲醛(对比例2)的固定液处理后虽然较对比例1效果有所改善，但与实施例1相比细胞间还是存在较多空洞，整体效果较差一些。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
1.一种制备全脑组织石蜡切片的方法，其特征在于，在固定步骤所采用的固定液为含3.8-4.2％的甲醛和0.9-1.1％的戊二醛的固定液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定液为含4％的甲醛和1％的戊二醛的固定液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在脱水步骤，用于脱水的乙醇浓度梯度依次为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脱水步骤具体为：以20％的乙醇处理55-65分钟，以30％的乙醇处理55-65分钟，以40％的乙醇处理55-65分钟，以50％的乙醇处理55-65分钟，以60％的乙醇处理55-65分钟，以70％的乙醇处理9-10小时，以80％的乙醇处理55-65分钟，以90％的乙醇处理55-65分钟，以95％的乙醇处理55-65分钟，以无水乙醇处理28-32分钟，再以更换后的无水乙醇再次处理28-32分钟。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脱水步骤具体为：以20％的乙醇处理1小时，以30％的乙醇处理1小时，以40％的乙醇处理1小时，以50％的乙醇处理1小时，以60％的乙醇处理1小时，以70％的乙醇处理10小时，以80％的乙醇处理1小时，以90％的乙醇处理1小时，以95％的乙醇处理1小时，以无水乙醇处理0.5小时，再以更换后的无水乙醇再次处理0.5小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在固定时，先将全脑组织在固定液中固定2.8-3.2小时，之后再从全脑组织正中线切开，继续固定至23.5-24.5小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在固定时，先将全脑组织在固定液中固定3小时，之后再从全脑组织正中线切开，继续固定至24小时。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，全脑组织来自于鸡不同胚胎时期。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在全脑组织he染色和免疫荧光实验中的应用。
技术总结