本发明涉及再造烟叶中碳酸钙含量分析技术领域，具体涉及一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法。
背景技术：
再造烟叶(reconstitutedtobacco)是利用烟末、烟梗、碎烟片等烟草物质为原料制成片状或丝状的再生产品，用作卷烟填充料。在卷烟中加入造纸法再造烟叶，不仅可以充分利用烟叶资源，降低生产成本，还能有效降低卷烟焦油量，是提高卷烟安全性的有效途径。造纸法再造烟叶生产过程主要包括萃取、浓缩、制浆、抄造和涂布、干燥等主要工艺，生产中通常添加一定量的碳酸钙以提高灰分含量，以提高其物理性能，如吸液性能、外观性能等。因此准确快速测定再造烟叶中碳酸钙的含量，便于评价其产品外观、烟气情况等。目前测定碳酸钙的主要方法有络合滴定法、电位滴定法、连续流动法和离子色谱法。其中，络合滴定法和电位滴定法的测定过程繁琐，容易引入人为误差；离子色谱法和连续流动法均是测定酸溶性总钙的质量分数，而再造烟叶中钙元素以多种形态共存（水溶性无机钙、有机酸钙、磷酸钙、草酸钙和碳酸钙），不同形态的钙在酸溶液中有时会共溶出，所以这两种方法无法准确反映样品中碳酸钙的质量分数。
中国专利【cn102830174a】公开了一种快速鉴别造纸法再造烟叶碳酸钙含量的方法，将再造烟叶固定在装有酸溶液的样品槽中，样品槽的一侧装有超声波发射器，另一侧装有超声波接收器，使超声波发射器发射的超声波穿过再造烟叶，并被超声波接收器接收，通过检测超声波接收器接收的信号衰减值，即可鉴别再造烟叶中碳酸钙含量高低。该方法的问题在于不能准确的得到碳酸钙的具体含量，而且没有考虑烟草本身所含有的碳酸根影响。
中国专利【cn102901791a】公开了一种再造烟叶中碳酸钙含量的测定方法，先用过量的乙酸溶液萃取再造烟叶，利用现代分析方法测定其总钙离子含量，然后在同样条件下，分析去离子水萃取的再造烟叶中游离钙离子含量，利用两者的差值计算再造烟叶中碳酸钙含量。该方法的问题在于再造烟叶中含有大量的不溶于水但溶于乙酸的果胶酸钙，测定结果将果胶酸钙中的钙计算为碳酸钙，使得测定结果偏高。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，该方法向再造烟叶的水提取液中加入碳酸酐酶，再通入co2，置于冰浴中振荡，使其与碳酸钙反应生成可溶性的碳酸氢钙，过滤稀释，采用原子吸收法测定其ca2 的吸光度，带入标准工作曲线得出ca2 的浓度，然后通过公式计算得出ca2 的含量。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、将再造烟叶磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末置于反应器中，加入去离子水，再加入碳酸酐酶，然后通入co2进行反应，反应完成后封闭反应器，置于冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c；
所述标准工作曲线的制作方法：配制不同浓度的ca2 标准溶液，采用原子吸收分光光度计测量不同浓度ca2 的吸光度，然后以ca2 浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线；
s4、空白样品中ca2 浓度c0的计算方法：称取步骤s1中准备的烟末置于反应器中，加入去离子水，再加入碳酸酐酶进行反应，反应完成后封闭反应器，置于冰浴中振荡，然后过滤，得到空白待测液，将空白待测液用冰水稀释后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出空白待测液中ca2 的浓度c0；
s5、再造烟叶中碳酸钙的含量按照下式计算得出：
上式中：
x——再造烟叶中碳酸钙的含量，单位为微克每克（μg/g）；
c——由标准工作曲线得出的目标物的浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；
c0——由标准工作曲线得出的空白样品中目标物浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；
v——萃取液体积，单位为毫升（ml）；
f——稀释因子；
m——试样质量，单位为克（g）；
100——caco3的式量；
40——ca2 的式量。
进一步的，所述步骤s2和s4中烟末、去离子水与碳酸酐酶的质量比为（2000-4000）：（500000-1000000）：1。
进一步的，所述步骤s2中通入co2的时间为20~60min，通入co2的流速为0.5~2.0ml/min。
进一步的，所述步骤s2和s4中冰浴温度为0~4℃。
进一步的，所述步骤s2和s4中震荡时间为20~60min。
进一步的，所述步骤s3中待测液与所述步骤s4中空白待测液均用冰水稀释90-110倍。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，向再造烟叶的水提取液中通入co2，不仅能够将目标物碳酸钙变成碳酸氢钙提取出来，同时可以避免再造烟叶中其它钙盐（磷酸钙、草酸钙以及硫酸钙）的溶出，提取准确度高，可靠性强。该方法具有干扰小、灵敏度高、无试剂污染等特点，能够应用于多种钙盐混合体系中碳酸钙含量的测定。
2.本发明提供的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，通过加入碳酸酐酶可以催化co2水化反应，使它在生理ph值条件（ph值≌7）下很快进行，加快碳酸氢根转化速率，从而提高检测速率。
3.本发明提供的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，采用冰浴振荡，能使碳酸钙与co2的反应体系维持一个较低温度，不仅可以增大co2在水中的溶解度，还可以保证碳酸氢钙的稳定性。
附图说明
图1是本发明实施例中一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法的流程图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例和现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。
显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式，本发明并不限制于该实施例。
本发明实施例中：仪器操作条件：波长：422.7nm；灯电流：10ma；乙炔流量：2.0l/min；空气流量：10l/min。
本发明具体实施例如下：
实施例1
标准曲线的制作：
准备浓度为0.1mg/l、1.0mg/l、2.0mg/l、3.0mg/l、4.0mg/l、5.0mg/l的六个梯度的钙离子标准溶液，采用原子吸收分光光度计测量这六个标准溶液的ca2 的吸光度，然后以ca2 浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，并计算线性方程。得线性方程y=0.0433x 0.0003，其中，y为吸光度，x为ca2 浓度，相关系数为0.9997，相关系数接近1，说明误差小，这表明在0.1～5.0mg/l范围内，工作曲线具有很好的线性拟合关系。后期通过线性方程带入吸光度便可直接得出待测液中ca2 浓度。
检出限和定量限：
检出限：分析方法在规定实验条件下所能检出被测组分的最低浓度或最低量。
定量限：分析方法可定量测定样品中待测组分的最低浓度或最低量。
以0.1mg/l钙离子标准溶液为分析对象，采用原子吸收分光光度计测量八次，将八次测量结果带入标准曲线得出对应的ca2 浓度，然后计算测定值的标准偏差，以3倍标准偏差换算结果作为方法的检出限（lod），以10倍标准偏差换算结果作为方法的定量限（loq），结果如表1。
表1检出限和定量限
由表1可知，标准偏差为0.00529，标准偏差越小，表明测定值与平均值相差越小，说明该标准曲线计算得出的准确性越高。检出限（lod）为0.01586mg/l，相当于0.9911mg/g，说明该方法能检出的最小浓度为0.9911mg/g。定量限（loq）为0.05286mg/l，相当于3.3035mg/g，说明该方法能用于检测的最低浓度为3.3035mg/g。能够满足再造烟叶中碳酸钙的检测要求。
加标回收率与相对标准偏差
加标回收率，是指在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。
相对标准偏差(relativestandarddeviation；rsd)又叫标准偏差系数、变异系数、变动系数等，由标准偏差除以相应的平均值乘100%所得值，可在检验检测工作中分析结果的精密度。
将再造烟叶磨成烟末试样，干燥至恒重备用，用电子秤三次称取0.2g试样，分别置于对应的反应器中，准确加入50ml去离子水，在三组反应器中分别加入4.12mg、7.38mg、14.26mg轻质碳酸钙，采用原子吸收分光光度计测量，每组测量6次取平均值，带入标准曲线得对应ca2 浓度，测定结果如下表2。
表2再造烟叶中碳酸钙的加标回收率(n=6)
由表2可知，三次样品的平均加标回收率在92.72%~96.61%之间，说明该标准曲线计算浓度的可靠性较大。相对标准偏差在2.83%~3.52%之间。说明该标准曲线计算浓度的准确性较高。
实施例2
空白样品中ca2 浓度c0的计算：
s1、将再造烟叶a磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末0.2g置于反应器中，加入50ml去离子水，再加入0.1mg碳酸酐酶，反应完成后封闭反应器，置于冰浴中振荡30min，然后过滤，得到空白待测液；
s3、将步骤s2得到的空白待测液用冰水稀释100倍后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c0；
将样品中的再造烟叶a分成6份进行碳酸钙的含量测试，具体测试过程如实施例3-实施例8所示。
实施例3
s1、将再造烟叶a磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末0.2g置于反应器中，加入50ml去离子水，再加入0.1mg碳酸酐酶，然后以0.5ml/min的流速通入co2，20min后迅速封闭容器，置于0℃冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释100倍后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c1；
s4、计算造烟叶中碳酸钙的含量：
实施例4
s1、将再造烟叶a磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末0.24g置于反应器中，加入60ml去离子水，再加入0.1mg碳酸酐酶，然后以0.8ml/min的流速通入co2，30min后迅速封闭容器，置于0℃冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释100倍后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c2；
s4、计算造烟叶中碳酸钙的含量：
实施例5
s1、将再造烟叶a磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末0.28g置于反应器中，加入70ml去离子水，再加入0.1mg碳酸酐酶，然后以1.2ml/min的流速通入co2，40min后迅速封闭容器，置于0℃冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释100倍后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c3；
s4、计算造烟叶中碳酸钙的含量：
实施例6
s1、将再造烟叶a磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末0.32g置于反应器中，加入80ml去离子水，再加入0.1mg碳酸酐酶，然后以1.5ml/min的流速通入co2，50min后迅速封闭容器，置于0℃冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释100倍后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c4；
s4、计算造烟叶中碳酸钙的含量：
实施例7
s1、将再造烟叶a磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末0.36g置于反应器中，加入90ml去离子水，再加入0.1mg碳酸酐酶，然后以1.8ml/min的流速通入co2，60min后迅速封闭容器，置于4℃冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释100倍后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c5；
s4、计算造烟叶中碳酸钙的含量：
实施例8
s1、将再造烟叶a磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末0.4g置于反应器中，加入100ml去离子水，再加入0.1mg碳酸酐酶，然后以2.0ml/min的流速通入co2，60min后迅速封闭容器，置于4℃冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释100倍后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c6；
s4、计算造烟叶中碳酸钙的含量：
实施例3-8测试的碳酸钙的含量结果如下表3所示。
表3–实施例3-8再造烟叶中碳酸钙的测定结果
由表3可知，实施例3-8测定的碳酸钙含量误差较小，说明了本方法的可靠性和准确性。
上面描述的内容可以单独地或者以各种方式组合起来实施，而这些变型方式都在本发明的保护范围之内。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施例只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
1.一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、将再造烟叶磨成烟末，干燥至恒重备用；
s2、称取步骤s1中准备的烟末置于反应器中，加入去离子水，再加入碳酸酐酶，然后通入co2进行反应，反应完成后封闭反应器，置于冰浴中振荡，然后过滤，得到待测液；
s3、将步骤s2得到的待测液用冰水稀释后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出待测液中ca2 的浓度c；
所述标准工作曲线的制作方法：配制不同浓度的ca2 标准溶液，采用原子吸收分光光度计测量不同浓度ca2 的吸光度，然后以ca2 浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线；
s4、空白样品中ca2 浓度c0的计算方法：称取步骤s1中准备的烟末置于反应器中，加入去离子水，再加入碳酸酐酶进行反应，反应完成后封闭反应器，置于冰浴中振荡，然后过滤，得到空白待测液，将空白待测液用冰水稀释后采用原子吸收分光光度计测量ca2 的吸光度，然后带入标准工作曲线，得出空白待测液中ca2 的浓度c0；
s5、再造烟叶中碳酸钙的含量按照下式计算得出：
上式中：
x——再造烟叶中碳酸钙的含量，单位为微克每克（μg/g）；
c——由标准工作曲线得出的目标物的浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；
c0——由标准工作曲线得出的空白样品中目标物浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；
v——萃取液体积，单位为毫升（ml）；
f——稀释因子；
m——试样质量，单位为克（g）；
100——caco3的式量；
40——ca2 的式量。
2.根据权利要求1所述的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤s2和s4中烟末、去离子水与碳酸酐酶的质量比为（2000-4000）：（500000-1000000）：1。
3.根据权利要求1所述的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤s2中通入co2的时间为20~60min，通入co2的流速为0.5~2.0ml/min。
4.根据权利要求1所述的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤s2和步骤s4中冰浴温度均为0~4℃。
5.根据权利要求1所述的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤s2和步骤s4中震荡时间均为20~60min。
6.根据权利要求1所述的一种应用酶促反应测定再造烟叶中碳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤s3中待测液与所述步骤s4中空白待测液均用冰水稀释90-110倍。
技术总结