一种小檗碱-环糊精缀合物的制作方法

一种小檗碱
‑
环糊精缀合物
技术领域
1.本发明涉及环糊精技术领域，尤其涉及一种小檗碱
‑
环糊精缀合物。


背景技术：

2.小檗碱是从中草药黄连中提取出的一种有效活性成分，在我国用于治疗肠胃炎有上千年的历史。近些年的研究发现，小檗碱具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化，治疗老年智呆、骨质疏松，降血糖、降血压、降血脂等。在降血糖方面，小檗碱表现出了治疗效果好、毒副作用小等优点，具有非常大的开发前景。但是其生物利用度较差，口服吸收效率低于5％，因此，如何提高小檗碱的生物利用度，成为科学家研究的难点问题之一。
3.专利cn101461949a保护了一种小檗碱环糊精包合物，显著提高了小檗碱的溶解性和吸收效率。文献(中国新药与临床杂志,2010,29(10),754)报道了一种小檗碱环糊精包合物，具有掩盖小檗碱本身的苦味，提高药物溶解度的作用。但是现有的小檗碱环糊精包合物全部为物理包合，这一包合方式最大的缺点就是药物释放难以控制，导致药物进入体内后，小檗碱很快就会被释放出来，从而降低其吸收效率。除此之外，这一物理包合物还容易受周围环境的影响，在酸性条件，或是其它竞争性的分子存在的条件下，小檗碱释放速度也会过快。因此，研究一种新型的小檗碱衍生物或组合物，能够减缓其释放速率，同时提高其药理活性，具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是解决现有技术中的问题，提供一种不同于普通的物理包合，将小檗碱与环糊精以共价键的形式，通过连接臂(linker)连接在一起，结构稳定的小檗碱
‑
环糊精缀合物。
5.本发明的技术方案是：
6.一种小檗碱
‑
环糊精缀合物，结构式如下：
[0007][0008]
小檗碱
‑
环糊精缀合物1
‑
3，
[0009]
其中，linker是
[0010]
优选的，当linker是时，其制备方法如下：
[0011]
步骤一：对甲苯磺酰基修饰的环糊精的制备：称取β
‑
环糊精100～300份，在温度10～30℃下加入到1000～3000份的氢氧化钠水溶液中，氢氧化钠摩尔浓度为200
‑
300mmol/l，在温度10～30℃下搅拌20～40分钟，降温至
‑
5～5℃，滴加400～600份对甲基苯磺酰氯的乙腈溶液，对甲基苯磺酰氯摩尔浓度为500
‑
560mmol/l，1小时内加完，升温至10～30℃，搅拌反应1～3小时，减压蒸馏至剩余2000～2200份，在10～20℃下继续搅拌析晶8～16小时，过滤，于30～50℃下真空干燥得到对甲苯磺酰基修饰的环糊精；
[0012]
步骤二：叠氮基修饰的环糊精的制备：称取对甲苯磺酰基修饰的环糊精80～120份，溶于800～1200份的水中，开启搅拌装置进行搅拌，在温度10～20℃下加入叠氮钠20～30份，在30～50℃下搅拌4～8小时，然后加入800～1200份的乙醇，降温至
‑
5～5℃，搅拌析晶8～12小时，过滤，于30～50℃下真空干燥得到叠氮基修饰的环糊精；
[0013]
步骤三：小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取叠氮基修饰的环糊精100～130份和9
‑
o
‑
(丙炔基)小檗碱30～40份，溶于800～1200份的乙腈、甲醇、水的混合溶液中，乙腈、甲醇和水的混合液中乙腈、甲醇和水的质量比为2：2：1，开启搅拌装置进行搅拌，升温至10～20℃，加入五水硫酸铜10～15份和抗坏血酸钠8～12份，在10～20℃温度下搅拌反应2～4小时，然后升温至40～80℃，继续搅拌反应2～4小时，减压蒸馏除去乙腈、甲醇和水，加入500～550份的乙醇、水的混合溶液，乙醇和水的混合液中乙醇和水的质量比为20：1，搅拌0.5～1.5小时，过滤，用150～250份乙醇重结晶得小檗碱
‑
环糊精缀合物1。
[0014][0015]
优选的，当linker是时，其制备方法如下：
[0016]
步骤一：氨基修饰的环糊精的制备：称取叠氮基修饰的环糊精200～300份，在温度
10～30℃下加入到1500～2500份水和四氢呋喃的混合溶剂中，水和四氢呋喃的混合液中水和四氢呋喃的质量比为1:20，搅拌20～40分钟，降温至
‑
5～5℃，加入三苯基膦50～100份，升温至10～30℃，搅拌1
‑
6小时，减压蒸馏至剩余100～300份，加入100～300份水，用二氯甲烷洗涤三次，每次使用二氯甲烷50～150份，加入1500～2500份丙酮，降温至
‑
5～5℃，搅拌析晶8～12小时，过滤，真空干燥得氨基修饰的环糊精；
[0017]
步骤二：小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取氨基修饰的环糊精50～150份，溶于500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，开启搅拌装置进行搅拌，在温度10～30℃下加入二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)戊二酸酯50～150份和三乙胺5～15份，在温度10～30℃下搅拌2～6小时，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯洗涤三次，每次使用乙酸乙酯100～300份，再加入500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，在温度10～30℃下加入氨基小檗碱30～60份和三乙胺5～15份，搅拌反应1～3天，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙醇洗涤三次，每次使用乙醇500～1500份，得小檗碱
‑
环糊精缀合物2。
[0018][0019]
优选的，当linker是时，其制备方法如下：
[0020]
小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取氨基修饰的环糊精50～150份，溶于500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，开启搅拌装置进行搅拌，在温度10～30℃下加入二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)三缩四乙二醇二羧酸酯100～150份和三乙胺5～15份，在温度10～30℃下搅拌2～6小时，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯洗涤三次，每次使用乙酸乙酯100～300份，再加入500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，在温度10～30℃下加入氨基小檗碱30～60份和三乙胺5～15份，搅拌反应1～3天，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙醇洗涤三次，每次使用乙醇500～1500份，得小檗碱
‑
环糊精缀合物3。
[0021][0022]
本发明的有益效果为：小檗碱与环糊精以共价键的形式，通过连接臂(linker)连接在一起，所得的小檗碱
‑
环糊精缀合物结构稳定，进入体内后会缓慢释放，能够解决现有的小檗碱环糊精包合物释放速度过快、易受环境影响的问题；环糊精具有较好的生物相容性，在临床生已经被广泛用作药物辅料、包材等，将小檗碱与环糊精通过共价键结合，能够提高小檗碱的生物相容性，同时提高其药理活性；小檗碱与环糊精结合为结构明确的药物分子，产品质量控制相对容易，而普通的小檗碱环糊精包合物为混合成分，包合过程中还需要加入其它组分，因而所添加的组分的质量会影响最终产品的质量，导致终产品质量不易控制。
具体实施方式
[0023]
为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，进一步阐述本发明。
[0024]
其中，9
‑
o
‑
(丙炔基)小檗碱根据如下参考文献制备(drug design,development andtherapy,2014,8,1047
‑
1059)，氨基小檗碱根据如下参考文献制备(bioorganic&medicinal chemistry,2005,13(20),5835
‑
5840)，二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)戊二酸酯根据如下参考文献制备(chem.commun.,2007,180
‑
182)，二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)三缩四乙二醇二羧酸酯根据如下参考文献制备(acsappl.mater.interfaces,2018,10,18574
‑
18584)。
[0025]
实施例1：
[0026]
当linker是时，其制备方法如下：
[0027]
对甲苯磺酰基修饰的环糊精的制备：称取β
‑
环糊精(200g，176mmol)，在温度20℃下加入到2000ml的氢氧化钠水溶液中(含有21.9g氢氧化钠，274mmol/l)，在温度20℃下搅
拌30分钟，降温至0℃，滴加对甲基苯磺酰氯的乙腈溶液(50.4g对甲苯磺酰氯溶于500ml乙腈，530mmol/l)，1小时加完，升温至20℃，搅拌反应2小时，减压蒸馏至剩余2100ml，在15℃下继续搅拌析晶12小时，过滤，于40℃下真空干燥得到对甲苯磺酰基修饰的环糊精(184g，产率81％)；
[0028]
叠氮基修饰的环糊精的制备：称取对甲苯磺酰基修饰的环糊精(100g，77.6mmol)，溶于1000ml的水中，开启搅拌装置进行搅拌，在温度15℃下加入叠氮钠(25.4g，390mmol)，在40℃下搅拌6小时，然后加入1000ml的乙醇，降温至0℃，搅拌析晶10小时，过滤，于40℃下真空干燥得到叠氮基修饰的环糊精(质量为68g，产率76％)；高分辨质谱(m/z)：理论值：c
42
h
69
n3nao
34
,[m na]

,1182.3655；实测值：1182.3659。
[0029]
小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取叠氮基修饰的环糊精(116g，100mmol)和9
‑
o
‑
(丙炔基)小檗碱(36g，100mmol)，溶于乙腈、甲醇、水的混合溶液中(乙腈：甲醇：水＝400ml：400ml：200ml)，开启搅拌装置进行搅拌，升温至15℃，加入五水硫酸铜(12.5g，50mmol)和抗坏血酸钠(10g，50mmol)，在15℃温度下搅拌反应3小时，然后升温至60℃，继续搅拌反应3小时，减压蒸馏除去乙腈、甲醇和水，加入乙醇、水的混合溶液(乙醇：水＝500ml：25ml)，搅拌1小时，过滤，用200ml乙醇重结晶得小檗碱
‑
环糊精缀合物(质量为108g，产率71％)。高分辨质谱(m/z)：理论值：c
64
h
87
n4o
38
,[m
‑
cl]

,1519.4993；实测值：1519.4963。
[0030][0031]
实施例2：
[0032]
当linker是时，其制备方法如下：
[0033]
步骤一：氨基修饰的环糊精的制备：称取叠氮基修饰的环糊精(232g，200mmol)，在温度20℃下加入到2100ml水和四氢呋喃的混合溶剂中(水：四氢呋喃＝1:20)，搅拌30分钟，降温至0℃，加入三苯基膦(79g，300mmol)，升温至20℃，搅拌3小时，减压蒸馏至剩余200ml，
加入200ml水，用二氯甲烷洗涤三次(每次使用二氯甲烷100ml)，加入2100ml丙酮，降温至0℃，搅拌析晶10小时，过滤，真空干燥得氨基修饰的环糊精(质量为206g，产率91％)；
[0034]
步骤二：小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取氨基修饰的环糊精(110g，97mmol)，溶于1000mln,n
‑
二甲基甲酰胺，开启搅拌装置进行搅拌，在温度20℃下加入二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)戊二酸酯(95g，291mmol)和三乙胺(10g，97mmol)，在温度20℃下搅拌4小时，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯洗涤三次(每次使用乙酸乙酯200ml)，再加入1000mln,n
‑
二甲基甲酰胺，在温度20℃下加入氨基小檗碱(53g，146mmol)和三乙胺(10g，97mmol)，搅拌反应2天，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙醇洗涤三次(每次使用乙醇1000ml)，得小檗碱
‑
环糊精缀合物(质量为98g，产率65％)。高分辨质谱(m/z)：理论值：c
68
h
96
n3o
40
,[m
‑
cl]

,1594.5565；实测值：1594.5594。
[0035][0036]
实施例3：
[0037]
当linker是时，其制备方法如下：
[0038]
小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取氨基修饰的环糊精(110g，97mmol)，溶于1000mln,n
‑
二甲基甲酰胺，开启搅拌装置进行搅拌，在温度20℃下加入二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)三缩四乙二醇二羧酸酯(121g，291mmol)和三乙胺(10g，97mmol)，在温度20℃下搅拌4小时，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯洗涤三次(每次使用乙酸乙酯200ml)，再加入1000mln,n
‑
二甲基甲酰胺，在温度20℃下加入氨基小檗碱(53g，146mmol)和三乙胺(10g，97mmol)，搅拌反应2天，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙醇洗涤三次(每次使用乙醇1000ml)，得小檗碱
‑
环糊精缀合物(质量为1115g，产率72％)。高分辨质谱(m/z)：理论值：c
71
h
102
n3o
43
,[m
‑
cl]

,1684.5882；实测值：1684.5895。
[0039][0040]
实施例4：
[0041]
毒性评价
[0042]
以hepg2细胞为体外模型，采用mtt法评价小檗碱
‑
环糊精缀合物的毒性。将hepg2细胞(上海酶研生物科技有限公司)接种到96孔板(100μl/孔)内，在二氧化碳培养箱中培养24小时，培养温度37℃，二氧化碳浓度5％，培养基为dmem培养基，包含10％的胎牛血清(fbs)，10units/ml的青霉素g，10mg/ml的链霉素,2mm谷氨酰胺，2％的丙酮酸钠。然后吸出原培养基，加入新鲜的培养基，并加入小檗碱
‑
环糊精缀合物1
‑
3的水溶液(使化合物在孔板中的浓度为3.125，6.25，12.5，25.0，50，100.0，500μg/ml)，继续在温度37℃，5％的co2浓度条件下培养12h。同时设置对照组和空白组，对照组加入小檗碱(使化合物在孔板中的浓度为3.125，6.25，12.5，25.0，50，100.0，500μg/ml)，空白组hepg2细胞按照同样的条件培养，不加化合物。培养完成后，向孔板中20μl的mtt标准溶液(0.5mg/ml)，继续孵育1
‑
4h，将孔板中的培养液吸出，加入100μl的dmso，振荡均匀，用酶标仪在570nm处测定每孔的吸光度od值。根据吸光度值，计算化合物的半数已知浓度。结果入表1所示，小檗碱与环糊精缀合之后，其毒性明显降低，其中小檗碱
‑
环糊精缀合物1和2的半数抑制浓度均在100μg/ml以上，小檗碱
‑
环糊精缀合物3的半数抑制浓度也在91μg/ml。
[0043]
表1.化合物的细胞毒性评价结果
[0044][0045]
实施例5：
[0046]
体内降血糖活性评价
[0047]
将balb/c小鼠(上海义森生物科技有限公司，6周龄)按照200mg/kg的剂量注射四氧嘧啶，用于破坏小鼠的胰岛素，建立高血糖小鼠模型。48小时后给与小鼠口服灌胃小檗碱、以及小檗碱
‑
环糊精缀合物1
‑
3，剂量为20mg/kg，每天口服灌胃一次，连续灌胃30天，然后取血，用血糖仪测定血糖值，每组10只老鼠，测定结果取平均值。同时设立模型组和空白组，模型组按照200mg/kg的剂量注射四氧嘧啶，然后给与小鼠灌胃等量的生理盐水，连续灌胃30天，空白组正常饲养。结果如表2所示，正常小鼠的血糖平均值为6.6毫摩尔/升，给与注射四氧嘧啶后，由于小鼠的胰岛受损，血糖急剧升高，达到14.8毫摩尔/升。给与灌胃小檗碱后，血糖降低至7.5毫摩尔/升，但是未恢复至正常水平。相比之下，口服灌胃小檗碱
‑
环糊精缀合物1
‑
3之后，小鼠的血糖值恢复至正常水平，这说明，小檗碱与环糊精缀合之后，降血糖活性明显增强。
[0048]
表2.化合物的体内降血糖活性评价结果
[0049]
组别血糖平均值(毫摩尔/升)空白组6.6模型组14.8小檗碱7.5小檗碱
‑
环糊精缀合物16.7小檗碱
‑
环糊精缀合物26.5小檗碱
‑
环糊精缀合物36.7
[0050]
综上所述仅为本发明较佳的实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范畴。

技术特征：
1.一种小檗碱
‑
环糊精缀合物，其特征在于：结构式如下：其中，linker是2.根据权利要求1所述的一种小檗碱
‑
环糊精缀合物，其特征在于：当linker是时，其制备方法如下：步骤一：对甲苯磺酰基修饰的环糊精的制备：称取β
‑
环糊精100～300份，在温度10～30℃下加入到1000～3000份的氢氧化钠水溶液中，氢氧化钠摩尔浓度为200
‑
300mmol/l，在温度10～30℃下搅拌20～40分钟，降温至
‑
5～5℃，滴加400～600份对甲基苯磺酰氯的乙腈溶液，对甲基苯磺酰氯摩尔浓度为500
‑
560mmol/l，1小时内加完，升温至10～30℃，搅拌反应1～3小时，减压蒸馏至剩余2000～2200份，降温至10～20℃，继续搅拌析晶8～16小时，过滤，于30～50℃下真空干燥得到对甲苯磺酰基修饰的环糊精；步骤二：叠氮基修饰的环糊精的制备：称取对甲苯磺酰基修饰的环糊精80～120份，溶于800～1200份的水中，开启搅拌装置进行搅拌，在温度10～20℃下加入叠氮钠20～30份，在30～50℃下搅拌4～8小时，然后加入800～1200份的乙醇，降温至
‑
5～5℃，搅拌析晶8～12小时，过滤，于30～50℃下真空干燥得到叠氮基修饰的环糊精；步骤三：小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取叠氮基修饰的环糊精100～130份和9
‑
o
‑
(丙炔基)小檗碱30～40份，溶于800～1200份的乙腈、甲醇、水的混合溶液中，乙腈、甲醇和水的混合液中乙腈、甲醇和水的质量比为2：2：1，开启搅拌装置进行搅拌，升温至10～20℃，加入五水硫酸铜10～15份和抗坏血酸钠8～12份，在10～20℃温度下搅拌反应2～4小时，然后升温至40～80℃，继续搅拌反应2～4小时，减压蒸馏除去乙腈、甲醇和水，加入500～550份的乙醇和水的混合溶液，乙醇和水的混合液中乙醇和水的质量比为20：1，搅拌0.5～1.5小时，过滤，用150～250份乙醇重结晶得小檗碱
‑
环糊精缀合物1。3.如权利要求1所述的一种小檗碱
‑
环糊精缀合物，其特征在于：当linker是时，其制备方法如下：步骤一：氨基修饰的环糊精的制备：称取叠氮基修饰的环糊精200～300份，在温度10～30℃下加入到1500～2500份水和四氢呋喃的混合溶剂中，水和四氢呋喃的混合液中水和四氢呋喃的质量比为1:20，搅拌20～40分钟，降温至
‑
5～5℃，加入三苯基膦50～100份，升温至10～30℃，搅拌1
‑
6小时，减压蒸馏至剩余100～300份，加入100～300份水，用二氯甲烷洗
涤三次，每次洗涤使用二氯甲烷50～150份，加入1500～2500份丙酮，降温至
‑
5～5℃，搅拌析晶8～12小时，过滤，真空干燥得氨基修饰的环糊精；步骤二：小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取氨基修饰的环糊精50～150份，溶于500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，开启搅拌装置进行搅拌，在温度10～30℃下加入二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)戊二酸酯50～150份和三乙胺5～15份，在温度10～30℃下搅拌2～6小时，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯洗涤三次，每次使用乙酸乙酯100～300份，再加入500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，在温度10～30℃下加入氨基小檗碱30～60份和三乙胺5～15份，搅拌反应1～3天，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙醇洗涤三次，每次洗涤使用乙醇500～1500份，得小檗碱
‑
环糊精缀合物2。4.如权利要求1所述的一种小檗碱
‑
环糊精缀合物，其特征在于：当linker是时，其制备方法如下：小檗碱
‑
环糊精缀合物的制备：称取氨基修饰的环糊精50～150份，溶于500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，开启搅拌装置进行搅拌，在温度10～30℃下加入二(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)三缩四乙二醇二羧酸酯100～150份和三乙胺5～15份，在温度10～30℃下搅拌2～6小时，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯洗涤三次，每次使用乙酸乙酯100～300份，再加入500～1500份n,n
‑
二甲基甲酰胺，在温度10～30℃下加入氨基小檗碱30～60份和三乙胺5～15份，搅拌反应1～3天，减压蒸馏除去n,n
‑
二甲基甲酰胺，用乙醇洗涤三次，每次洗涤使用乙醇500～1500份，得小檗碱
‑
环糊精缀合物3。
技术总结
本发明涉及环糊精技术领域，尤其涉及一种小檗碱


技术研发人员：秦大伟 王利振
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学
技术研发日：2021.03.24
技术公布日：2021/6/29