一种响应非生物胁迫的顺式作用元件及其鉴定方法和应用与流程

1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种响应非生物胁迫的顺式作用元件的鉴定及其在植物抗逆性改良中的应用。


背景技术：

2.高盐、干旱和低温等非生物胁迫是植物在生长发育过程中遭受的主要逆境因子，植物对逆境的抵御涉及复杂的生理生化反应和一系列相关功能基因的表达，这就要求转录因子作为调控网络的主开关发挥作用。转录因子通过与顺式作用元件结合来调控下游基因的表达，在逆境胁迫反应中发挥重要作用。因此，鉴定转录因子识别的顺式作用元件，可以揭示参与环境适应的转录调控机制和基因表达模式，进一步加深对转录因子功能的认识及植物逆境胁迫应答的分子机制解析。
3.科研人员基于酵母单杂交技术建立了一套以转录因子为中心鉴定其识别的顺式作用元件的技术体系，该技术可以快速、准确地鉴定转录因子所识别的各种顺式作用元件，主要用于鉴定特定转录因子结合的新顺式作用元件。
4.白桦(betula platyphylla)具有生长迅速、适应性和抗逆性强等特点，是研究耐盐抗旱机理的理想材料。目前，已经在白桦中克隆得到一些抗逆相关转录因子基因，其中，白桦bprav1转录因子基因被发现参与了白桦非生物胁迫应答过程，但 bprav1转录因子调控白桦非生物胁迫应答的分子机制尚未阐明。鉴定bprav1转录因子识别的非生物胁迫响应顺式作用元件，将有助于揭示bprav1转录因子参与胁迫应答的转录调控机制。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种响应非生物胁迫的顺式作用元件。本发明的另一目的是提供所述新顺式作用元件在白桦抗逆性改良中的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：
7.一种响应非生物胁迫的顺式作用元件，其核苷酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列为“agcct”。
8.一种响应非生物胁迫的顺式作用元件的鉴定方法。
9.(1)、随机dna文库的筛选：利用转录因子为中心的酵母单杂交技术体系，以效应载体pgadt7
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bprav1为诱饵，筛选随机dna插入序列文库。从tdo 50mm 3
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at培养基上挑取阳性酵母克隆，提取phis2质粒并测序，从而鉴定出一个bprav1识别的不包含任何已知元件的插入序列“ccaagcctccggg”；
10.(2)、插入序列中核心元件的鉴定：为确定bprav1结合的这一新序列的核心序列，将插入序列“ccaagcctccggg”分别从左、右边界依次删除，将每个缺失序列以3 次串联拷贝克隆到phis2中，通过酵母单杂交实验研究其与bprav1的相互作用；酵母单杂交实验结果显示，bprav1能与序列“agcctccgg”结合，但未能与“gcctccgg”结合；另外，bprav1可以与序列“ccaagcct”结合，但不能与“ccaagcc”结合；表明 bprav1结合的顺式作用元件是“agcct”。
11.一种植物报告载体，其含有所述顺式作用元件。
12.将“agcct”及其突变序列的3次串联拷贝分别与35s camv小启动子序列融合，经酶切、连接反应使融合序列定向替换掉pcambia1301载体中的camv 35s启动子，即获得瞬时表达的报告载体；将bprav1构建到prok2植物表达载体camv 35s启动子的下游，用作共转化的效应表达载体。
13.所述的顺式作用元件在提高白桦抗逆性中的应用，用于白桦抗逆性改良。
14.有益效果：与现有技术相比，本发明提供了白桦bprav1转录因子结合的一种顺式作用元件，对顺式作用元件与bprav1转录因子的互作研究发现，bprav1转录因子能够与其靶基因启动子上的顺式作用元件结合，且这种结合能力受盐和渗透胁迫诱导加强，从而调控非生物胁迫应答基因的表达，提高白桦植株的抗逆性。可见本发明提供的顺式作用元件能够响应非生物胁迫，在白桦抗逆性改良中将具有广泛的应用。
附图说明
15.图1是顺式作用元件核心序列的鉴定。
16.图2是烟草共转化体系报告载体和效应载体的示意图。
17.图3是顺式作用元件与bprav1转录因子的互作结果。
18.图4是盐和渗透胁迫下新顺式作用元件与bprav1转录因子的结合。
19.图5是胁迫应答基因启动子上包含新顺式作用元件的示意图。
20.图6是正常生长条件下胁迫应答基因启动子的富集程度。
21.图7是盐和渗透胁迫下胁迫应答基因启动子的富集程度。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。
23.实施例1白桦bprav1转录因子结合的顺式作用元件的鉴定
24.1、随机dna文库的筛选
25.利用转录因子为中心的酵母单杂交技术体系，以效应载体pgadt7
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rec2
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bprav1为诱饵，筛选随机dna插入序列文库。从tdo 50mm 3
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at培养基上挑取阳性酵母克隆，提取phis2质粒并测序，从而鉴定出一个bprav1识别的不包含任何已知元件的插入序列(ccaagcctccggg)。
26.2、插入序列中核心元件的鉴定
27.为确定bprav1结合的这一新序列的核心序列，将插入序列“ccaagcctccggg”分别从左、右边界依次删除，将每个缺失序列以3次串联拷贝克隆到phis2中，各缺失序列如图1左侧所示，通过酵母单杂交(y1h)实验研究其与bprav1的相互作用。y1h 结果显示，bprav1能与序列“agcctccgg”结合，但未能与“gcctccgg”结合(图1， l3和l4)。另外，bprav1可以与序列“ccaagcct”结合，但不能与“ccaagcc”结合 (图1，r5和r6)。以上结果表明bprav1结合的顺式作用元件是“agcct”(seq idno.1)，将该元件命名为rbs1(rav
‑
binding site 1)。
28.实施例2顺式作用元件与bprav1转录因子的互作验证
29.1、报告载体和效应载体的构建
30.将“agcct”及其突变序列的3次串联拷贝分别与35s camv小启动子序列(长46 bp)
bprav1转录因子结合，从而激活报告基因的表达，且这种结合能力受盐和渗透胁迫诱导加强。在胁迫应答基因的启动子上发现多个顺式作用元件，进一步的染色质免疫共沉(chip)实验发现，包含该顺式作用元件的启动子片段能够被富集，且在盐和渗透胁迫条件下的富集程度加强。可见所述顺式作用元件参与白桦非生物胁迫应答，可用于白桦抗逆性改良。


技术特征：
1.一种受非生物胁迫诱导的顺式作用元件，其特在在于，核苷酸序列为“agcct”。2.一种响应非生物胁迫的顺式作用元件的鉴定方法，其特征在于：(1)、随机dna文库的筛选：利用转录因子为中心的酵母单杂交技术体系，以效应载体pgadt7
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bprav1为诱饵，筛选随机dna插入序列文库。从tdo 50mm 3
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at培养基上挑取阳性酵母克隆，提取phis2质粒并测序，从而鉴定出一个bprav1识别的不包含任何已知元件的插入序列“ccaagcctccggg”；(2)、插入序列中核心元件的鉴定：为确定bprav1结合的这一新序列的核心序列，将插入序列“ccaagcctccggg”分别从左、右边界依次删除，将每个缺失序列以3次串联拷贝克隆到phis2中，通过酵母单杂交实验研究其与bprav1的相互作用；酵母单杂交实验结果显示，bprav1能与序列“agcctccgg”结合，但未能与“gcctccgg”结合；另外，bprav1可以与序列“ccaagcct”结合，但不能与“ccaagcc”结合；表明bprav1结合的顺式作用元件是“agcct”。3.一种植物报告载体，其特种在于，含有权利要求1所述的顺式作用元件。4.一种权利要求3所述植物报告载体构建方法，其特征在于，将“agcct”及其突变序列的3次串联拷贝分别与35s camv小启动子序列融合，经酶切、连接反应使融合序列定向替换掉pcambia1301载体中的camv 35s启动子，即获得瞬时表达的报告载体；将bprav1构建到prok2植物表达载体camv 35s启动子的下游，用作共转化的效应表达载体。5.权利要求1所述的顺式作用元件在提高白桦抗逆性中的应用，其特征在于，用于白桦抗逆性改良。

技术总结
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种响应非生物胁迫的顺式作用元件及其鉴定方法和应用，顺式作用元件的核苷酸序列为“AGCCT”，并提供了含有权利要求1所述的顺式作用元件的植物报告载体。本发明所述顺式作用元件的启动子片段能够被富集，且在盐和渗透胁迫条件下的富集程度加强。可见所述新顺式作用元件参与白桦非生物胁迫应答，可用于白桦抗逆性改良。改良。改良。


技术研发人员：胡萍 杨传平 张凯敏
受保护的技术使用者：江西省科学院生物资源研究所
技术研发日：2021.07.23
技术公布日：2021/11/8