悬浮培养脑类器官的培养基及其应用的制作方法

1.本发明属于生物领域，尤其涉及一种悬浮培养脑类器官的培养基及其应用。
技术背景
2.类器官(organoids)是一种在体外环境下培育而成的具备三维结构的微器官，拥有类似真实器官的复杂结构，并能部分模拟来源组织或器官的生理功能。借助类器官，研究人员可深入观察人体组织的变化，更好地理解发育过程，并可用于再生医学以及药物的疗效筛选。因此，类器官研究具有广阔的发展前景。
3.在特定的培养条件下，类器官是健康的，能够发育足够长的时间，产生广泛的细胞类型，通常发现在人类大脑皮层。这些进展意味着，脑类器官现在可以作为可行的实验系统，直接研究病人组织中的疾病，并比较不同的药物对人类脑组织的影响。
4.脑类器官可以形成多种大脑区域。它们表现出功能性和能够电激发的神经元。它们类似于基因表达水平的人类皮质发育。
5.神经(前体)细胞移植是治疗神经退行性疾病的重要手段。神经(前体)细胞主要来源是流产胎儿，美国已经开展多个相关临床研究，进入临床2期，有治疗效果，由于伦理的原因，终止了临床试验。人多能干细胞(es，ipscs)体外诱导分化成为新的获取移植细胞的方法。神经细胞具有高度复杂的3d结构，二维平面培养不能获取功能最佳的细胞。2012年美国lacaster利用人多能干细胞培养出具有典型人脑组织结构和大部分组成细胞类型(缺血管系统和少突胶质细胞)的脑类器官，为研究人脑发育提供了绕过伦理的解决方案。
6.间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。
7.然而如何选择脑类器官培养基的成分，各个成分的比例如何设置还是本领域技术人员亟需攻克的难题。


技术实现要素：

8.本发明发现了一种悬浮培养脑类器官的培养基，通过使用该培养基可以从端脑类器官里分离纯化到一群间充质干细胞，该间充质干细胞具有用于神经修复领域的潜能。
9.具体的，本发明的技术方案如下：
10.一种悬浮培养脑类器官的培养基，所述培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；
11.所述培养基包括neaa 1％
‑
2％、glumax1％
‑
2％、mercaptoethanol80
‑
120 nm；
12.所述第一阶段培养基包括：
13.gmem基础培养基、kosr12
‑
18％、dorsomorphin0.8
‑
1.5μm、a83
‑
010.8
‑
1.2μm和聚乙烯醇0.5
‑
1.5％；
14.所述第二阶段培养基包括：gmem基础培养基、n2 1％
‑
2％、sb
‑
4315420.8
‑
1.2μm、
chir
‑
99021 0.8
‑
1.2μm、聚乙烯醇0.8
‑
1.5％；
15.所述第三阶段培养基包括：mem基础培养基、n2 1％
‑
2％、sb
‑
4315420.8
‑
1.2μm、chir
‑
99021 0.8
‑
1.2μm、martigel 0.8
‑
1.5％、聚乙烯醇0.8
‑
1.5％；
16.所述第四阶段培养基包括：gmem基础培养基、n2 1％
‑
2％、b27 2％
‑
3％、胰岛素2μg/ml。
17.sb 431542是一种强效的小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子β(tgf
‑
β)i型受体活化素受体样激酶alk5(ic50＝94nm)，alk4(ic50＝140nm)和alk7。对其它与bmp蛋白结合的alk家族分支成员如alk2，alk3或alk6无任何抑制活性。sb 431542抑制tgf
‑
β诱导的骨肉瘤细胞的增殖，并促进胚胎干细胞(esc)来源的内皮细胞的增殖、分化和片层形成。通过特异性阻断alk/smad信号通路，sb 431542不仅能够维持人胚胎干细胞的自我更新和胚状体的形成，还能够维持多潜能干细胞。sb 431542在体外诱导dc细胞成熟，同时在体内显示抗肿瘤的活性。与tgfβ活性相关的免疫耐受性患者使用sb 431542可能激活抗肿瘤的免疫应答。
18.chir
‑
99021(ct99021)是一种有效的选择性gsk
‑
3α/β抑制剂，ic50为10nm和6.7nm。chir
‑
99021对gsk
‑
3的选择性比cdc2，erk2和其他蛋白激酶高500倍以上。chir
‑
99021还是一种有效的wnt/β
‑
catenin信号通路激活剂。chir
‑
99021可增强小鼠和人类胚胎干细胞的自我更新。chir
‑
99021能诱导细胞自噬(autophagy)。
19.优选的，所述培养基包括1％的聚乙烯醇。
20.本发明第二个方面公开了一种利用上述的培养基制备间充质干细胞的方法，包括：
21.s1：采用第一阶段培养基悬浮培养人多能干细胞；
22.s2：在d4
‑
d6、d7
‑
d14、d15
‑
d21依次将培养基更换为第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；
23.s3：将细胞转入微型类器官生物反应器中，培养3
‑
4天后接种到明胶包被的培养容器中，采用n
‑
mscs第一阶段培养基进行贴壁培养得到间充质干细胞。
24.优选的，所述第一阶段培养基中包括y
‑
27632，所述y
‑
27632的浓度为8
‑
12μm。
25.优选的，还包括步骤s4：待s3中的间充质干细胞汇合率为70
‑
80％时，采用无血清mscs培养基进行传代培养。
26.在本发明的一些具体实施例中，在s1中，hpscs按照常规培养，培养于35mm的培养皿，每天换液，换液时间逐渐提前，培养基从开始的2ml逐渐增加到3ml。培养到密度90％时，将得到的人多能干细胞进行消化，记为day 0。
27.在本发明的一些具体实施例中，hpscs无酶消化液为0.5mmedtadpbs。
28.优选的，第一阶段培养基中加入了y
‑
27632。
29.更优选的，所述y
‑
27632的浓度为8
‑
12μm。
30.在本发明的一些具体实施例中，在s4中，消化液为accutase或1型胶原酶(1mg/ml)。
31.后续的间充质干细胞的传代消化酶为重组胰酶(0.05％胰酶溶于dhanks中)。
32.在本发明的一些具体实施例中，在s4中，待贴壁细胞铺满70％时，进行传代培养，使用商品化无血清mscs培养基，此时培养的n
‑
mscs记为p1代。在p3代时，收集细胞进行mscs
相关表面标志物鉴定和多向分化潜能鉴定。
33.在本发明的一些具体实施例中，所述无血清mscs培养基为lonza公司12
‑
725fultraculture无血清培养基或安徽中盛溯源生物科技有限公司货号rp01020的nctarget培养基。
34.本发明第三个方面公开了上述方法得到的间充质干细胞。
35.本发明第四个方面公开了一种药物，所述药物包括间充质干细胞。
36.优选的，所述药物为治疗阿尔茨海默症的药物。
37.本发明第五个方面公开了根据上述的间充质干细胞在神经修复领域中的应用。优选的，所述间充质干细胞在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
38.本发明第六个方面公开了根据上述的培养基在制备间充质干细胞中的应用。
39.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
40.本发明公开了一种悬浮培养脑类器官的培养基，使用该培养基可以制备分离到间充质干细胞，前期多能干细胞采用悬浮培养的方法，对细胞损害小，产量高，后期的细胞培养基中开创性的添加聚乙烯醇，改变培养物剪切力，使早期诱导分化条件适应悬浮培养剪切力，并且可以减少诱导因子的使用。得到的间充质干细胞具有制备神经修复领域药物的应用，尤其是在制备治疗阿尔茨海默症药物中具有广泛的应用前景。
附图说明
41.图1为制备得到的间充质干细胞的显微镜示意图(a：显微镜下间充质干细胞细胞形态图，b：间充质干细胞成脂分化示意图，c：间充质干细胞成骨分化示意图，d：间充质干细胞成软骨分化示意图)。
42.图2为制备得到的间充质干细胞流式阳性结果图；
43.图3为制备得到的间充质干细胞流式阴性结果图；
44.图4为植入间充质干细胞的小鼠行为学实验
‑
旷场实验结果图一(centimeter：厘米；total distance：总距离)。
45.图5为植入间充质干细胞的小鼠行为学实验
‑
旷场实验结果图二(entries in central zone：中央区进入次数；time in central zone：在中央区的时间；distance in central zone：在中央区的距离；dejection amount：沮丧感)。
46.图6为植入间充质干细胞的小鼠行为学实验
‑
新物体识别图(novel object：新物体)。
47.图7为植入间充质干细胞的小鼠行为学实验
‑
条件恐惧图(contextual fear：海马依赖；cued fear：杏仁核依赖)。
48.图8为植入间充质干细胞的小鼠行为学实验
‑
巴恩斯迷宫图一(escape latency：逃避潜伏期)。
49.图9为植入间充质干细胞的小鼠行为学实验
‑
巴恩斯迷宫图二(latency 1st entrance to target：延迟第一次进入目标)。
50.图10为植入间充质干细胞的小鼠行为学实验
‑
巴恩斯迷宫图三(latency 1st entrance to target：延迟第一次进入目标。
51.图11为不同间充质干细胞的差异基因表达测序结果图。
52.图12为新生神经元的长度计算流程图；
53.图13为共聚焦显微镜下的神经元示意图；
54.图14为不同组间充质干细胞的神经元长度图(neuron length：神经元长度)。
55.图15为小鼠脑切片
‑
神经元复杂程度图(intersection number：节段数目)。
56.图16为小鼠脑切片共聚焦显微镜示意图。
57.图17为小鼠脑切片
‑
spine形态分析图(thin：纺锤型，stubby：哑铃型，mushroom：蘑菇型)。
58.图18为小鼠脑切片
‑
神经干/祖细胞数量图(sox2 ：sox2单阳；sox2 gfap ：sox2和gfap共阳)。
59.图19为小鼠脑切片
‑
小胶质细胞形态分析图一(iba
‑
1positive cell：iba
‑
1阳性细胞；intersection number：节段数目)。
60.图20为小鼠脑切片
‑
小胶质细胞形态分析图二(average soma size：平均体大小；branch length：分枝长度；branch：分枝)。
61.图21为脑类器官培养过程中未添加聚乙烯醇和添加1％聚乙烯醇的对比图。
62.图22为添加聚乙烯醇后脑类器官的表面标志物表达情况。
63.图23为添加聚乙烯醇后各个培养时期的脑类器官。
具体实施方式
64.下面通过详细的实施例对本申请进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本申请，并不对发明内容进行限定。
65.实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。
66.实施例1
67.本实施例公开了一种悬浮培养脑类器官的培养基，其包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；下述培养基中的配方百分比均指体积比。
68.第一阶段培养基的配方如下：
69.gmem基础培养基、neaa1％、glumax 1％、mercaptoethanol100nm、kosr 15％、dorsomorphin 1μm、a83
‑
01 1μm和聚乙烯醇1％。
70.所述第一阶段培养基的制备方法为：往gmem基础培养基中一次添加neaa1％、glumax 1％、mercaptoethanol100 nm、kosr 15％、dorsomorphin 1μm、a83
‑
01 1μm和聚乙烯醇1％。
71.第二阶段培养基包括：gmem基础培养基、neaa 1％、glumax 1％、mercaptoethanol 100nm、n2 1％、sb
‑
431542 1μm、chir
‑
99021 1μm、聚乙烯醇1％。
72.所述第二阶段培养基的制备方法为：往gmem基础培养基中依次加入neaa 1％、glumax 1％、mercaptoethanol 100nm、n2 1％、sb
‑
431542 1μm、chir
‑
99021 1μm、聚乙烯醇1％。
73.第三阶段培养基包括：mem基础培养基、neaa 1％、glumax 1％、mercaptoethanol 100nm、n2 1％、sb
‑
431542 1μm、chir
‑
99021 1μm、martigel 1％、聚乙烯醇1％。
74.所述第三阶段培养基的制备方法为：往mem基础培养基中依次加入neaa1％、
glumax 1％、mercaptoethanol 100nm、n2 1％、sb
‑
431542 1μm、chir
‑
990211μm、martigel 1％、聚乙烯醇1％。
75.第四阶段培养基包括：gmem基础培养基、neaa 1％、glumax 1％、mercaptoethanol 100nm、n2 1％、b27 2％、胰岛素2μg/ml。
76.所述第四阶段培养基的制备方法为：往gmem基础培养基中依次加入neaa 1％、glumax 1％、mercaptoethanol 100nm、n2 1％、b27 2％、胰岛素2μg/ml。
77.其中产品型号分别为：
78.neaagibco 11140050；
79.glutamax gibco 35050079；
80.n2 gibco a1370701；
81.b27 gibco 12587010；
82.sb
‑
431542mce hy
‑
10431；
83.chir
‑
99021mce hy
‑
10182
84.martigel corning 354277
85.聚乙烯醇sigma
‑
aldrich,p8136
‑
250g
86.胰岛素sigma
‑
aldrich i9278
‑
5ml。
87.实施例2
88.本实施例公开了一种制备间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤：
89.一、hpscs按照常规培养，培养于35mm的培养皿，每天换液，换液时间逐渐提前，培养基从开始的2ml逐渐增加到3ml。培养到密度90％时，记为day 0。
90.二、dpbs洗涤细胞两次，加入1ml/皿的hpscs无酶消化液，放入37摄氏度培养箱，8分钟。期间准备冰冷的脑类器官1阶段培养基3ml，并加入y
‑
27632，终浓度为10μm。
91.三、小心吸取hpscs无酶消化液，加入1ml含y
‑
27632的冰冷脑类器官1阶段培养基，左右快速摇动培养皿，使hpscs克隆脱落，并用巴氏吸管(开口一定要大，不能使用移液器吸头)转移至普通6孔板的一个孔，并添加y
‑
27632的冰冷脑类器官1阶段培养基到3ml。
92.四、6孔盘放入培养箱水平摇床(振幅24mm)，60rpm培养过夜。
93.五、day1，镜检细胞球，直径约为250μm
‑
350μm。数量约为600个。用巴氏吸管小心转移培养物到15ml离心管，自然沉降3分钟，取清约2.5ml于新15ml离心管，3000rpm离心5min，去掉单细胞和细胞碎片后，加入沉降的细胞球中，并加入新鲜常温脑类器官1阶段培养基到9ml，小心混匀后，分装于3个6孔盘的孔，每孔约200个细胞球，3ml培养基。继续放入培养箱水平摇床(振幅24mm)，60rpm培养。
94.六、day2，day3半换液，脑类器官1阶段培养基，培养箱水平摇床(振幅24mm)，60rpm培养。
95.七、day4
‑
day6，半换液，换入脑类器官2阶段培养基。，培养箱水平摇床(振幅24mm)，60rpm培养。
96.八、day7
‑
day14，每天半换液，换入脑类器官3阶段培养基，培养箱水平摇床(振幅24mm)，60rpm培养。
97.九、day15
‑
day21，每天半换液，换入脑类器官4阶段培养基，转入微型类器官生物反应器，培养至21天，每孔调整数量为20个。其中微型类器官生物反应器在专利申请号为
2017212099229、2017212027930或2017212119025中进行了公开。
98.十、培养物在day22
‑
day25时，取出，沉降后用accutase消化15min后，吹打成单细胞，用n
‑
mscs第一阶段培养基明胶包被的培养瓶，每3天进行半换液一次。第二次半换液时，去掉悬浮细胞。
99.十一、待贴壁细胞铺满70％时，进行传代培养，使用商品化无血清mscs培养基，此时培养的n
‑
mscs记为p1代，细2胞显微镜下示意图如图1所示。所述无血清mscs培养基为lonza公司12
‑
725fultraculture无血清培养基或安徽中盛溯源生物科技有限公司货号rp01020的nctarget培养基。
100.十二、在p3代时，收集细胞进行mscs相关表面标志物鉴定和多向分化潜能鉴定，细胞显微镜下示意图如图1所示。
101.将p3代的间充质干细胞接着进行流式检测，进一步验证了得到的细胞为间充质干细胞，结果如图2
‑
图3所示。
102.本实施例还设置对照组，对照组与上述方法的唯一区别在于第一阶段培养基配方中不添加聚乙烯醇。实验发现，对照组没有办法长成类器官。
103.实施例3
104.本实施例研究间充质干细胞对小鼠神经修复功能的影响。本实施例利用ad模型(阿尔茨海默病)小鼠(双转基因，人类早老素和aβ)进行治疗效果评价，实验分为四组：
105.pbs组：对照组；
106.msc组：脐带来源mscs；
107.tc组：另一个课题，基因修饰的msc，利用aav在人脐带mscs过表达timp2n
‑
msc；n
‑
msc组：端脑类器官来源mscs，即实施例2制备得到的间充质干细胞。
108.实验设计如下：
109.实验设计：随机分组，每组9只小鼠，其中选取三只小鼠，做dg增殖期神经干细胞的gfp逆转录病毒标记，主要为今后分析mscs治疗后对新生神经元发育、神经网络整合能力的评估。
110.治疗：治疗周期为8周，每周进行一次尾静脉注射，细胞组剂量为105细胞/只小鼠。治疗完后，第9w做矿场实验和新物体识别实验；第10w
‑
12w做巴恩斯迷宫实验；第13w做条件恐惧实验。
111.小鼠牺牲后，检查全身脏器，没有明显肿瘤产生；小鼠每组6只灌注固定，3只直接液氮冻存、取海马区域组织送测序。
112.具体试验结果如下：
113.一、对四组小鼠进行矿场实验，实验结果如图4
‑
5所示，从图中可以得出，四组小鼠活动程度相似，n
‑
msc治疗组小鼠更加活泼、大胆。
114.二、对四组小鼠进行新物体识别试验，得分％＝探索新物体时间/探索新物体时间 探索旧物体时间。结果如图6所示，从图中可以看出，治疗组对新物体识别得分更高，n
‑
msc治疗组小鼠短时记忆更佳。
115.三、对四组小鼠进行条件恐惧试验，发现n
‑
msc治疗组的情景恐惧得到了明显改善，而线索提示的恐惧测试无明显差异，试验结果如图7所示。
116.四、对四组小鼠进行巴恩斯迷宫试验，发现在适应期后第一天，第一次训练时间具
有明显差异，表明n
‑
msc治疗组小鼠有更强的学习能力，结果如图8所示。
117.第四天训练结果显示所有小鼠均可以在30秒之内找到目标洞，表明训练成功，可用于测试，结果如图9所示。
118.第五天测试结果显示无明显差异，表明四组小鼠短时记忆相似；第12天结果表明n
‑
msc治疗组小鼠的长时记忆得到了改善，结果如图10所示。
119.五、对四组小鼠的基因进行了差异基因表达测序，结果如图11所示。
120.六、对四组小鼠脑切片
‑
神经元长度分析，流程如图12所示，结果示意图如图13
‑
14所示。
121.进一步研究神经元复杂程度，结果如图15所示，n
‑
msc组小鼠神经元更长，分支更多差异具有统计学意义。
122.七、对四组小鼠的神经元末端轴突(spine)进行研究，共聚焦显微镜拍摄新生神经元末端5μm，使用neurolucida分类计数spine，如图16
‑
17所示，图中thin指纺锤型，stubby指哑铃型，mushroom指蘑菇型。从图中可以看出，n
‑
msc组小鼠spine总数量最多，神经元轴突更加成熟。
123.八、研究四组小鼠脑切片中的神经干/祖细胞数量，结果如图18所示。经治疗后的小鼠神经干细胞(共阳)数量更多，表明msc有较强的维持干性作用。
124.九、对四组小鼠脑切片中的小胶质细胞形态进行分析，结果如图19所示，小鼠dg、ca1区域iba
‑
1阳性细胞数量无明显差异经治疗后，小鼠小胶质细胞分支数减少，差异具有统计学意义。
125.进一步研究如图20所示，结果发现n
‑
msc治疗组小鼠小胶质细胞胞体更小、分支数更少、分支长度更短。图21为脑类器官培养过程中未添加聚乙烯醇和添加1％聚乙烯醇的对比图。图22为添加聚乙烯醇后脑类器官的表面标志物表达情况。图23为添加聚乙烯醇后各个培养时期的脑类器官。
126.综上所述可知，本发明中制备得到的间充质干细胞具有神经修复的潜力，未来有可能用于治疗阿尔茨海默症的药物中。
127.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种悬浮培养脑类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；所述培养基包括neaa 1％
‑
2％、glumax1％
‑
2％、mercaptoethanol80
‑
120nm；所述第一阶段培养基包括：gmem基础培养基、kosr12
‑
18％、dorsomorphin0.8
‑
1.5μm、a83
‑
010.8
‑
1.2μm和聚乙烯醇0.5
‑
1.5％；所述第二阶段培养基包括：gmem基础培养基、n2 1％
‑
2％、sb
‑
431542 0.8
‑
1.2μm、chir
‑
99021 0.8
‑
1.2μm、聚乙烯醇0.8
‑
1.5％；所述第三阶段培养基包括：mem基础培养基、n2 1％
‑
2％、sb
‑
431542 0.8
‑
1.2μm、chir
‑
99021 0.8
‑
1.2μm、martigel 0.8
‑
1.5％、聚乙烯醇0.8
‑
1.5％；所述第四阶段培养基包括：gmem基础培养基、n2 1％
‑
2％、b27 2％
‑
3％、胰岛素2μg/ml。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括1％的聚乙烯醇。3.一种利用权利要求1所述的培养基制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：s1：采用第一阶段培养基悬浮培养人多能干细胞；s2：在d4
‑
d6、d7
‑
d14、d15
‑
d21依次将培养基更换为第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；s3：将细胞转入微型类器官生物反应器中，培养3
‑
4天后接种到明胶包被的培养容器中，采用n
‑
mscs第一阶段培养基进行贴壁培养得到间充质干细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一阶段培养基中包括y
‑
27632，所述y
‑
27632的浓度为8
‑
12μm。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括步骤s4：待s3中的间充质干细胞汇合率为70
‑
80％时，采用无血清mscs培养基进行传代培养。6.根据权利要求3
‑
5任一项所述方法得到的间充质干细胞。7.一种药物，其特征在于，所述药物包括间充质干细胞。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物为治疗阿尔茨海默症的药物。9.根据权利要求6所述的间充质干细胞在神经修复领域中的应用。优选的，所述间充质干细胞在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。10.根据权利要求1
‑
2所述的培养基在制备间充质干细胞中的应用。
技术总结
本发明属于生物领域，尤其涉及一种悬浮培养脑类器官的培养基及其应用。所述培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；所述培养基包括NEAA 1％


技术研发人员：马峰 张勇刚 赖默温
受保护的技术使用者：成都云测医学生物技术有限公司
技术研发日：2021.03.26
技术公布日：2021/6/29