一种基于钠离子通道Nav1.1的海洋神经毒素荧光快速筛查方法与流程

一种基于钠离子通道nav1.1的海洋神经毒素荧光快速筛查方法
技术领域
1.本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于钠离子通道nav1.1的海洋神经毒素荧光快速筛查方法。


背景技术：

2.海洋毒素(marine toxins)是海洋生物体内的特殊代谢成分，大多具有强烈毒性，主要由浮游植物或微生物产生，并可通过食物链在特定物种中累积和富集。海产品是人类重要的食物来源，由食用海产品而引发的海洋毒素中毒事件屡见不鲜。在众多海洋毒素中，毒性最强、致死率最高的是海洋神经毒素，主要包括：河豚毒素、石房蛤毒素、短裸甲藻毒素、西加毒素、海葵毒素等，以及它们的结构类似物。它们大都特异性作用于神经和肌肉细胞膜上的电压门控钠离子通道(voltage
‑
gated sodium channels,vgscs)，从而影响动作电位和神经、肌肉间兴奋信号的传导，产生严重的神经系统、呼吸系统、心血管系统急性中毒症状，甚至导致死亡。
3.本研究基于获得的稳定表达人神经细胞钠离子通道nav1.1的cho细胞，以及对跨膜电位敏感的商品化红色荧光染料aat bioquest,quest membrane potential assay kit*red fluorescence*，优化建立了钠离子通道nav1.1靶向毒性测定荧光传感技术，能够快速、高通量实现海洋神经毒素筛查，以及作用类别(激动作用、抑制作用)鉴定和毒性当量的半定量测定。该技术可用于未知海洋神经毒素的发现预警、高通量筛查、毒素作用类别及毒性强弱的初步鉴定，也可用于相关药物初筛等领域。
4.电压门控钠离子通道，是广泛存在于动物的神经系统、心脏、肌肉等组织中可兴奋细胞膜上的膜蛋白，参与动作电位的产生和传导。迄今为止，已在哺乳动物体内分离鉴定出9种亚型：nav1.1～nav1.9。该类蛋白由α亚基和β亚基组成，其中α亚基由四个对称的同源重复功能区(i～iv)组成，形成钠离子传输孔道结构。目前，在哺乳动物神经元vgscs上已发现六个毒素作用靶位，分布于α亚基的细胞膜外侧、通道孔内侧和跨膜段上，依次命名为位点1至位点6(site 1～site 6)。其中nav1.1主要存在于人的神经细胞，是许多神经药物和神经毒素特异性作用的靶点，结合后表现为拮抗剂或激动作用，从而影响动作电位和神经、肌肉间兴奋信号的传导。
5.海洋神经毒素虽然结构各异，但均能高选择性、高亲和性的作用于vgscs，表现为拮抗剂或激动剂，从而引发神经系统、呼吸系统、心血管系统急性中毒症状，甚至导致死亡。
6.海洋神经毒素现有检测方法主要可分为，以分析化学为基础的结构测定方法和以毒理学为基础的毒性测定方法。结构测定方法主要依赖色谱、质谱等分析技术，基于毒素标准品对毒素种类和含量进行精准测定。毒性测定方法包括：(1)基于毒性效应的测定方法，如小鼠动物实验、细胞毒性分析等，根据中毒症状反映化合物的毒性强弱。(2)测定化合物与毒性靶点(如钠离子通道)的相互作用，指示其毒性。
7.海洋神经毒素的现有检测方法主要包括两大类：以毒理学为基础的毒性测定方法
(如，小鼠生物实验、细胞毒性分析、受体靶向结合分析)和以分析化学为基础的结构测定方法(如，液质联用法)。
8.结构测定法通常采用色谱
‑
质谱联用技术，根据毒素标准品进行定性定量；但无法对缺少标准品、目标毒素结构不明确以及完全未知的毒素进行筛查分析。基于毒性效应的小鼠生物实验和细胞毒性分析法，能够反映出化合物的综合毒性效应，可指示未知毒素的存在，但无法鉴别毒素的作用类型，且实验周期较长，特别是动物实验法对待测化合物的消耗量较大。
9.受体靶向结合分析，通过直接或间接测定化合物与钠离子通道靶点的相互作用，指示其毒性，同时可明确作用类型，测定时间相对较短，可通过设计优化合适的信号传感体系，实现快速检测。
10.膜片钳技术是目前研究化合物与离子通道相互作用的主要技术，它通过玻璃微电极吸管把含有离子通道的细胞膜通过负压吸引封接，测量离子通道的离子电流来反映细胞膜单一或多个离子通道的分子活动。膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”，广泛用于现代细胞电生理研究。但膜片钳技术对仪器和人员操作要求较高，筛选通量不高，费用昂贵，制约了大规模筛选的应用。为此，开发快速、高通量、低成本的以神经系统离子通道nav1.1为靶点的筛查技术对于海洋神经毒素的发现和鉴别具有重要意义。
11.海洋神经毒素通过与钠离子通道相互作用，以激动剂或抑制剂的模式影响细胞的跨膜电位及钠电流，从而产生毒性作用。因此，可通过以下三种方式指示其相互作用：(1)直接监测钠电流(如，膜片钳技术)、(2)测定细胞中钠离子浓度的变化、(3)测定跨膜电位的变化。
12.测定细胞内钠离子浓度变化的检测方法需要专一的钠指示剂染料，该染料与钠离子结合后会发出荧光信号，目前有一些市售染料可以选择。它们均以乙酰氧基甲基(am)形式提供，从而能够在细胞膜上进行被动扩散。一旦进入细胞内，am酯就会被内源性酯酶水解，从而使染料被限制在细胞内。该方法中，细胞外的钠指示剂染料必须要洗涤除去，或加入一些猝灭剂消除细胞外荧光。
13.目前，尚未见报道以nav1.1通道为靶点的，以监测跨膜电位为原理的荧光快速检测方法。本方案在稳定表达nav1.1离子通道蛋白的cho细胞基础上，采用对跨膜电位敏感的红色荧光染料，优化实验条件，建立了钠离子通道nav1.1靶向毒性测定荧光筛查技术，可快速进行激动剂和抑制剂初筛，获得激动/抑制曲线及ec50/ic50值，为海洋神经毒素的低成本快速筛查提供策略。


技术实现要素：

14.本公开采用稳定表达人神经细胞钠离子通道nav1.1的cho细胞(nav1.1
‑
cho)和对跨膜电位敏感的商品化红色荧光染料aat bioquest,quest membrane potential assay kit*red fluorescence*，优化实验条件，分别建立激动模式和抑制模式的nav1.1靶向毒性测定荧光检测技术。
15.本公开提供了一种海洋神经毒素荧光的快速筛查方法，包括：
16.(1)激动作用筛查：向含有nav1.1的cho细胞中加入待测化合物及阴性对照和阳性对照，酶标仪检测；
17.(2)抑制作用筛查：向含有nav1.1的cho细胞中加入待测化合物及阴性对照和阳性对照，再加入给定剂量激动剂藜芦定，酶标仪检测；
18.(3)生成报告。
19.在一个优选的实施方案中，在步骤(1)中，阴性对照为hhbs缓冲液，阳性对照为藜芦定(veratridine)。
20.在一个优选的实施方案中，步骤(1)包括：
21.①
配制荧光染料工作液；
22.②
将含有待测化合物的待测化合物储备液稀释为待测工作液；
23.③
细胞培养：培养含有nav1.1的cho细胞；
24.④
去除细胞培养孔中液体，向细胞培养孔中加入荧光染料工作液及hhbs缓冲液，37℃培养箱孵育30min，然后室温放置30min；
25.⑤
酶标仪检测：向含有nav1.1的cho细胞中分别加入待测工作液、阴性对照和阳性对照，检测。
26.在一个优选的实施方案中，在步骤
①
中，将膜电位红色荧光染料以1：10比例用hhbs缓冲液稀释，配置成荧光染料工作液。
27.膜电位红色荧光染料是一类慢响应探针，其光学反应的幅度比快速响应探针大得多，通常为每mv变化1％荧光值，适合于离子通道活动引起的电位变化的检测。原理如图1所示。荧光染料与细胞孵育后，吸附到细胞膜外层，并与猝灭剂结合，此时酶标仪读数为基数。在正常生理状态下，钠离子通道nav1.1处于封闭状态，当加入激动剂时，钠离子通道开放，钠离子流入细胞内，细胞内电位升高，荧光染料的趋正电性使它进入到细胞内层膜，远离外液中荧光淬灭分子，荧光信号大大提高，该模式可测定钠离子通道激活剂；相反，在测定钠离子通道抑制剂时，以藜芦定作为激活剂，维持钠通道开放状态，获得强荧光信号，当加入抑制剂时，藜芦定不能有效开放离子通道，荧光信号明显减弱，该模式可测定钠离子通道抑制剂。在激动或抑制模式，均可实现毒素快速初筛、测定激动/抑制曲线及ec50/ic50值。
28.在一个优选的实施方案中，在步骤
②
中，将待测化合物储备液以hhbs缓冲液稀释至合适的单点浓度1μm～20μm，作为待测工作液。
29.在一个优选的实施方案中，在步骤
③
中，所用cho细胞为含有nav1.1的cho细胞，nav1.1基因信息：人nav1.1(scn1a)，nm_001165963，cds大小为6030bp。
30.在一个优选的实施方案中，在步骤
⑤
中，酶标仪参数设置如下：激发光：620nm；发射光：665nm，出板加入待测工作液50μl/孔，进板检测1.0min，间隔300ms，逐孔加药检测。
31.在一个优选的实施方案中，将待测化合物储备液以hhbs缓冲液逐级稀释8
‑
10个梯度浓度，作为待测工作液待用，测定时，逐孔依次测定梯度浓度的待测工作液，绘制荧光—浓度的激动曲线。
32.在一个优选的实施方案中，在步骤(2)中，阴性对照为hhbs缓冲液，阳性对照为河豚毒素。
33.在一个优选的实施方案中，步骤(2)包括：
34.①
配制荧光染料工作液；
35.②
将藜芦定储备液用hhbs缓冲液稀释为藜芦定工作液；
36.③
将待测化合物稀释为待测工作液；
37.④
细胞培养：培养含有nav1.1的cho细胞，铺板约18h，细胞长到80％左右，可进行检测；
38.⑤
去除细胞培养孔中液体，向细胞培养孔中加入荧光染料工作液及hhbs缓冲液，37℃培养箱孵育30min，然后室温放置30min；
39.⑥
酶标仪检测：向含有nav1.1的cho细胞中分别加入待测工作液、阴性对照和阳性对照，再加入藜芦定工作液，检测。
40.在抑制模式下，需预先加入藜芦定开放钠离子通道，因此需对其浓度进行优化。
41.在一个优选的实施方案中，在步骤
①
中，将膜电位红色荧光染料以1：10比例用hhbs缓冲液稀释，配置成荧光染料工作液。
42.在一个优选的实施方案中，在步骤
③
中，将待测化合物储备液以hhbs缓冲液稀释至合适的单点浓度1μm～20μm，作为待测工作液。
43.在一个优选的实施方案中，在步骤
④
中，所用cho细胞为含有nav1.1的cho细胞，nav1.1基因信息：人nav1.1(scn1a)，nm_001165963，cds大小为6030bp。
44.在一个优选的实施方案中，在步骤
⑥
中，酶标仪参数设置如下：激发光：620nm；发射光：665nm，出板加入待测工作液20μl/孔，进板检测1.0min，间隔300ms，再出板加入50μl/孔藜芦定工作液，进板检测1.0min，逐孔加药检测
45.在一个优选的实施方案中，将待测化合物储备液以hhbs缓冲液逐级稀释8
‑
10个梯度浓度，作为待测工作液待用，测定时，逐孔依次测定梯度浓度的待测工作液，绘制荧光—浓度的抑制曲线。
46.本公开具有如下优点：
47.本公开在稳定表达nav1.1离子通道蛋白的cho细胞基础上，采用对跨膜电位敏感的红色荧光染料，优化实验条件，建立了钠离子通道nav1.1靶向毒性测定荧光筛查技术，可快速进行激动剂和抑制剂初筛，获得激动/抑制曲线及ec50/ic50值，为海洋神经毒素的低成本快速筛查提供策略。
附图说明
48.附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
49.图1为示出了钠离子通道靶点荧光筛查工作原理的示意图；
50.图2为示出了藜芦定工作浓度筛选实时荧光图的示意图；
51.图3为示出了藜芦定的激动曲线的示意图；
52.图4为示出了河豚毒素的抑制曲线的示意图；
53.图5为示出了无关化合物在激动和抑制模式下的荧光变化的示意图；
54.图6为示出了多种化合物nav1.1抑制效应初筛示意图；
55.图7为示出了多种化合物nav1.1激动效应初筛示意图；
56.图8为示出了各抑制剂的抑制曲线及ic50值的示意图；
57.图9为示出了各激动剂的激动曲线及ec50值的示意图。
具体实施方式
58.下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
59.需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
60.实施例
61.具体实验步骤如下：
62.溶液配制：
63.(1)1m hepes溶液配制：称量2.38g hepes粉末，加入超纯水，定容到10ml。
64.(2)hhbs缓冲液配制：吸取49ml hbss缓冲液(hank's平衡盐溶液)，加入1ml 1m的hepes溶液(终浓度为20mm)。
65.实施例1nav1.1
‑
cho细胞培养及实验准备
66.本实验选用稳定表达nav1.1通道的cho细胞系，即nav1.1
‑
cho(nav1.1基因信息：人nav1.1(scn1a)，nm_001165963，cds大小为6030bp)。在细胞培养皿中，采用含10％fbs、1％青霉素/链霉素混合液(100
×
)以及200μg/ml潮霉素b的f
‑
12培养基，置于37℃恒温、5％co2细胞培养箱中培养。将nav1.1
‑
cho稳转细胞转至96孔细胞培养板，每孔5
×
104个细胞，96孔板提前加pll包被过夜。铺板约18h，细胞长到80％左右，可进行检测。
67.实施例2海洋神经毒素快速初筛——激动剂初筛
68.①
将膜电位红色荧光染料以1：10比例用hhbs缓冲液稀释，配置成荧光染料工作液；
69.②
将各待测化合物储备液以hhbs缓冲液稀释至合适的单点浓度(5
×
终浓度，建议500nm～10μm)；
70.③
将含有待测nav1.1
‑
cho细胞的96孔板从孵箱中取出，置于室温；
71.④
去除原孔培养基，每孔加入100μl hhbs缓冲液，每孔加入100μl荧光染料工作液，37℃培养箱孵育30min，然后室温放置30min；
72.⑤
酶标仪检测，酶标仪实验参数设置如下：激发光：620nm/10；发射光：665nm/8。出板加入待测化合物50μl/孔，进板检测1.0min，间隔300ms。逐孔加药检测。同时做阴性对照(hhbs缓冲液)和阳性对照(藜芦定)。
73.实施例3海洋神经毒素快速初筛——抑制剂初筛
74.①
将膜电位红色荧光染料以1：10比例用hhbs缓冲液稀释，配置成荧光染料工作液；
75.②
将藜芦定储备液用hhbs缓冲液稀释为工作液(5
×
终浓度)，即150μm；
76.③
将各待测化合物储备液以hhbs缓冲液稀释至合适的单点浓度(12.5
×
终浓度，建议1μm～20μm)；
77.④
将含有待测nav1.1
‑
cho细胞的96孔板从孵箱中取出，置于室温；
78.⑤
去除原孔培养基，每孔加入80μl hhbs缓冲液，每孔加入100μl荧光染料工作液，37℃培养箱孵育30min，然后室温放置30min；
79.⑥
酶标仪检测，酶标仪实验参数设置如下：激发光：620nm/10；发射光：665nm/8。出
板加入待测化合物(12.5
×
)20μl/孔，进板检测1.0min，间隔300ms，出板加入藜芦定工作液50μl/孔，进板检测1.0min。逐孔加药检测。同时做阴性对照(hhbs缓冲液)和阳性对照(河豚毒素)。
80.实施例4激动曲线绘制及ec50测定
81.将待测化合物储备液逐级以hhbs缓冲液稀释8
‑
10个浓度，作为待测工作液待用。其他操作与“激动剂初筛相同”，测定时，逐孔依次测定梯度浓度的待测工作液，绘制荧光—浓度曲线。
82.实施例5抑制曲线绘制及ic50测定
83.将待测化合物储备液逐级以hhbs缓冲液稀释8
‑
10个浓度，作为待测工作液待用。其他操作与“抑制剂初筛相同”，测定时，逐孔依次测定梯度浓度的待测工作液，绘制荧光—浓度曲线。
84.实施例6实验条件优化：
85.(1)荧光探针的选择
86.本实验选用对跨膜电位敏感的商品化红色荧光探针aat bioquest,quest membrane potential assay kit*red fluorescence*与其猝灭剂配合使用，该荧光染料是一类慢响应探针，其光学反应的幅度比快速响应探针大得多，通常为每mv变化1％荧光值，适合于离子通道活动引起的电位变化的指示。
87.(2)抑制模式下藜芦定工作液浓度优化
88.在抑制模式下，需预先加入藜芦定开放钠离子通道，因此需对其浓度进行优化。不同浓度下(0μm～200μm)，藜芦定作为激动剂的实时荧光变化如图2所示。随藜芦定浓度增加，荧光信号的强度和增速均逐渐增大，实验最终选择约80％最大值信号位置，即30μm作为藜芦定工作浓度，该浓度下荧光信号较强，且变化敏锐，适于指示抑制剂的作用效果。
89.(3)方法验证
90.①
激动剂模式通过已知的钠离子通道激动剂——藜芦定进行验证。
91.激动曲线如图3所示。随藜芦定浓度增加，荧光信号的强度显著增大，验证了藜芦定作为激动剂对钠离子通道的开放作用，其ec50约为24μm。
92.②
抑制剂模式通过已知的钠离子通道抑制剂——河豚毒素(ttx)进行验证。
93.抑制曲线如图4所示，在不同浓度ttx存在下，藜芦定对钠离子通道的打开能力受到不同程度的抑制，ttx浓度越高，离子通道越无法打开，导致荧光强度与只有藜芦定存在时发生明显下降，当ttx浓度达到100nm时，几乎完全抑制了30μm藜芦定的通道开放作用。从抑制曲线可获得ttx的ic50值约为18nm，为nav1.1的强抑制剂。
94.③
对于与nav1.1通道没有相互作用的化合物14#：扇贝毒素2(ptx2)。
95.按照本方法测定的激动和抑制模式下的荧光变化如图5所示。激动模式下，随化合物浓度升高，荧光信号一直处于基线水平，无显著升高。在抑制模式下，随化合物浓度的升高，荧光信号一直处于30μm藜芦定激发的信号强度，无明显下降。证明该化合物14#与nav1.1通道无相互作用。
96.实施例7海洋神经毒素nav1.1靶向毒性测定——初筛
97.采用本公开建立的方法，对于12种海洋毒素进行激动剂和抑制剂初筛：所述12种海洋毒素为：
98.1#：dcgtx2&3(脱氨甲酰基膝沟藻毒素2&3)；
99.2#：stx(石房蛤毒素)；
100.3#：gtx1&4(膝沟藻毒素1&4)；
101.4#：dcstx(脱氨甲酰基石房蛤毒素)；
102.5#：gtx2&3(膝沟藻毒素2&3)；
103.6#：dtx1(鳍藻毒素1)；
104.7#：gtx6(膝沟藻毒素6)；
105.8#：dtx2(鳍藻毒素2)；
106.9#：oa(大田软海绵酸)；
107.10#：短裸甲藻毒素1(brevetoxin1)；
108.11#：短裸甲藻毒素2(brevetoxin2)；
109.12#：短裸甲藻毒素3(brevetoxin3)。
110.首先，在抑制剂模式下，采用100nm被测物 30μm藜芦定测定体系，结果如图6所示，1#、2#、3#、4#、5#表现出强抑制剂作用，7#表现出弱抑制剂作用，而6#、8#、9#、10#、11#、12#没有抑制作用。
111.进而，对8#～12#继续进行激动剂模式的初筛，结果见图7，与对照相比，10#、11#、12#显示出明显的激动效应，8#、9#无激动效应。
112.(1)海洋神经毒素nav1.1靶向毒性测定——抑制曲线及ic50
113.对上述初筛中表现为强抑制剂的化合物1#、2#、3#、4#、5#、7#、进行抑制曲线的测定，结果如图8。化合物ic50值显示了其毒性强弱。其中gtx1&4毒性最强(ic50＝0.439)，约为ttx的40倍；stx和dcstx毒性也都强于ttx，gtx2&3毒性与ttx基本相当。
114.(2)海洋神经毒素nav1.1靶向毒性测定——激动曲线及ic50
115.对上述初筛中表现为强激动剂的化合物10#、11#、12#进行激动曲线的测定，结果如图9。化合物ec50值显示了其毒性强弱。其中裸藻毒素1表现出极强的钠通道毒性，ec50为8.47nm。
116.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
117.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本技术的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
118.本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。