一种聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物高分子材料在抗肿瘤治疗应用方面一直发挥着不可或缺的重要作用，其在纳米疫苗载体及基因转染载体设计用于抗肿瘤治疗中有很大的应用潜力及开发前景。但是由于纳米疫苗效率低，组分复杂，基因载体材料毒性大，转染效率低等问题，使得高分子材料在纳米疫苗及基因载体的临床应用中发展缓慢。因此开发新型的高分子材料用于肿瘤疫苗载体及基因载体设计，加快纳米疫苗及基因治疗用于癌症治疗的临床转化，具有十分重要的意义。
3.阳离子聚合物是一种广泛应用于抗肿瘤领域的高分子材料，例如聚赖氨酸，pei，聚(β
‑
氨基酯)等。由于pei结构简单，官能团可修饰性强，高分子拓扑结构具有多样性，细胞转染效率高等优势，一直在纳米疫苗载体设计及基因载体设计中占有独特的优势。但同时由于pei对蛋白及核酸分子担载效率低，担载不稳定，以及具有转染效率与细胞毒性存在相互制约的矛盾，极大地阻碍了pei的应用，限制了pei进一步推入临床应用的发展。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用，制备的聚乙烯亚胺衍生物细胞毒性较低，且转染效率高。
5.为达到上述目的，本发明提供了一种聚乙烯亚胺衍生物，由pei与含氮杂环小分子键合得到。
6.本发明优选的，所述pei的分子量为800da≤mn≤250kda。更优选为10kda。
7.所述pei的结构可以为超支化结构或线性结构。优选为超支化结构。
8.本发明优选的，所述含氮杂环小分子为羟基和/或羧基取代的五元、六元、七元含氮杂环分子或其苯并结构。
9.更优选为羟基和/或羧基取代的噁唑、异噁唑、苯并噁唑、噻唑、苯并噻唑、吡唑、吲唑、咪唑、苯并咪唑、吡啶、喹啉、异喹啉、嘧啶、喹唑啉、吡嗪、喹喔啉、哒嗪、噌啉、哌啶、四氢异喹啉、哌嗪、高哌啶中的一种或多种。
10.在本发明的一些具体实施例中，所述含氮杂环小分子选自噁唑
‑5‑
羧酸(5oxa)，异噁唑
‑5‑
羧酸(5iso)，苯并噁唑
‑5‑
羧酸(5boxa)，苯并噁唑
‑6‑
羧酸(6boxa)，噻唑
‑5‑
羧酸(5thi)，苯并噻唑
‑5‑
羧酸(5bthi)，苯并噻唑
‑6‑
羧酸(6bthi)，吡唑
‑4‑
羧酸(4pyr)，吲唑
‑4‑
羧酸(4ind)，吲唑
‑5‑
羧酸(5ind)，吲唑
‑6‑
羧酸(6ind)，吲唑
‑7‑
羧酸(7ind)，咪唑
‑4‑
羧酸(4imi)，苯并咪唑
‑4‑
羧酸(4bimi)，苯并咪唑
‑5‑
羧酸(5bimi)，吡啶
‑4‑
羧酸(4prd)，嘧啶
‑5‑
羧酸(5pmd)，吡嗪
‑2‑
羧酸(2prz)，哒嗪
‑4‑
羧酸(4pdz)，哌啶
‑2‑
乙酸(2ppd)，哌嗪
‑2‑
羧酸(2ppz)，喹啉
‑3‑
羧酸(3qnl)，喹唑啉
‑6‑
羧酸(6qzl)，喹喔啉
‑2‑
羧酸(2qol)，噌啉
‑4‑
羧酸(4cnl)，3
‑
(2
‑
乙基哌啶
‑1‑
基)丙酸(pipe)，异喹啉
‑1‑
羧酸(1iql)，四氢异喹啉
‑3‑
羧酸(3tiql)，n
‑
(2
‑
羟乙基)六亚甲二胺(hpip)中的任意一种或多种。
11.相对应的结构式如下表1所示：
12.表1含氮杂环小分子结构式
[0013][0014]
进一步优选为噻唑
‑5‑
羧酸，吲唑
‑4‑
羧酸，吲唑
‑5‑
羧酸，咪唑
‑4‑
羧酸，苯并咪唑
‑4‑
羧酸，苯并咪唑
‑5‑
羧酸。
[0015]
更优选为噻唑
‑5‑
羧酸，咪唑
‑4‑
羧酸，苯并咪唑
‑4‑
羧酸。
[0016]
最优选为苯并咪唑
‑4‑
羧酸。
[0017]
本发明中，所述含氮杂环小分子的取代基还可以包括：氨基、烷基、芳香基团、卤素等非活性取代基团中的一种或多种。
[0018]
上述羟基和/或羧基取代基团作为活性基团，与pei的氨基进行酰胺缩合或酯化反应，使含氮杂环小分子和pei通过氨基羧酸酯键或酰胺基团键合到一起。
[0019]
本发明优选的，所述pei与含氮杂环小分子的键合比例为：在线性结构pei上对仲胺的键合比例为10％
‑
90％，更优选为40％
‑
70％，进一步优选为60％
‑
70％。
[0020]
在超支化结构pei上对伯胺的键合比例为10％
‑
90％，更优选为40％
‑
70％，进一步优选为60％
‑
70％。
[0021]
本发明对上述超支化结构的pei衍生物的制备方法并无特殊限定，按照本领域技术人员熟知的方法，使pei与含氮杂环小分子进行酰胺缩合或羟基与氨基缩合等反应键合即可。
[0022]
本发明对于线性结构的pei衍生物制备，可以先利用n
‑
boc
‑
溴乙胺卤代反应在线性pei主链上引入侧链，然后通过三氟乙酸脱保护的方法得到末端为氨基的侧链。随后基于线性pei的含氮杂环修饰的衍生物的制备方法同超支化pei衍生物的制备方法。
[0023]
本发明优选的，反应结束后，产物经过在milliq水中酸化透析纯化处理。
[0024]
进一步优选的，透析时用ph值3
‑
7的milliq水梯度进行，每6
‑
8小时换一次水，ph值调节跨度为1，最后用ph值为7的纯milli q水透析3次，冻干处理，收集产物即可。
[0025]
本发明提供了聚乙烯亚胺衍生物在制备疫苗制剂及肿瘤治疗制剂中的应用，如纳米疫苗或治疗性基因载体。
[0026]
具体的，本发明提供了一种纳米疫苗制剂，为上述聚乙烯亚胺衍生物和蛋白或mrna类抗原直接物理混合后得到。
[0027]
由于载体本身具有免疫刺激功能，本发明提供的上述纳米疫苗可以简化疫苗设计，提高疫苗响应率。
[0028]
优选的，所述聚乙烯亚胺衍生物与蛋白或mrna类抗原的担载质量比例为1/1。
[0029]
优选的，所述聚乙烯亚胺衍生物与蛋白或mrna类抗原的溶解初始浓度均为1mg/ml。
[0030]
优选的，上述物理混合过程需要在涡旋条件下，将蛋白或mrna类抗原缓慢滴加入聚乙烯亚胺衍生物溶液中，继续涡旋10分钟即可。
[0031]
本发明还提供了一种基因治疗制剂，为上述聚乙烯亚胺衍生物和治疗性基因直接物理混合后得到。
[0032]
所述治疗性基因可以为mrna、dna等本领域技术人员熟知的治疗性基因。
[0033]
优选的，所述聚乙烯亚胺衍生物和治疗性基因的担载质量比为4/1～8/1。
[0034]
更有选的，聚乙烯亚胺衍生物和治疗性基因的担载质量比为5/1。
[0035]
优选的，所述聚乙烯亚胺衍生物与治疗性基因的溶解初始浓度均为0.2 mg/ml。
[0036]
优选的，上述物理混合过程需要在涡旋条件下，将核酸物质，dna质粒或mrna等治疗性基因缓慢滴加入聚乙烯亚胺衍生物溶液中，继续涡旋5分钟即可。
[0037]
本发明将得到的聚乙烯亚胺衍生物在dc2.4细胞上进行筛选，得到了优选的材料：咪唑
‑4‑
羧酸(4imi)，苯并咪唑
‑4‑
羧酸(4bimi)及苯并咪唑
‑5‑
羧酸(5bimi)修饰的pei衍生物材料。并且在小鼠骨髓来源的dc细胞(bmdcs)和人源单核细胞(thp
‑
1)上验证了其刺激免疫响应的机理为激活了sting固有免疫通路。将得到的最优选材料pei
‑
4bimi与抗原蛋白ova简单复合制得纳米疫苗bivax，在小鼠抑瘤实验上取得了显著的治疗效果，无毒副作用。并且可以针对肿瘤组织裂解提取的抗原蛋白通过相同的方法制备成个性化bivax，实现了肿瘤术后个性化治疗的显著效果，明显延长了小鼠生存期，并取得显著的治愈效果。
[0038]
进一步地，本发明将几种优选材料：4imi，4bimi，5bimi及吡唑
‑4‑
羧酸(4pyr)修饰的pei衍生物材料，用于b16f10细胞上进行细胞毒性及转染测试。结果显示pei
‑
m不仅极大
地降低了对b16f10的细胞毒性，而且相对于纯pei材料得到了更高地转染效率。
[0039]
与现有技术相比，本发明提供了一种聚乙烯亚胺衍生物，由pei与含氮杂环小分子键合得到。本发明利用含氮杂环结构改性降低pei的毒性并赋予其固有免疫刺激功能。本发明同时测试了这类pei衍生物用于肿瘤疫苗设计、治疗性基因载体的设计等领域，证明其在各方面都表现出了显著的优势。
[0040]
经验证上述聚乙烯亚胺衍生物具有刺激sting免疫通路激活的功能，且在鼠源和人源的细胞系上同样有效。随后与抗原蛋白ova复合得到粒径均一的bivax，经体内淋巴结回流验证筛选出最优结构为pei
‑
4biim。随后用于肿瘤治疗时得到了良好的治疗效果，并引起了系统性的抗原特异性的t细胞免疫响应。并且可作为个性化肿瘤抗原蛋白的载体制备成个性化的bivax用于肿瘤的术后治疗，并取得了显著的治疗效果，明显延长了小鼠的生存期。
[0041]
此外，将pei
‑
m用于b16f10细胞转染效率的测评，得到了几种较优的材料，pei
‑
4pyr，pei
‑
4imi，pei
‑
4bimi，pei
‑
5bimi。这些材料不仅降低了对b16f10的细胞毒性，也明显提高了质粒的转染效率，可能是一种良好的核酸递送的载体。
附图说明
[0042]
图1为实施例1制备的羧基端五元环及六元环含氮杂环分子修饰的pei代表性材料pei
‑
4bimi的1h nmr表征，以及实施例2中制备的羟基端七元环含氮杂环分子修饰的pei材料pei
‑
hpip的1h nmr表征；
[0043]
图2为实施例3验证得到的经过50μg/ml pei
‑
m处理dc2.4细胞24小时后细胞上清中ifn
‑
β浓度含量；
[0044]
图3为实施例4验证得到的六种五元含氮杂环小分子修饰的pei
‑
m对dc2.4细胞的24h时的细胞毒性；
[0045]
图4为实施例5验证的的三种pei
‑
m材料处理的bmdcs细胞和thp
‑
1细胞内sting通路相关蛋白的磷酸化表达情况；
[0046]
图5为实施例6制备的pei
‑
m担载ova抗原蛋白(pei
‑
m/ova)得到的纳米粒子的dls表征；
[0047]
图6为实施例7验证三种的pei
‑
m/ova用于小鼠皮下注射24小时后腹股沟淋巴结的纳米粒子的回流情况；
[0048]
图7为实施例8描述的不同剂型的ova纳米疫苗用于b16
‑
ova肿瘤模型的抑瘤治疗情况；
[0049]
图8为实施例9描述的小鼠治疗后第5天elispot表征的小鼠脾脏抗原特异性t细胞响应情况；
[0050]
图9为实施例10制备的mc38肿瘤蛋白抗原个性化疫苗的mc38肿瘤切除手术后的术后治疗情况；
[0051]
图10为实施例11验证得到的四种pei
‑
m材料对b16f10细胞的48h时的细胞毒性；
[0052]
图11为实施例12验证得到的四种pei
‑
m材料对b16f10细胞转染效率测评。
具体实施方式
[0053]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用进行详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0054]
实施例1
[0055]
五元环及六元环修饰的超支化pei材料(pei
‑
m)的制备，将40倍当量的五元及六元含氮杂环小分子(如表2所示)，60倍当量的edc
·
hcl，80倍当量的nhs称入带有搅拌子的反应瓶中，加入无水dmso在35℃下搅拌反应30分钟进行小分子上羧基的活化过程，随后加入预先用dmso溶好的1当量的超支化pei
‑
10kda继续在35℃下搅拌反应72小时。随后将反应体系用10倍体积的乙醚沉降，弃去上层液体后抽干残留乙醚。随后用无菌水溶解反应产物，用截留分子量为7000da的透析袋在milliq水中透析，ph值梯度从3
‑
7递增，每6
‑
8小时换一次水，ph值调节跨度为1，最后用ph值为7的纯milliq水透析3次，冷冻干燥，收集产物为蓬松固体。
[0056]
图1上为本实施例得到的pei
‑
4bimi的1hnmr表征图谱。1hnmr(300mhz,d2o dcl):δ＝8.46(s,36h；ch),7.33(s,108h；ch,ch,ch),3.25ppm (m,930h；
‑
(ch2ch2nh)n
‑
)。
[0057]
表2
[0058]
[0059][0060]
实施例2
[0061]
七元环修饰的超支化pei材料(pei
‑
m)的制备，48倍当量的羰基二咪唑(cdi)称入
带有搅拌子的反应瓶中，加入无水dmso溶解，将40倍当量的七元含氮杂环小分子(如表2所示)，具体指n
‑
(2
‑
羟乙基)六亚甲二胺，用注射器注入反应瓶中，随后在35℃下搅拌反应12小时进行羟基和cdi的反应，随后加入预先用dmso溶好的1当量的超支化pei
‑
10kda，继续在35℃下搅拌反应24小时。随后将反应体系用10倍体积的乙醚沉降，弃去上层液体后抽干残留乙醚。随后用无菌水溶解反应产物，用截留分子量为7000da的透析袋在milliq水中透析，ph值梯度从3
‑
7递增，每6
‑
8小时换一次水，ph值调节跨度为1，最后用ph值为7的纯milliq水透析3次，冷冻干燥，收集产物为透明状固体。
[0062]
图1下为本实施例得到的pei
‑
hpip的1hnmr表征图谱。1hnmr(300mhz,d2o dcl):δ＝4.10(s,48h；ch2),3.39
‑
3.05(m,135h；ch2,ch2,ch2),2.59(m,930h；
‑
(ch2ch2nh)n
‑
),1.50ppm(m,187h；ch2,ch2,ch2,ch2)。
[0063]
实施例3
[0064]
利用实施例1得到的28种pei
‑
m，诱导dc2.4细胞释放ifn
‑
β情况。将pei
‑
m用无菌水充分溶解，加入到每孔铺有1.5万个dc2.4细胞的96孔板中，pei
‑
m的处理浓度为20μg/ml或50μg/ml，孔板中每孔的含pei
‑
m培养基体积为200μl。24小时后，收集孔板中培养基并以3000rpm转速离心5分钟，收集培养基上清，用elisa试剂盒检测其中ifn
‑
β的浓度。elisa检测的流程为(所有过程都在室温下进行)：高黏附96孔板中孵育捕获抗体过夜，pbst(含0.05％的pbs溶液)洗涤三次，用含1％bsa的pbs封闭1小时，pbst洗涤3次，加入待检测的样本(3
‑
4个重复样)和标曲样本孵育2小时，pbst洗涤3次，加入检测抗体孵育2小时，pbst洗涤3次，加入链霉亲和素
‑
hrp孵育20分钟，pbst洗涤3次，加入tmb显色液避光显色20分钟，加入2nh2so4终止，酶标仪在450nm处检测吸光度并扣除540nm处的背景值。
[0065]
图2是本实施例验证得到的经过50μg/ml pei
‑
m处理dc2.4细胞24小时后细胞上清中ifn
‑
β浓度含量，由图2可以看出超过70％的含氮小分子经过超支化pei的修饰后展现出了刺激免疫细胞的能力。
[0066]
实施例4
[0067]
取实施例1中制备得到的6种pei
‑
m材料(pei
‑
5thi，pei
‑
4ind，pei
‑
5ind，pei
‑
4imi，pei
‑
4bimi，pei
‑
5bimi)对dc2.4细胞毒性的测评。于96孔板中提前一晚孵育dc2.4细胞，密度为5000细胞/孔，第二日加入pei
‑
m，浓度设置为10μm，20μm，30μm，40μm，50μm，60μm六个浓度梯度，孵育24h后每孔加入20μl cck8溶液，孵育1
‑
2h后用酶标仪检测在560nm处的吸光度值(od值)。细胞存活率＝[实验孔od值/pbs孔od值]
×
100％。
[0068]
图3为本实施例验证得到的六种五元含氮杂环小分子修饰的pei
‑
m对dc2.4细胞的24h时的细胞毒性，由图3可以看出经过含氮杂环小分子修饰后的pei
‑
m材料明显降低了pei材料本身的细胞毒性。
[0069]
实施例5
[0070]
实施例1中制备得到的3种pei
‑
m材料(pei
‑
5thi，pei
‑
4imi，pei
‑
4bimi)，诱导细胞内sting通路相关蛋白的磷酸化表达验证。将bmdcs或thp
‑
1细胞按每孔50万细胞铺在六孔板中，用含有50μg/ml浓度的pei
‑
m培养基孵育4小时。收集细胞并用pbs洗涤离心(1200rpm，5分钟)一次，按照抗体染色说明书进行多聚甲醛固定，90％甲醇通透的操作，且每一步都用足够的pbs洗掉多余的多聚甲醛或甲醇，随后加入稀释好的一抗(pe标记的
p
tbk
‑
1，
p
sting，af647标记的
p
irf3)进行染色1小时，洗掉多余抗体，针对
p
sting兔抗鼠一抗需再加入bv421
标记的驴抗兔二抗进行染色20分钟。最后洗涤一次并固定，用流式细胞术进行表征。
[0071]
图4为本实施例验证的三种pei
‑
m材料处理的bmdcs细胞和thp
‑
1细胞内sting通路相关蛋白的磷酸化表达情况，由图4可以看出在鼠源和人源的免疫细胞上都能观察到pei
‑
m材料对sting通路的明显激活。
[0072]
实施例6
[0073]
实施例1中制备得到的3种pei
‑
m材料(pei
‑
5thi，pei
‑
4imi，pei
‑
4bimi)，担载ova抗原蛋白的纳米疫苗制备。将pei
‑
m与ova用无菌水溶解，浓度为1mg/ml，在涡旋状态下将ova溶液缓缓滴加到pei
‑
m溶液中，继续涡旋10分钟即可得到。
[0074]
图5为实施例6制备的pei
‑
m担载ova抗原蛋白(pei
‑
m/ova)得到的纳米粒子的dls表征。
[0075]
实施例7
[0076]
实施例1中制备得到的3种pei
‑
m材料(pei
‑
5thi，pei
‑
4imi，pei
‑
4bimi)，担载ova皮下回流至淋巴结效率的验证。将ova用cy5
‑
nhs按照10％的质量分数进行荧光标记，无菌水中溶解后搅拌16h后透析过滤即可得到ova
‑
cy5。按照实施例8中所描述的，组装得到pei
‑
m/ova
‑
cy5纳米粒子。随后按照每只鼠100μg ova
‑
cy5的量，在c57bl/6小鼠的尾基两侧皮下注射pei
‑
m/ova
‑
cy5纳米粒子，24h后取出腹股沟淋巴结，拍摄离体组织荧光成像。
[0077]
图6为实施例7验证三种的pei
‑
m/ova用于小鼠皮下注射24小时后腹股沟淋巴结的纳米粒子的回流情况，由图6可以看出pei
‑
4bimi材料担载ova明显提高了ova蛋白在淋巴结的回流情况，且回流效率明显高于另外两组pei
‑
5thi/ova和pei
‑
4imi/ova。
[0078]
实施例8
[0079]
实施例6制备得到的纳米疫苗(pei
‑
4bimi/ova)对小鼠肿瘤模型治疗实施，c57bl/6小鼠分为5组，每组5只，在背部右侧皮下接种3
×
105个b16
‑
ova细胞建立肿瘤模型。在接种后第4，11，18天进行尾基皮下接种疫苗：pbs组，ova组，铝剂担载ova(铝剂/ova)组，pei担载cgamp和ova(pei/cgamp/ova)组，pei
‑
4bimi担载ova(4bimi/ova)组。单次注射剂量为50μg ova/只，5μg cgamp/只，50μg pei或pei
‑
4bimi/只。
[0080]
图7为本实施例描述的不同剂型的ova纳米疫苗用于b16
‑
ova肿瘤模型的抑瘤治疗情况，可以看出pei
‑
4bimi/ova治疗组相对于其它治疗组实现了更好的肿瘤抑制率，效果优于商品化铝剂疫苗治疗组和添加cgamp佐剂的疫苗治疗组。
[0081]
实施例9
[0082]
elisopt测定经不同剂型的ova疫苗治疗后的小鼠脾细胞对抗原的特异性响应情况。elispot流程为：将捕获抗体加入到预先经70％乙醇处理并用pbs洗涤后的elispot孔板中，置于4℃孵育过夜。而后每孔中加入封闭液200μl置于室温封闭2小时。弃去封闭液并洗涤，每孔加入3μg ova多肽(254
‑
267)。提取治疗后的小鼠的脾脏细胞，并裂解红细胞，计数后分别接种到孔板中，密度为每孔2
×
105个细胞。将孔板置于37℃含有5％co2的培养箱中培养72小时。至此所有过程均为无菌操作，后续可在非无菌下操作。弃去细胞及培养基，使用去离子水洗涤2次。加入检测抗体，室温孵育2h。使用pbst洗涤孔板2次，每孔加入100μl的链霉亲和素
‑
hrp，室温孵育1h后，使用pbs洗涤孔板3次。每孔中加入100μl aec显色液，显色5分钟到1小时，随时观察出点情况，最后使用去离子水洗涤终止反应，晾干后拍摄记录图片。
[0083]
图8为实施例9描述的小鼠治疗后第5天elispot表征的小鼠脾脏抗原特异性t细胞
响应情况，可以看出小鼠pei
‑
4bimi/ova治疗后诱导的抗原特异性t细胞响应明显优于其它治疗组。
[0084]
实施例10
[0085]
术后肿瘤组织提取肿瘤蛋白抗原，肿瘤组织取自荷瘤小鼠，经由外科手术切除得到。将2g切除的肿瘤组织切成小块，加入5ml浓度为60μm的次氯酸钠溶液，轻轻研磨后，置于37度处理1h。孵育结束后，加入10ml的pbs，离心(8000rpm，10min)，弃去上清，再加入10ml的pbs，重复上述离心步骤。加入5ml的pbs，超声破碎(40％功率，20min)，随后反复冻融6个循环。将混合物离心(8000rpm，10min)，取上清液即mc38肿瘤蛋白抗原。将上清液进行bca蛋白定量，并置于
‑
80℃保存。将mc38蛋白抗原用无菌水稀释至1mg/ml，按照实施例4的操作过程，在涡旋状态下将等体积的mc38蛋白抗原缓慢滴加至1mg/ml的pei
‑
4bimi溶液中。继续涡旋10分钟，即可用于mc38荷瘤小鼠的术后治疗。
[0086]
图9为实施例10制备的mc38肿瘤蛋白抗原个性化疫苗的mc38肿瘤切除手术后的术后治疗情况，可以看出mc38抗原蛋白经pei
‑
4bimi担载后用于肿瘤术后治疗时具有更明显的肿瘤抑制效果，且明显延长了小鼠的生存期。
[0087]
实施例11
[0088]
实施例1中制备得到的4种pei
‑
m材料(pei
‑
4pyr，pei
‑
4imi，pei
‑
4bimi，pei
‑
5bimi)对b16f10的细胞毒性测评。于96孔板中提前一晚孵育b16f10细胞，密度为8000细胞/孔，第二日加入pei
‑
m，最高浓度设置为80μg/ml，随后两倍梯度稀释，共设置五个浓度梯度，孵育48h后每孔加入20μl cck8溶液，孵育1
‑
2h后用酶标仪检测在560nm处的吸光度值(od值)。细胞存活率＝[实验孔od值/pbs孔od值]
×
100％。
[0089]
图10为实施例11验证得到的四种pei
‑
m材料对b16f10细胞的48h时的细胞毒性，可以看出pei
‑
m材料显著改善了pei材料的细胞毒性，半抑制浓度(ic50)值至少提高了3.3倍，更具有生物安全性。
[0090]
实施例12
[0091]
实施例1中制备得到的4种pei
‑
m材料(pei
‑
4pyr，pei
‑
4imi，pei
‑
4bimi，pei
‑
5bimi)复合荧光素酶(luciferase，luc)质粒后，对b16f10转染效率的测评。用无菌水分别溶解pei
‑
m与荧光素酶质粒，浓度均为0.2mg/ml，按照pei
‑
m与荧光素酶质粒质量比为5/1的比例在水溶液中进行涡旋担载。于96孔板中提前24h孵育b16f10细胞，密度为10000细胞/孔，随后加入pei
‑
m/luc，质粒浓度设置为1μg/ml，2μg/ml，5μg/ml，孵育48h后用光度计检测相对光度值。
[0092]
图11为实施例12验证得到的四种pei
‑
m材料对b16f10细胞转染效率测评，可以看出pei
‑
m材料担载luc质粒相对于阳性对照pei
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10k/luc组可实现更好的转染效果，且转染效果随浓度升高而升高，而pei
‑
10k/luc在提高浓度下造成明显细胞毒性，明显降低了转染水平。
[0093]
实施例13
[0094]
实施例1中制备得到的pei
‑
4bimi材料担载mrna疫苗的制备。使用无菌水分别溶解pei
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4bimi材料及mrna，浓度为0.2mg/ml。在涡旋状态下，按照pei
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4bimi与mrna质量比为5/1的比例将mrna缓慢滴入pei
‑
4bimi中，继续涡旋5分钟，制备得到pei
‑
4bimi/mrna疫苗。
[0095]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对
于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。