一种乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗阿尔兹海默病的药物中用途和制备方法与流程

1.本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗阿尔兹海默病的药物中用途。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(ad)，又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。ad的特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。随着我国人口老龄化的加剧，ad患病率逐年上升，据统计，我国老年人群ad患病人口已经超过600万，预计到2050年患病人口将超过2000万，是世界上ad患病人口最多、增长速度最快的地区，给患者、家庭、社会和医疗带来沉重负担。
3.目前市面上所使用的药物，例如他克林、多奈哌齐、卡巴拉汀或加兰他敏，是目前用于改善轻中度阿尔茨海默病患者认知功能的主要药物，都是通过抑制乙酰胆碱酯酶(ache)来增加胆碱能神经递质，这些ache抑制剂的临床试验数据表明它们具有足够的治疗ad的效果和可靠性以及可接受的副作用。同时还有氟西汀、帕罗西汀、西酞普兰、舍曲林等精神药物，可以控制精神症状，但要避免长期使用。
4.单胺氧化酶(mao
‑
a和mao
‑
b)是哺乳动物黄素酶，催化去甲肾上腺素、多巴胺、酪胺、5
‑
羟色胺等多种神经递质的氧化脱氨反应。氧化脱氨在生化反应过程中会产生几种有害的副产物，如氨、过氧化物和醛。mao改变脑内生化神经递质的浓度与阿尔茨海默病、帕金森氏病等多种神经系统疾病有直接关系。mao酶的活化导致ad患者的认知功能障碍，激活的mao还通过胆碱能神经元的损伤和胆碱能系统的紊乱参与神经原纤维缠结的聚集和认知破坏。mao抑制具有普遍的抗阿尔茨海默病作用，这是由于mao酶促进氧化应激减轻的结果。
5.因此现有的ad治疗药物具有很大的选择局限性，某种药物长期服用产生累积副作用或抗性后，患者进行药物治疗方案改善的选择余地受限。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供乙酰胆碱酯酶抑制剂在制备治疗阿尔兹海默病的药物中用途和制备方法，提供一种3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂、单胺氧化酶抑制剂及预防和/或治疗阿尔兹海默病的药物。
7.技术方案
8.一种如下所示的化合物或其可药用盐：
[0009][0010]
进一步，一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的上述化合物、或其可药用的盐及药学上可接受的载体或赋性剂。
[0011]
进一步，如上所述的化合物或其可药用的盐或上述所述的药物组合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的用途。
[0012]
进一步，如上所述的化合物或其可药用的盐或上述所述的药物组合物在制备ache抑制剂中的用途。
[0013]
进一步，如上所述的化合物或其可药用的盐或上述所述的药物组合物在制备单胺氧化酶b抑制剂中的用途。
[0014]
进一步，所述化合物或其可药用的盐或所述药物组合物用在制备预防和/或治疗哺乳动物阿尔兹海默病的药物中的用途。
[0015]
进一步，所述的药物组合物在制备预防和/或治疗哺乳动物阿尔兹海默病的药物中的剂量为0.01～1000mg/kg，优选为1～100mg/kg。
[0016]
进一步，所述的药物组合物在制备预防和/或治疗哺乳动物阿尔兹海默病的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂多种形式。
[0017]
进一步，所述的药物组合物在制备预防和/或治疗哺乳动物阿尔兹海默病的药物中包含药学上可接受的辅料，辅料为制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，包括但不限于稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服制剂，包括但不限于颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂。
[0018]
一种3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素的制备方法，其特征在于，包括：
[0019][0020]
反应试剂与条件：(a)溶剂为甲醇，反应温度为50℃；(b)conchcl，溶剂为甲醇；(c)碳酸钾，溶剂为n,n
‑
二甲基甲酰胺，反应温度为102℃。
[0021]
有益效果
[0022]
(1)ellman等人的方法稍加改变后监测3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基
香豆素的乙酰胆碱酯酶抑制活性。发现该化合物具有较好的ache抑制活性，其抑制(ic50＝0.068
±
0.04μmol/l)活性优于阳性药多奈哌齐(ic50＝0.079
±
0.008μmol/l)。
[0023]
(2)holt等人的方法稍加修改测定苄氨基香豆素类化合物抗mao
‑
b的活性。发现该化合物表现出良好的mao
‑
b抑制活性(ic50＝6.312
±
0.03μmol/l)，但是与阳性药雷沙吉兰对比其活性较弱(ic50＝1.697
±
0.01μmol/l)。
[0024]
(3)为了更好地验证3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素的抗氧化活性，使用了清除dpph自由基能力和总抗氧化能力两种方法进行实验。发现该化合物有一定的抗氧化能力(dpph ic50＝0.048
±
0.05mmol/l,frap值＝2.58
±
0.01mmol/g)，抗氧化活性在ad疾病治疗中也非常重要，这也为化合物成药提供了必要的条件。
[0025]
(4)3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素具有缓解阿尔兹海默病的活性，通过抑制乙酰胆碱酯酶、抑制单胺氧化酶b、抗氧化活性等多种途径发挥作用，可以作为多靶点治疗阿尔兹海默病的药物。
附图说明
[0026]
图1为本发明ache抑制的动力学实验lineweaver
‑
burk图；
[0027]
图2为本发明frap总抗氧化能力标准曲线。
具体实施方式
[0028]
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
[0029]
本发明是提出一种一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，用于制备治疗和或预防阿尔兹海默病的药物。
[0030]
实施例1 3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素(以下实施例中简称化合物ⅰ)的制备
[0031][0032]
反应试剂与条件：(a)甲醇，50℃；(b)conchcl，甲醇；(c)碳酸钾，n,n
‑
二甲基甲酰胺，102℃。
[0033]
中间体3
‑
氨基香豆素的合成方法：以异腈基乙酸乙酯碘化亚铜和2
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯甲酸为起始原料合成中间体3
‑
甲酰胺基
‑8‑
甲氧基香豆素。在磁力搅拌的条件下首先向甲醇溶液中加入2
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯甲酸，然后加入异腈基乙酸乙酯和吡啶，最后加入碘化亚铜，将反应混合物在50℃油浴锅中搅拌加热6小时，tlc监测反应进程。反应结束后，过滤得到粗品固体化合物，用甲醇溶液冲洗三次，每次15毫升，得到浅黄色固体3
‑
甲酰胺基香
豆素产率85％。将8
‑
甲氧基
‑3‑
甲酰胺基香豆素用浓盐酸在甲醇溶液中回流处理一小时，浓盐酸使用时应注意安全，将浓盐酸缓慢滴加到甲醇中避免引起飞溅。反应结束后将混合物在真空条件下浓缩，浓缩后将产物移至250毫升蒸馏水中，并用饱和的强氧化纳水调节ph至中性条件，ph值7～8。然后用二氯甲烷进行萃取，并用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液，过滤后浓缩除去溶剂，二氯甲烷溶液可回收利用。除去溶剂后得到黄色固体产率80％。所的中间体即为8
‑
甲氧基
‑3‑
氨基香豆素。该反应的反应机理为：首先碘化亚铜和异氰基乙酸乙酯形成络合物，被吡啶去质子化而形成络合物中间体，然后攻击水杨醛生成加合物中间体。最后经分子内重排和环合生成3
‑
甲酰胺基
‑8‑
甲氧基香豆素中间体。3
‑
甲酰胺基
‑8‑
甲氧基香豆素用浓盐酸处理后除去醛基得到3
‑
氨基
‑8‑
甲氧基香豆素。
[0034]
目标化合物的合成方法：将所得到的中间体3
‑
氨基
‑8‑
甲氧基香豆素与3，5
‑
二甲氧基苄溴进行烷基化反应。在n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液中边搅拌边加入中间体化合物，然后缓慢加入3，5
‑
二甲氧基苄溴，最后加入碳酸钾固体，加热至100℃回流6小时。反应后的混合物加入200毫升蒸馏水中，搅拌冲散n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液。将混合物用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯溶液浓缩除去溶剂，得到粗品产物，将粗品产物用无水乙醇重结晶得到纯品化合物。
[0035]
实施例2药理活性实验
[0036]3‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素体外乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定：
[0037]
1.反应溶液的配制
[0038]
(1)配制pbs缓冲液：精确称取71.63g磷酸氢二钠，加适量蒸馏水溶解，再用容量瓶准确定容到1l，配制成0.2mol/l的磷酸氢二纳溶液；精确称取31.20g磷酸二氢钠，加适量蒸馏水溶解，再用容量瓶准确定容到1l，配制成0.2mol/l的磷酸二氢钠溶液。精确量取473.50ml磷酸氢二钠溶液和26.50ml磷酸二氢钠溶液，混合，加蒸馏水用容量瓶准确定容到1l，配制成0.1mol/l、ph＝8.0的pbs缓冲液；精确量取305ml磷酸氢二钠溶液和195ml磷酸二氢钠溶液，混合，加蒸馏水用容量瓶准确定容到1l，配制成0.1mol/l、ph＝7.0的pbs缓冲液，备用。
[0039]
(2)配制dtnb溶液(显色剂)：精确称取65.4mg 5,5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)，加入适量pbs缓冲液(ph＝8.0)溶解，并定容到50ml，配制成3.3mmol/l的溶液，备用。
[0040]
(3)配制底物：精确称取72.295mg硫代乙酰胆碱，加入适量蒸馏水溶解，并定容到50ml，配制成5mmol/l的溶液，备用。
[0041]
(4)配制乙酰胆碱酯酶的酶溶液：精确称取10mg冻干酶粉，加入pbs缓冲液(ph＝8.0)溶解，配制成0.2u/ml的酶溶液，备用。
[0042]
(5)配制多奈哌齐溶液(抑制剂)：精确称取10mg多奈哌齐标准品，用容量瓶准确定容到10ml，配制成1000μg/ml的多奈哌齐标准母液。将母液分别稀释成10、100、500μg/ml不同梯度的标准品溶液，备用。
[0043]
2.体外乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定
[0044]
首先以阳性药多奈哌齐进行预实验，探索乙酰胆碱酯酶抑制活性的最佳实验条件。在ph8.0的条件下，进行0.1m磷酸盐缓冲溶液中的ache体外活性测定。ache的底物为碘化乙酰硫代胆碱(atchi)。5，5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)(dtnb)作为显色试剂。将3.3mm的
dtnb和0.2u/ml的ache分别溶于0.1m的pbs中，使ph＝8.0。将化合物配置成五个不同浓度梯度的化合物溶液。在96孔板的每个孔中分别加入120μl的磷酸盐缓冲溶液，20μl dtnb溶液，20μl ache溶液和20μl五个不同浓度的化合物溶液。使用摇床进行充分摇匀，孵育5分钟，加入atchi后在37℃的条件下再孵育20分钟。使用全波长酶标分析仪测量化合物在412nm波长下的吸光度，根据公式使用spss软件计算化合物对ache的抑制率和ic50值。化合物浓度配置成五个浓度梯度，平行重复实验3次。阳性药多奈哌齐作为阳性对照。
[0045]
乙酰胆碱酯酶抑制率(％)＝[a0
‑
(a1
‑
a2)]/a0
×
100％
[0046]
式中，a0为对照组吸光值，a1为化合物组吸光值，a2为化合物空白组吸光值。
[0047][0048]
ache抑制的动力学实验：酶促反应动力学通过反应物的消耗速率或产物的生成速率来表示化学反应速率，由于产物的生成是一个从无到有的过程，所以可比较准确的得到产物的生成率测。在温度，ph和酶恒定的条件下，反应速率与底物浓度之间的关系可用米氏方程双倒数形式表示：1/v＝km/(vmax s) 1/vmax[75]。选取ache抑制活性最优化合物m11进行实验，探索化合物抑制ache的作用机理。通过ellman方法测试不同浓度的底物反应速率，绘制反应速度倒数与底物浓度倒数的双倒数图。然后将化合物m11加入到检测溶液中，再37℃条件下，与酶预孵5分钟，加入底物。在多更能酶标分析仪412nm处每隔5s测量吸光度，通过光谱法检测化合物的酶动力学表征。以对照组不添加化合物m11的组分进行平行实验。根据反应速率和底物浓度绘制lineweaver
‑
burk图(附图1)。
[0049]
3、3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素单胺氧化酶b抑制活性测定
[0050]
在ph 7.6的恒定条件下96孔板中每孔添加0.2m的磷酸缓冲溶液使总体积为240μl。将1mmol/香草酸，0.5mmol/4
‑
氨基安替比林和4u/ml辣根过氧化物酶溶于0.2mmol/l 0.2m ph＝7.6的pbs溶液中，溶液需现用现配。在96孔板中分别添加40μl酶溶液和五个浓度梯度的化合物溶液在37℃恒定条件下孵育20分钟。然后加入120μl 4
‑
(三氟甲基)苄氨溶液和40μl显色剂溶液，在37℃恒定条件下孵育90分钟。使用酶标分析仪检测490nm处的吸光度，然后根据公式计算化合物mao
‑
b的抑制率，使用spss软件计算每个化合物的ic50值。平行实验三次，雷沙吉兰作为阳性对照药物。
[0051]
单胺氧化酶b抑制率(％)＝[(ac
‑
ab)
‑
(as
‑
asb)]/(ac
‑
ab)
×
100％，
[0052]
式中，ac表示对照组的吸光值；ab表示空白组的吸光值；as表示化合物组的吸光值；asb表示化合物空白组的吸光值。
[0053][0054]
4.
[0055]
(1)3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素清除dpph自由基能力
[0056]
抗氧化活性是用dpph(2，2
‑
二苯基
‑1‑
苦基肼)自由基光度测定法在其变色指导下进行的，当加入抗氧化剂时，dpph的孤对电子被配对，紫色退去且最大吸收波长处的吸光值变小。对dpph自由基的清除可以用来定量测定化合物抗氧化能力。参考文献方法并稍加修改测定3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素清除dpph自由基能力。将100μl化合物溶液添加到100μldpph溶液中。在37℃下避光孵育30分钟后，使用酶标分析仪测定化合物在518nm出的吸光度，平行三次，根据公式计算化合物的dpph自由基清除率，计算化合物的ic
50
。
[0057]
dpph自由基的清除率(％)＝[a0
‑
(aa1
‑
a2)]/a0
×
100％
[0058]
式中，a0表示对照组的吸光值，a1表示化合物组的吸光值，a2表示化合物空白组的吸光值。
[0059]
每孔反应物添加计量和添加顺序
[0060][0061]
(2)frap总抗氧化能力
[0062]
通过对benzie的frap检测方法稍加修改进行试验，检测3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素总抗氧化能力。该方法是基于在酸性条件下，无色铁络合物(fe
3
‑
三吡啶三嗪)在给电子抗氧化剂的作用下还原成蓝色的亚铁络合物(fe
2
‑
三吡啶三嗪)。通过测量593nm处吸光度的变化最为指标来监测还原能力。首先，配置frap工作液，现用现配，用300mmol/l乙酸盐缓冲液，10mmol/l tptz，20mmol/l fecl3配置。量取100μl化合物溶液添加到3ml frap工作液中，在37℃恒定条件下孵育15分钟，平行实验三次。使用酶标分析仪在593nm处测量化合物的吸光度。以硫酸亚铁绘制标准曲线，得到标准方程为：y＝0.4028x 0.054，r2＝0.9966，如附图2所示。化合物的抗氧化作用使用相同吸光度下的酸酸亚铁毫摩尔来表示。
[0063]
实验结果与分析
[0064]
ellman等人的方法稍加改变后监测3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素的乙酰胆碱酯酶抑制活性。发现该化合物具有较好的ache抑制活性，其抑制(ic50＝0.068
±
0.04μmol/l)活性优于阳性药多奈哌齐(ic50＝0.079
±
0.008μmol/l)。
[0065]
为了更好地验证3
‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素的抗氧化活性，使用了清除dpph自由基能力和总抗氧化能力两种方法进行实验。发现该化合物有一定的抗氧化能力(dpph ic50＝0.048
±
0.05mmol/l,frap值＝2.58
±
0.01mmol/g)。
[0066]3‑
((3,5
‑
二甲氧基苄基)氨基)
‑8‑
甲氧基香豆素ad相关活性结果
[0067][0068]
由以上实施例可知，化合物i具有缓解阿尔兹海默病的活性，通过抑制乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶b、抗氧化活性等多种途径发挥作用，可以作为多靶点治疗阿尔兹海默病的药物。