一种检测HPV病毒的引物和探针组合及其分型检测的试剂、应用的制作方法

一种检测hpv病毒的引物和探针组合及其分型检测的试剂、应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测hpv病毒的引物和探针组合及其检测试剂、应用。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的双链环状dna病毒，基因组全长约8000bp，分为3个功能区，即早期转录区(e区)、晚期转录区(l区)、和非转录区(lcr)。人是hpv病毒的唯一宿主，现已分离鉴定的hpv有200多种型别，根据导致疾病的不同分为高危型和低危型。高危型人乳头瘤病毒(high risk
‑
human papillomavirus,hr
‑
hpv)持续感染与宫颈癌、阴茎癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌和某些头颈部恶性肿瘤相关，尤其与子宫颈癌的发生关系密切。宫颈癌为女性中最常见的癌症之一，研究证实99.7％的宫颈癌中都可以检测出hpv dna，表明hpv感染与宫颈癌的相关具有普遍意义。
3.宫颈癌早期症状并不明显，发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期，当宫颈癌的症状出现三个月后就诊者有2/3为癌症晚期。经临床追踪观察显示，从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。从这个角度看，宫颈癌并不可怕，它是一种可预防、可治愈的疾病。防治的关键在于：定期进行妇科检查，及时发现和治疗宫颈癌前病变，终止其向宫颈癌的发展。如能落实防治措施，宫颈癌的治愈率很高。宫颈癌也是目前唯一确切知道病因的癌症，这一病因就是hpv感染。因此，检测hpv病毒，特别是高危型hpv病毒可预示宫颈癌的发生。研究表明，中国妇女宫颈癌中常见的除hpv16、18型外还有31、33、45、52、58型。hpv的阴性预测值达100％，即无hpv感染时可基本排除宫颈癌的发生。
4.目前用于宫颈癌早期筛查的实验室诊断方法主要有两大类：细胞形态学检测(醋酸白实验、巴氏涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学等)和分子生物学检测(测序、原位杂交、基因芯片、杂交捕获、pcr等)。细胞形态学检测的是hpv感染后对机体造成的异常变化，不能直接检测到hpv，而hpv感染后对机体造成特定的异常变化需要一定的时间，且细胞形态学检测方法灵敏度和特异性均较低，对临床的早期诊断意义不大。测序、原位杂交技术复杂，对操作者要求高，费时，昂贵，在临床大规模应用中受到限制。基因芯片由于其价格昂贵，技术要求高，其在临床上大规模应用还需一段要走。杂交捕获法由于无内标，检测繁琐，检测时间长，灵敏度低，假阳性率高等特点不能满足临床高通量筛查的需要。实时荧光pcr灵敏度高、特异性强，但是目前采用的普通荧光pcr检测一般一次只能检测一种病毒亚型，通过重复多次实现对所有亚型的检测，而多通道荧光检测单管最多只能检测3
‑
5个亚型，无法满足一次进行多种亚型的检测。另外，一般产品都是一个型别对应一对型特异引物和一条型特异探针，这样体系中荧光探针太多会显著增加背景荧光信号，同时增加检测成本。由此可见，目前急需一种灵敏、特异、快速、简便的hpv不同型别的高通量检测的方法，以便能满足临床快速准确诊断的需要。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供一种检测hpv病毒的引物和探针组合及其分型检测的试剂、应用。该引物和探针组合结合实时荧光pcr和熔解曲线分析技术，可快速实现hpv16、18、31、33、45、52、58型别的分型检测，在保证检测灵敏度、特异性和准确性的同时显著提高了单管检测通量，降低了检测成本。
6.本发明提供一种引物和探针组合，包括序列如seq id no.1
‑
11所示的引物和序列如seq id no.12
‑
16所示的探针。
7.一些实施方案中，本发明所述引物和探针组合还包括检测内标基因的seq id no.17～18所示的引物和seq id no.19所示的探针：
8.其中，(1)用于检测hpv16型的引物、探针，其碱基序列分别为seq id no.1、2、12；(2)用于检测hpv18型的引物、探针，其碱基序列分别为seq id no.1、2、13；(3)用于检测hpv31型的引物、探针，其碱基序列分别为seq id no.2、3、16；(4)用于检测hpv33型的引物、探针，其碱基序列分别为seq id no.4、5、16；(5)用于检测hpv45型的引物、探针，其碱基序列分别为seq id no.6、7、15；(6)用于检测hpv52型的引物、探针，其碱基序列分别为seq id no.8、9、14；(7)用于检测hpv58型的引物、探针，其碱基序列分别为seq id no.10、11、16。
9.具体地，各引物和探针序列如下：
10.seq id no.1：5
′‑
caactatttgttactgtggttgataccac
‑3′
；
11.seq id no.2：5
′‑
gaaatataaactgcaaatcaaattcctc
‑
3；
12.seq id no.3：5
′‑
attggatgcaacgtgctcaggga
‑3′
；
13.seq id no.4：5
′‑
atggttacttccgaatctcagtta
‑3′
；
14.seq id no.5：5
′‑
gtgcataaagtcatattagtactgcga
‑3′
；
15.seq id no.6：5
′‑
ccacctatataggtattcatggcacac
‑3′
；
16.seq id no.7：5
′‑
gccacagaaggtggtggaaga
‑3′
；
17.seq id no.8：5
′‑
actacgtcgcaggcgtaaacg
‑3′
；
18.seq id no.9：5
′‑
agacaggtacaggaggcaggta
‑3′
；
19.seq id no.10：5
′‑
gccttattggctacagcgtgcac
‑3′
；
20.seq id no.11：5
′‑
agtgctacgagtggtatcaaccacg
‑3′
；
21.seq id no.12：5
′‑
tgctgccatatctacttcagaaactacata
‑3′
；
22.seq id no.13：5
′‑
tgcttctacacagtctcctgtacctggg
‑3′
；
23.seq id no.14：5
′‑
tcagtgtgtcgacctagtgaagccact
‑3′
；
24.seq id no.15：5
′‑
ctttgtggtggactagtaacagtactgt
‑3′
25.seq id no.16：5
′‑
caacaatggcatttgctggggcaatcagt
‑3′
26.seq id no.17：5
′‑
gaatgatgggtggtgcgacaac
‑3′
；
27.seq id no.18：5
′‑
aatgtaagcaatagatggctctgcc
‑3′
；
28.seq id no.19：5
′‑
caggagccagggctgggcataaaag
‑3′
。
29.一些实施方案中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，具体可为fam、vic、joe、hex、rox或cy5；3’端标记有荧光淬灭基团，具体可为bhq1或bhq2；包括但不仅限于此。在一些具体实施例中，seq id no.12～15所示探针的5
′
端标记fam，3
′
端标记bhq1，seq id no.16所示探针的5
′
端标记vic，3
′
端标记bhq2，seq id no.19所示探针的5
′
端标记cy5，3
′
端标记bhq2。
30.本发明还提供了所述引物和探针组合在制备检测hpv病毒和/或hpv病毒分型的检测试剂中的应用。
31.所述hpv病毒包括hpv16型、hpv18型、hpv31型、hpv33型、hpv45型、hpv52型、hpv58型中的一种或多种。
32.本发明还提供一种分型检测hpv病毒的试剂，包括本发明所述的引物和探针组合。
33.其中，所述引物和探针组合中，seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.17为限制性引物，所述限制性引物的浓度为0.01～0.1um；seq id no.2、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.18为过量引物，所述过量引物的浓度为0.1～1um；所述探针的浓度为0.1～0.2um。
34.一些实施方案中，本发明试剂包括pcr反应液a和pcr反应液b。
35.所述反应液a包括tricine(ph8.3)、koac、dmso、nan3、ung酶、rtth dna聚合酶和dntp；所述反应液b包括mn(oac)2和nan3。一些具体实施例中，所述反应液a包括：tricine(ph8.3)50mm、koac 120mm、dmso 4.3％、nan30.01％、0.2μl浓度为1u/μl的ung酶、0.5μl浓度为5u/μl的rtth酶、datp、dgtp、dctp、dutp各0.4mm、各引物、探针(各引物和探针的终浓度为：限制性引物为0.01～0.1um，过量引物为0.1～1um，特异性探针各0.1～0.2um)，余量为水；所述反应液b包括mn(oac)20.5mm、nan3 0.01％，余量为水。
36.一些实施方案中，本发明试剂还包括阴性对照品、临界阳性对照品和强阳性对照品种；所述阳性对照品为含有hpv16、18、31、33、45、52、58型特异性靶标序列的质粒溶液；所述强阳性对照品为含有hpv16、45、58型特异性靶标序列的质粒溶液；所述阴性对照品为无hpv病毒的生理盐水。
37.本发明还提供一种检测人乳头瘤病毒的方法，包括如下步骤：
38.以本发明所述的试剂盒，对待测核酸样本进行实时荧光定量pcr检测，扩增曲线ct值≤36且有典型s型扩增曲线，为阳性。
39.在本发明一个具体实施例中，seq id no.12～15所示探针的5
′
端标记fam，3
′
端标记bhq1，seq id no.16所示探针的5
′
端标记vic，3
′
端标记bhq2，seq id no.19所示探针的5
′
端标记cy5，3
′
端标记bhq2。对结果的判定方法具体为：
40.(1)首先分析内标在cy5通道是否检测扩增曲线，且ct≤36，若有，表示本次检测有效，继续阴性质控和阳性质控是否满足以下要求：
41.阴性质控：fam、vic通道无扩增曲线或有扩增曲线但ct>36；
42.阳性质控：vic通道扩增ct值均≤30，且熔解曲线分型结果为hpv16、hpv58、hpv45。
43.(2)阴性质控和阳性质控满足要求后再对样本检测结果进行如下具体分析：
44.a)样本在fam通道有扩增信号，且扩增ct值≤36，样本可判断为阳性，若fam通道检测到tm(71.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 16型检测结果为阳性；若fam通道检测到tm(66.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 18型检测结果为阳性；若fam通道检测到tm(62.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 45型检测结果为阳性；若fam通道检测到tm(56.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 52型检测结果为阳性；
45.b)样本在vic通道有扩增信号，且扩增ct值≤36，样本可判断为阳性，若vic通道检测到tm(69.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 31型检测结果为阳性；若vic通道检测到tm(61.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 33型检测结果为阳性；若vic通道检测到tm(56.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 58型检测结果为阳性；
46.c)若内标在cy5通道没有检测到ct或ct＞36，表示结果无效。
47.利用本发明引物探针组合对人乳头瘤病毒16、18、31、33、45、52、58型别进行分型检测，通过ct值和tm值两个维度的参数对结果进行分析，根据熔解曲线的ct值判断检测结果的阴性、阳性，分析熔解曲线的tm值确定hpv的不同型别，在保证检测灵敏度、特异性和准确性的同时显著提高了单管检测通量，在单管反应中实现了人乳头瘤病毒16、18、31、33、45、52、58型别的快速分型和高通量检测，大大节约了时间，降低了检测成本。
48.本发明采用不对称荧光定量pcr对待测核酸样本进行检测，扩增体系中，seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.17为限制性引物，各浓度为0.01～0.1um；seq id no.2、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.18为过量引物，各浓度为0.1～1um；各探针的浓度为0.1～0.2um。
49.基于hpv不同型别之间的同源关系，本发明设计hpv引物探针时，使部分型别公用引物或探针，从而降低了体系中引物和探针的用量，在保证检测准确性、灵敏度和特异性的同时，显著降低背景荧光值，降低检测成本。此外，本发明采用实时荧光pcr和熔解曲线分析结合的方法，显著提高了单管检测通量，打破普通实时荧光pcr荧光通道限制。
附图说明
50.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
51.图1示hpv 16型在fam通道熔解曲线；
52.图2示hpv 18型在fam通道熔解曲线；
53.图3示hpv 31型在vic通道熔解曲线；
54.图4示hpv 33型在vic通道熔解曲线；
55.图5示hpv 45型在fam通道熔解曲线；
56.图6示hpv 52型在fam通道熔解曲线；
57.图7示hpv 58型在vic通道熔解曲线；
58.图8示hpv内参在cy5通道熔解曲线；
59.图9示试剂盒检测hpv 16和45型混合阳性参考品在fam通道熔解曲线；
60.图10示试剂盒检测hpv 18和52型混合阳性参考品在fam通道熔解曲线；
61.图11示试剂盒检测hpv31、33和58型混合阳性参考品在civ通道熔解曲线。
具体实施方式
62.本发明公开了一种检测hpv病毒的引物和探针组合及其分型检测的试剂、应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技
术。
63.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
64.实施例1
65.1、引物探针合成
66.委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物探针，合成的引物探针序列具体如下：
67.表1
68.[0069][0070]
按照表1合成以上序列，用无菌双蒸水溶解至浓度为200μm，
‑
20℃保存。
[0071]
2、样本核酸提取：采用磁珠法核酸提取试剂提取hpv临床阳性样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性对照。核酸提取完成后，核酸提取液用于pcr检测，或将核酸提取液转移到离心管中于
‑
20℃保存。
[0072]
3、配制反应体系：反应体系为35μl。按顺序向扩增管中分别加入20μlrt
‑
pcr反应液a、10μl rt
‑
pcr反应液b，5μl核酸提取物，盖紧反应管，做好标记，离心10s，转移至pcr扩增区进行pcr检测。
[0073]
4、上机检测：采用宏石slan 96仪器检测。项目类型选择“标准熔解曲线”，且同时选择fam、hex、rox及cy5通道；熔解曲线参数选择“step mode”，然后将“扫描间隔”设置为0.5℃，“恒温”设置为8s。多重pcr反应步骤中，pcr扩增程序如下：50℃2min；95℃3min；95℃
15s，55℃30s，72℃30s，进行50个循环，55℃退火阶段同时采集fam、hex、rox、cy5四个通道的荧光信号；产物熔解曲线分析步骤程序设置为：95℃1min；45℃1min；25℃1min；30℃1min；逐步升温至85℃，在此过程中每上升0.5℃采集荧光信号1次。
[0074]
结果分析：
[0075]
(1)目的检测信号为fam，hex(或vic)，内参检测信号为cy5；
[0076]
(2)各通道分别确定基线及阈值：baseline一般设置为3
‑
15个循环，具体可根据实际情况进行调整。threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
[0077]
(3)首先分析内标在cy5通道是否检测扩增曲线，且ct≤36，若有，表示本次检测有效，继续阴性质控和阳性质控是否满足以下要求：
[0078]
阴性质控：fam、vic通道无扩增曲线或有扩增曲线但ct>36；
[0079]
阳性质控：fam、vic通道扩增ct值均≤30，且熔解曲线分型结果为hpv16、hpv58、hpv45。
[0080]
(4)阴性质控和阳性质控满足要求后再对样本检测结果进行分析：
[0081]
a)样本在fam通道有扩增信号，且扩增ct值≤36，样本可判断为阳性，若fam通道检测到tm(71.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 16型检测结果为阳性；若fam通道检测到tm(66.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 18型检测结果为阳性；若fam通道检测到tm(62.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 45型检测结果为阳性；若fam通道检测到tm(56.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 52型检测结果为阳性；
[0082]
b)样本在vic通道有扩增信号，且扩增ct值≤36，样本可判断为阳性，若vic通道检测到tm(69.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 31型检测结果为阳性；若vic通道检测到tm(61.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 33型检测结果为阳性；若vic通道检测到tm(56.0
±
2.0℃)特征峰，表示hpv 58型检测结果为阳性；
[0083]
c)若内标在cy5通道没有检测到ct或ct＞36，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。
[0084]
实施例2分型检测实验
[0085]
取确定含有hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv45、hpv52、hpv58中的至少一种的阳性样品作为阳性标准品按实施例1所述方法进行检测。结果见图1～11。
[0086]
由结果可知，本发明能够准确地检测出hpv病毒，并对相关型进行准确分型。
[0087]
实施例3特异性分析实验
[0088]
对核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体(cmv、hsv
‑
1、ct、gbs和uu)及hpv其他型别(hpv35、39、51、56、59、6、68等)采用实施例1所述方法进行检测，观察其在多重pcr反应体系中是否只在相应通道的特定tm值处形成熔解峰，是否不同病毒之间有交叉反应出现，以此验证反应体系的特异性。结果显示，本发明方法与其他病原体及hpv其他型别之间无交叉反应，证明本发明组合物有很好的特异性。
[0089]
实施例4灵敏度分析实验
[0090]
分别取不同型别的阳性质粒，采用生理盐水作为稀释液依次进行梯度稀释，获得4000copies/ml、2000copies/ml、1000copies/ml、500copies/ml、250copies/ml等不同浓度的检测限参考品。分别采用本发明实施例1的试剂盒及检测方法、潮州凯普化学有限公司的
《人乳头瘤病毒(23个型)核酸分型检测试剂盒(荧光pcr法)》作为对比试剂1及亚能生物技术(深圳)有限公司的《人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(pcr
‑
反向点杂交法)》作为对比试剂2，对上述不同浓度检测限参考品进行检测，结果如表2显示。
[0091]
结果显示，本发明方法均能够检测出500copies/ml浓度对应靶标，检测灵敏度为500copies/ml，对于部分型别检测灵敏度可达250copies/ml，对比试剂1～2只能检测出1000copies/ml浓度对应靶标，对于部分型别可检测出500copies/ml的靶标。此外，本发明试剂盒具有操作步骤少、检测时间短、单管通量大的优点。
[0092]
表2检测不同浓度检测限参考品
[0093][0094]
[0095]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。