重组III型人源化胶原蛋白的用途的制作方法

重组iii型人源化胶原蛋白的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及重组iii型人源化胶原蛋白的用途。


背景技术：

2.慢性子宫内膜炎(chronic endometritis,ce)是各种原因引起的子宫内膜结构发生持续性的炎性改变，常与慢性子宫颈炎、慢性输卵管炎同时存在。虽然慢性子宫内膜炎可能是无症状的，但在高达40％的不孕不育患者中会发现它的存在，并且该疾病是导致反复植入失败和反复流产的原因之一，近年研究表明，在反复移植失败的患者中ce患病率高达57.11％。虽然ce的治疗方法有很多，但因人群纳入选择和愈后标准不同导致结果差异较大。目前临床上常用口服抗生素治疗，但并没有给出统一的操作指南。
3.胶原蛋白，作为细胞外基质(extracellular matrix,ecm)的主要成分之一，是动物体内含量最丰富的蛋白质，约占总蛋白质的30％，在细胞粘附等生理过程中发挥着重要作用。胶原蛋白对蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性，可以通过自交联形成具有极高强度和稳定性的纤维，作为一种具有特殊生物相容性和理化特性的蛋白，已被广泛的应用于医药领域：包括心肌梗死、关节疾病等的治疗，以及作为外科手术用缝合线、止血剂、细胞培养基、人工血管和人工瓣膜等的材料等。
4.直至目前，各种研究使用的胶原蛋白绝大多数来自于动物组织、皮肤提取物。从动物体提取胶原蛋白水溶性差，可加工性很弱，直接限制了许多潜在用途的开发。因此，开发一种安全、有效并具有良好生物功能的胶原蛋白类材料在组织工程、医药美容等领域受到越来越广泛的关注。异种和异体胶原在人体中的应用具有高感染率、高排异性的风险,并且提取方法存在着成本高、污染重、来源受限制、提取量有限的致命缺点。因此利用基因工程技术生产胶原蛋白，可有效克服以上缺点。申请号为201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请(cn 109593126 a)记载了本发明的发明人在之前研究并生产的重组iii型人源化胶原蛋白，但并未直接披露其在医药领域中的具体用途。


技术实现要素：

5.发明要解决的问题
6.本发明拟应用cn 109593126 a中的重组iii型人源化胶原蛋白作为原材料，评价其用于子宫内膜修复的有效性。具体而言，本发明拟提供利用cn 109593126 a中的重组iii型人源化胶原蛋白来预防和/或治疗子宫相关疾病(特别是慢性子宫内膜炎)，用以改善子宫内膜的炎症状态，进一步提高ce患者的妊娠率。
7.用于解决问题的方案
8.本发明提供重组iii型人源化胶原蛋白在制备用于预防和/或治疗子宫相关疾病的药物中的用途，所述重组ⅲ型人源化胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的n个重复，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
9.优选地，所述n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、24或32，其中当n为大于等
于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
10.更优选地，所述n为16，各重复序列之间是直接连接的。
11.进一步地，在上述用途中，所述子宫相关疾病为子宫炎。
12.优选地，在上述用途中，所述子宫炎为子宫内膜炎。
13.更优选地，在上述用途中，所述子宫内膜炎为慢性子宫内膜炎。
14.进一步地，在上述用途中，所述慢性子宫内膜炎无症状或具有下列症状中的至少一种：子宫内膜变薄、子宫细胞外基质变化、炎症免疫因子表达上升和子宫内膜容受性降低。
15.进一步地，在上述用途中，所述子宫细胞外基质变化为金属蛋白酶组织抑制因子1(timp
‑
1)的增加和/或基质金属蛋白酶(mmps)的降低。
16.进一步地，在上述用途中，炎症免疫因子选自il
‑
1b、il
‑
6中的至少一种。
17.发明的效果
18.本发明研究结果表明，重组iii型人源化胶原蛋白可以减少内膜组织中cd138的表达，促进子宫内膜增厚和腺体的生成，抑制相关炎症免疫因子的表达，增加子宫内膜容受性并维护细胞外基质稳态，从而为治疗慢性子宫内膜炎的药物制备奠定基础，可以用于治疗慢性子宫内膜炎。
附图说明
19.图1为四组大鼠模型不同时期子宫切片分析结果。
20.图2为四组大鼠模型不同时期细胞外基质相关基因表达水平检测结果。
21.图3为四组大鼠模型不同时期炎症免疫相关因子基因表达水平检测结果。
22.图4为四组大鼠模型不同时期子宫内膜容受性分析结果。
23.图5为四组大鼠模型不同时期cd138表达水平检测结果。
具体实施方式
24.以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明的技术方案。
25.本发明所述重组iii型人源化胶原蛋白为申请号为201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请记载。
26.在一项实施方案中，本发明的重组ⅲ型人源化胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列(由30个氨基酸组成，从n段到c段依次为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap)的n个重复，n为大于等于1的整数；其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
27.在一项优选的实施方案中，本发明的重组ⅲ型人源化胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的n个重复，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、24或32；其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
28.在一项更优选的实施方案中，本发明的重组ⅲ型人源化胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的16个重复，各重复序列之间是直接连接的。
29.除非另有说明，本发明中使用的仪器、试剂、材料、实验动物等均可通过常规商业手段获得。
30.实施例1：重组iii型人源化胶原蛋白促进ce大鼠子宫内膜形态学恢复
31.80只6
‑
8周sprague dawley大鼠(220
‑
260g)购买并饲养于重庆医科大学动物中心。饲养1周后，将大鼠随机分为正常对照组(n＝20，40个子宫)、假手术组(n＝20，40个子宫)、模型组(n＝20，40个子宫)、治疗组(n＝20，40个子宫)。
32.正常对照组(nc)大鼠不予以任何处理。假手术组(sham)仅大鼠麻醉、腹部消毒后，开腹，将子宫暴露在空气中30min后缝合腹部，24h麻醉后行相同的操作。模型组(model)大鼠麻醉、腹部消毒后，开腹，自宫角处向两侧宫腔内各注射150μl lps溶液(5mg/ml)后缝合腹部，24h麻醉、消毒开腹于相同的位置注射150μl无菌pbs溶液后缝合腹部。治疗组(col)大鼠麻醉、腹部消毒后，开腹，自宫角处向两侧宫腔内各注射150μl lps溶液(5mg/ml)后缝合腹部，24h后麻醉、消毒开腹于相同的位置注射150μl重组iii型人源化胶原蛋白(包含16个重复序列)溶液(10mg/ml)后缝合腹部。每组分别于治疗1d、4d、7d、14d、28d处死4只大鼠，取大鼠双侧子宫。将大鼠子宫分别保存于rna保存液和多聚甲醛中，用于后续实验。
33.取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫，并进行石蜡包埋切片，而后进行如下操作：
34.(1)石蜡切片脱蜡脱至水：将切片依次放入二甲苯i，二甲苯ii，各浸泡10min。然后依次放入无水乙醇i、无水乙醇ii、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各5min，用蒸馏水冲洗2
‑
3min。
35.(2)苏木素染细胞核：将切片放入苏木素染3
‑
5min，用自来水冲洗2
‑
3min，1％盐酸酒精分化3
‑
5s，自来水冲洗2
‑
3min。
36.(3)伊红染色：将切片放入伊红染色液中染色1
‑
3min。
37.(4)脱水封片：将切片依次放入70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇ii、无水乙醇i、二甲苯ii、二甲苯i各5min，然后将切片拿出稍晾干，中性树脂封片。
38.(5)图像采集分析
39.染色后每张切片在100倍高倍镜下拍照，随机选取5个视野，用image pro
‑
plus图像处理软件测量子宫内膜厚度和计数腺体数目，取5个视野的平均值。
40.结果如图1所示，模型组由于慢性子宫内膜炎造成大鼠子宫内膜变薄，腺体数量减少。而治疗组在灌注重组iii型人源化胶原蛋白之后，大鼠子宫内膜逐渐变厚，治疗14天后，趋于正常，而且腺体数量逐渐变多。
41.实施例2：重组iii型人源化胶原蛋白促进细胞外基质重塑
42.建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。
43.取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫，并进行如下处理：
44.(1)总rna提取
45.①
组织称重，100mg组织加入1ml trizol，用匀浆机将组织在低温条件下研磨均匀，冰上静置3
‑
5min。
46.②
加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置3
‑
5min。
47.③
4℃13000rpm/min离心15min，将上清液吸入到新的离心管中，冰上静置10min。
48.④
4℃13000rpm/min离心10min，可见白色沉淀，弃上清。
49.⑤
加入1ml预冷75％乙醇，4℃7000rpm/min离心5min，弃上清。
50.⑥
超净台风干5min，加入25μl无rnase水。
51.(2)逆转录cdna
52.①
测定提取的总rna，测定浓度，然后配平至1μg/μl。
53.②
配制rna
‑
primer mix：
[0054][0055]
③
低速离心机离心rna
‑
primer mix，65℃10min，使其变性，冷却后放置于冰上。
[0056]
④
配制cdna逆转录反应液：
[0057][0058]
⑤
37℃孵育1h，85℃灭活5min。
‑
20℃保存。
[0059]
(3)pcr反应
[0060]
①
配制反应液：
[0061][0062]
②
离心，设置pcr反应检测仪程序：
[0063][0064]
③
上述反应结束后，分析溶解曲线：
[0065][0066]
一般认为，慢性子宫内膜炎会造成大鼠子宫细胞外基质(ecm)的增加，同时能够减缓其降解。而胚胎的着床受滋养层介导，在着床过程中具有侵蚀力的滋养层可遇到大量的细胞外基质，分泌中、晚期子宫内膜过量的细胞外基质表达阻止胚泡植入而导致不孕。
[0067]
对组织中ecm成分的基因表达进行qpcr检测的结果如图2所示，经过重组iii型人源化胶原蛋白治疗之后，ecm的成分在d1
‑
d4之间出现增加的趋势，但是d7后逐渐减少，d28回复接近正常水平，说明重组iii型人源化胶原蛋白参与了细胞外基质的动态调节过程。
[0068]
timp1、mmp
‑
2是细胞外基质相关因子。金属蛋白酶组织抑制因子1(timp
‑
1)是基质金属蛋白酶的组织抑制剂，是表达于组织中常见的一种糖蛋白。基质金属蛋白酶(mmps)是一类降解细胞外基质的一类多肽家族。mmps高表达能促进细胞迁移和增殖。timps家族抑制mmps家族功能，调节后者发挥正常的功能。两者共同维护细胞外基质稳态。图2结果显示mmp2在治疗组中含量明显增加，其大幅降低了细胞外基质。而作为mmp2的抑制剂，timp
‑
1在治疗组中明显少于模型组。
[0069]
实施例3：重组iii型人源化胶原蛋白抑制炎症因子的生成
[0070]
建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。
[0071]
取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫，并进行如实施例2的处理。
[0072]
对组织中免疫相关因子il
‑
1b、il
‑
6基因表达水平进行qpcr检测的结果如图3所示，发现在模型组中，两个免疫相关因子均出现了上升趋势，而治疗组相关因子的表达虽然也处于上升趋势，但是相比于对照组，明显低于对照组的相对表达量，并且在d7
‑
d14时，便呈下降趋势。因此，可以说明，重组iii型人源化胶原蛋白能够降低炎症免疫因子的表达，从而调节细胞免疫作用。
[0073]
实施例4：重组iii型人源化胶原蛋白改善大鼠子宫内膜容受性相关因子的表达
[0074]
建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。
[0075]
取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫并进行石蜡包埋切片，对其做如下处理：
[0076]
(1)石蜡切片60度烘烤2h。
[0077]
(2)将切片依次放入二甲苯i、二甲苯ii，各浸泡20min。然后依次放入无水乙醇i、95％乙醇、85％乙醇各5min，用pbs冲洗3minx3次。
[0078]
(3)将组织切片浸泡在枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中高火加热至沸腾后，中火加热5minx3次，每次中间休息3min。然后拿出静置至室温。然后用pbs冲洗3minx3次。
[0079]
(4)擦净组织周围水分，滴加100μl内源性过氧化物酶阻断剂遮盖组织，湿盒中孵育10min以充分灭活内源性过氧化物酶。然后用pbs冲洗3minx3次。
[0080]
(5)擦净组织周围水分，滴加100μl封闭用正常山羊血清工作液覆盖组织，湿盒中孵育15min。
[0081]
(6)将山羊血清工作液甩干，每个组织滴加100μl hoxa10抗体稀释液(稀释比例为1:300)。湿盒孵育4度过夜。
[0082]
(7)将湿盒放置在37度复温30min。用pbs冲洗5minx3次。滴加100μl或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔igg聚合物，室温孵育15min。pbs缓冲液冲洗5min
×
3次。
[0083]
(8)滴加100μl或适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min。pbs缓冲液冲洗5min
×
3次。
[0084]
(9)显色：加入适量新鲜配制的dab，室温孵育3min。
[0085]
(10)复染：自来水冲洗，苏木素染色液孵育1min。1％盐酸酒精分化2s、冲洗返蓝。
[0086]
(11)组织切片60度烘烤1h。二甲苯i、二甲苯ii，各浸泡20min。然后依次放入85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇i各5min，二甲苯ii、二甲苯i各10min，中性树脂封片。
[0087]
(12)图像采集分析
[0088]
染色后每张切片在200倍高倍镜下拍照，随机选取5个视野，用image pro
‑
plus图像处理软件测量并分析切片平均吸光度值。
[0089]
hoxa10是同源框基因家族中重要的一员，在正常人的子宫内膜腺上皮、间质细胞中均有表达，起到编码转录因子、促进细胞分化和调控胚胎发育的作用。研究表明在子宫内膜癌、卵巢癌、子宫内膜异位症及其他妇科疾病患者内膜中均检测到hoxa10的异常表达。
[0090]
hoxa10检测结果如图4所示，模型组中，大鼠子宫hoxa10表达降低，而治疗组hoxa10表现了上升的趋势，说明重组iii型人源化胶原蛋白能够改善子宫内膜容受性，促进胚胎的种植。
[0091]
实施例5：重组iii型人源化胶原蛋白抑制cd138的表达
[0092]
建立大鼠实验模型，具体方法同实施例1。
[0093]
取0/1/4/7/14/28天的大鼠子宫并进行石蜡包埋切片，对其做同实施例4处理，其中步骤(6)抗体稀释液为cd138抗体稀释液(稀释比例为1:300)。
[0094]
cd138阳性表达常用于诊断慢性子宫内膜炎。cd138免疫组化检测结果如图5所示，模型组的大鼠子宫内膜cd138表达增加，治疗组经重组iii型人源化胶原蛋白治疗后大鼠子宫内膜cd138表达降低。
[0095]
总结：在lps构建的慢性子宫内膜炎大鼠模型中，重组iii型人源化胶原蛋白能够减少内膜组织中cd138的表达，并促进造模后损伤的子宫内膜增厚和腺体的生成。同时，能够抑制炎症因子的生成，增加子宫内膜容受性。其作用可能与细胞外基质成分的重塑相关。