VDAC1基因在调控植物开花期中的应用的制作方法

vdac1基因在调控植物开花期中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体地说vdac1基因在调控植物开花期中的应用。


背景技术：

2.vdac是定位于线粒体外膜中最重要的电压依赖性阴离子通道蛋白质，在线粒体和细胞质之间的代谢物运输中发挥作用。vdac蛋白占线粒体表面的34.2％。这些运输功能有助于调节植物的生长。vdac1参与生殖发育，突变体降低种子结实率。除了种子，花粉发育也会受到影响，包括花粉粒数、花粉发芽率、萌发花粉筒长度等。vdac1突变体的合子或早期胚致死率上升可能是其种子产量下降的主要原因。vdac在植物生长过程中起着重要作用，但是人们对每种亚型的具体功能仍知之甚少，尤其是与花期有关的vdac的功能。
3.在此，我们发现vdac1在花的转变过程中起抑制作用，且vdac1蛋白与ft蛋白质存在相互作用。atvdac1功能的缺失导致了早花表型。研究结果表明，vdac1在花的转变过程中通过ft蛋白发挥作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了拟南芥基因vdac1在调控植株开花期中的应用。
5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
6.本发明提供了拟南芥基因vdac1在调控拟南芥开花期中的功能。
7.进一步地：拟南芥vdac1基因插入突变的植株与野生型植株相比提前开花。
8.进一步地：突变vdac1基因的拟南芥植株莲座叶数目在长日照条件下少于野生型。
9.进一步地：拟南芥vdac1
‑
gus在拟南芥的各个部位都有显著性表达。
10.进一步地：拟南芥vdac1蛋白与ft蛋白相互作用，调控拟南芥开花。
11.本发明的优点和有益效果：
12.1.利用现有的植物生物技术，本发明筛选获得拟南芥突变体vdac1
‑
5的t
‑
dna插入突变体的纯合植株，并将其与相同条件下生长的野生型植株开花时间及莲座叶数目进行比较，发现突变vdac1
‑
5(at3g01280)基因引起植株中开花相关基因(ft)的定位变化，促进拟南芥开花。
附图说明
13.图1(a)为atvdac1
‑
5(salk_058473c)突变体的基因示意图，其中atvdac1
‑
5突变体的基因座中黑色和灰色框分别代表外显子和未翻译的区域，黑色的线条代表内含子；t
‑
dna为基因组插入突变；(b)
‑
(c)分别为检测突变体atvdac1
‑
5和野生型(wt)的pcr电泳图和半定量图，表明atvdac1
‑
5突变体中vdac1基因不表达。
14.图2(a)
‑
(b)分别为atvdac1
‑
5突变体在长日照(ld)条件下的开花表型和开花时莲
座叶数目统计，ld条件下野生型拟南芥莲座叶为13片，突变体atvdac1
‑
5的莲座叶为11片，具有显著性差异(*：p<0.05)；(c)将vdac1
‑
5基因转入突变体atvdac1
‑
5转基因拟南芥植株中，获得vdac1
‑
5的基因回复株系atvdac1
‑
5 gvdac1
‑
5。进行表型鉴定后发现，atvdac1
‑
5突变体背景下的回复株系莲座叶片数为13片，其表型和野生型莲座叶13.2片相比无显著性差别。
15.图3为拟南芥发芽后3,5,7,9,11,13天的苗子进行gus染色，检测vdac1的表达部位。
16.图4(a)
‑
(b)分别为酵母双杂和农杆菌介导的烟草瞬时转化实验，验证vdac1和ft相互作用；
17.图5为双突的拟南芥表型图，表明vdac1与ft蛋白之间存在相互作用并调控拟南芥开花。
具体实施方式
18.下面结合附图和具体实施例来对本发明的技术方案进一步详细的说明。
19.上述实验中用到的试剂等购自takara，roche，tiangen，cwbio等公司。
20.实验中用到的试剂和药品说明：见《分子克隆》第三版。
21.实施例1纯合子突变体的获得
22.1.突变体的获得
23.所用atvdac1
‑
5突变体为t
‑
dna插入。
24.2.拟南芥植物叶片dna提取
25.取适量种子于湿润的滤纸，放置于4℃冰箱黑暗处理48小时后，种子破休眠结束，移入土中放置温室培养(16小时光照/8小时黑暗，23℃，10000lux)，一盆点五颗种子，用保鲜膜覆盖保持稳定的发芽条件，2天后继续培养至11天，可取适量叶片提基因组。
26.对野生型wt和atvdac1
‑
5突变体拟南芥采用自配的tps提取液进行提取dna基因组，具体操作如下：
27.①
将叶片样品采集至1.5ml离心管中，加入适量tps和小钢珠，利用研磨仪55hz，2min将其研碎，晃动均匀。
28.②
13000rpm离心10min，取出上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入等量异丙醇。
29.③
13000rpm离心5min，弃上清，加入500μl 75％乙醇，上下晃动数次。13000rpm离心5min，弃上清，重复上一步操作。
30.④
13000rpm空离2min，用移液枪尽量吸完管中液体，放于37℃烘箱中烘干，加入50μl温热的ddh2o，待其完全溶解即可。
31.tps提取液配方
32.tps(100ml)：1m tris
‑
hcl(ph8.0)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10ml
33.ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5m edta(ph8.0)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
40ml
34.ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2m kcl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50ml
35.3.atvdac1
‑
5突变体的纯合子鉴定
36.(1)设计鉴定引物
37.primer name forward(5
’–3’
)
38.atvdac1
‑
5 lp：gggaaagatcagtagttgccc，如seq id no.1所示
39.atvdac1
‑
5 rp：tcgttgctcataatctggctc，如seq id no.2所示
40.salk
‑
lbb1.3：attttgccgatttcggaac，如seq id no.3所示
41.采用该atvdac1
‑
5 lp,atvdac1
‑
5 rp引物pcr扩增上面所提取获得的野生型wt基因组dna后得到1184bp大小的片段，而扩增上面所提取的atvdac1
‑
5突变体的基因组dna后无明显条带；引物salk
‑
lb1.3和atvdac1
‑
5 rp pcr扩增上面所提取获得的野生型wt基因组dna后无明显条带，而扩增上面所提取的atvdac1
‑
5突变体基因组dna后得到907bp片段。
42.(2)pcr反应体系：
[0043][0044]
(3)pcr反应程序：
[0045][0046]
1％琼脂凝胶电泳检测。
[0047]
4.拟南芥总rna的提取(天根公司rna试剂盒)
[0048]
佩戴手套用75％乙醇对操作台进行清洁消毒以防止环境中的污染；为防止唾液中rna酶的降解作用，全过程应佩戴口罩；为降低rna的降解程度，应尽量使提取在低温中进行；此外应保证过程中所有直接接触样品的东西都为rnase
‑
free。本实验所采用的是天根公司的rna试剂盒，具体操作如下：
[0049]
①
首先用洁净的剪刀剪取22：00时间点的拟南芥莲座叶2片，置于1.5ml离心管中，加入小钢珠，迅速放于液氮中冷冻，利用自动研磨仪35hz，2min进行研磨将其研磨成粉末。
[0050]
②
配置具有1％β
‑
巯基乙醇的rl，适量加入粉末中，震荡混匀后转至cs柱，在低温下高速离心5min得到澄清的液体。
[0051]
③
将上层清液转移至已事先加入0.5倍体积无水乙醇的新1.5ml离心管，混匀转移至cr3柱，低温高速离心1min，弃废液。
[0052]
④
加入350μl rw1，低温离心1min，弃废液后加入80μl的dnasei工作液，在28℃放置30min后加入500μl rw。
[0053]
⑤
低温离心1min，弃废液。
[0054]
⑥
空离2min，弃废液。
[0055]
⑦
将cr3柱头放置于新的1.5ml离心管中，于室温下静置至柱头膜干燥，往膜上加入30μl温热的洗脱液或灭菌ddh2o，常温高速离心2min即可得到总rna。
[0056]
5.反转录(天根公司逆转录试剂盒)
[0057]
本实验所采用的是天根公司的逆转录试剂盒：fastquantrt kit(with gdnase)，具体操作如下：
[0058]
①
0.2mlrnase
‑
free ep管中，加入以下成分：
[0059][0060]
②
混合均匀后，放于42℃静置3min；后放置于冰上5min。
[0061]
③
在反应后的rnase
‑
free ep管中，加入下列成分：
[0062][0063]
④
混合均匀后，放于42℃静置30min；后转移至95℃静置3min即可，获得的cdna于
‑
20℃保存。
[0064]
6.atvdac1
‑
5突变体的vdac1基因表达检测
[0065]
设计鉴定引物
[0066]
primer name forward(5
’–3’
)
[0067]
vdac1 f：cgctaccgttgatgagg，如seq id no.4所示
[0068]
vdac1 r：tgaagaatgacttgggtttcc，如seq id no.5所示
[0069]
(2)pcr反应体系：
[0070][0071]
(3)pcr反应程序：
[0072][0073]
1％琼脂凝胶电泳检测。
[0074]
采用该vdac1 f,vdac1 r引物pcr扩增wt后有vdac1基因表达，而突变体无明显条带。
[0075]
采用该vdac1 f,vdac1 r引物pcr扩增上述cdna后得到的扩增产物；wt有vdac1基因表达，而atvdac1
‑
5突变体vdac1基因不表达，无明显条带。
[0076]
图1(a)为atvdac1
‑
5突变体的基因示意图，其中atvdac1
‑
5突变体的基因座中黑色和灰色框分别代表外显子和未翻译的区域，黑色的线条代表内含子；t
‑
dna为基因组插入突变；(b)
‑
(c)分别为检测突变体atvdac1
‑
5和wt的pcr电泳图和半定量图，表明atvdac1
‑
5突变体中vdac1基因不表达。
[0077]
实施例2开花时间及莲座叶数目统计分析
[0078]
在23℃条件下，在长光照(16h/8h，光照/暗)10000lux光照条件下生长。选取生长正常的拟南芥野生型植株wt和atvdac1
‑
5植株各20株，统计植株开花后的莲座叶数目。
[0079]
统计结果如图2(a
‑
b)所示，atvdac1
‑
5植株拟南芥莲座叶叶片数为11.4片左右，野生型莲座叶叶片数为13片左右，具有显著性差异，即atvdac1
‑
5突变体植株的开花时间早于野生型。说明拟南芥中vdac1基因突变后促进植株开花。atvdac1
‑
5突变体在长光照条件下表现为提前开花。(c)为突变体背景下的回复株系，叶片数与野生型相似，都为13片左右，表明vdac1基因回复了atvdac1
‑
5突变体的早花表型，即vdac1基因抑制拟南芥开花。
[0080]
实施例3 vdac1
‑
gus在拟南芥中的表达部位
[0081]
图3为拟南芥的gus染色，检测vdac1在拟南芥的表达。通过gus的染色结果可知，
vdac1在拟南芥的根、茎、叶、果实、花等部位都有vdac1的表达。且由发芽后3
‑
13天的染色结果可知，随着时间的增长，vdac1
‑
gus在拟南芥各个部分的染色程度逐渐加深，即vdac1
‑
5的表达量逐渐增加。通过检测vdac1的表达量表明，vdac1在拟南芥的莲座叶，茎生叶，根，果荚等部位都有显著性表达，与染色部位结果相一致。
[0082]
1.转基因获得gus阳性株系
[0083]
通过构建pcambia1300
‑
gvdac1
‑
gus载体，并进行转基因筛选得到阳性株系。
[0084]
2.gus染料的配置
[0085]
(1)200mmol/l磷酸缓冲液(ph 7.0)
[0086]
制备方法：
[0087]
a液：称取nah2po4·
2h203.12g溶于灭菌后的蒸馏水，定容至100ml。
[0088]
b液：称取na2hpo4·
12h207.17g溶于灭菌后的蒸馏水，定容至100ml。
[0089]
取100mlb液与40mla液混合，用nah2po4·
2h20溶液调至ph7.0。
[0090]
(2)染色液
[0091][0092][0093]
说明：
[0094]
gus活性的精准定位需要有亚铁离子。gus酶水解其底物x
‑
gluc产生可溶性色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加fe2‑
，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，gus酶的定位越准确。
[0095]
3.vdac1 gvdac1
‑
gus材料的种植
[0096]
(1)1/2ms培养皿的配置
[0097]
ms：3.37g/l
[0098]
蔗糖：15g/l
[0099]
琼脂：8g/l
[0100]
调ph至5.7
[0101]
定容至1l后，121℃灭菌20min，待温度降至40℃左右，向培养基中加入抗生素潮霉素300μl，抗生素浓度为100μg/μl.
[0102]
(2)配置10％的naclo
[0103]
在超净台条件下取naclo溶液5ml，用无水乙醇定容至50ml，用锡箔纸包住避光4℃冰箱保存。
[0104]
(3)灭种子
[0105]
量取50μl种子装于灭菌的1.5ml的ep管中，加入700μl的10％的naclo悬浊液，持续上下混匀10min左右。倒出10％的naclo溶液废液，向其中加入无水乙醇持续上下震荡5min，倒出废液，反复5次。将湿润的种子置于超净台烘干。
[0106]
(4)点种子
[0107]
将烘干的种子点入含有抗生素的培养皿中，4℃冰箱黑暗避光两天破休眠。将培养皿拿出，在23℃温室培养。
[0108]
4.gus染色
[0109]
将发芽后3,5,7,9,11,13天的拟南芥苗材料浸泡在染液中，抽真空后置于37℃保温染色。叶片等绿色材料转入无水乙醇中脱色2
‑
3次，到阴性对照材料呈白色。显微镜下观察叶片表面的蓝色小点即为gus表达位点。
[0110]
图3为拟南芥发芽后3,5,7,9,11,13天的苗子进行gus染色，检测vdac1的表达部位。
[0111]
实例4 vdac1与ft蛋白之间的相互作用
[0112]
图4(a)
‑
(b)通过酵母双杂和农杆菌介导的烟草瞬时转化实验验证了ft和vdac1蛋白之间存在相互作用。通过对vdac1株系和ft相关材料，suc2:ft
‑
9myc，suc2:flag
‑
ft，knat:ft杂交，获得纯和株系。图5表明经过表型鉴定，vdac1进一步促进了suc2:ft
‑
9myc，suc2:flag
‑
ft，knat:ft等株系的早花性状。ft
‑
10vdac1的双突株系抑制了ft
‑
10的晚花性状。因此，vdac1通过与ft相互作用抑制拟南芥开花。
[0113]
1.酵母双杂
[0114]
(1)挑取一个酵母单克隆，溶于1mlypda培养液中，吹打均匀后转移到20ml的ypda(250ml锥形瓶)中，28℃，200rpm，摇床过夜；
[0115]
(2)13小时左右，取1ml菌液，测od
600nm
，大于1.6即可；
[0116]
(3)取适量的菌液(2.5ml左右)到100mlypda中，使得od
600nm
在0.2
‑
0.3之间，28℃，200rpm，培养3小时左右，至od
600nm
在0.4
‑
0.6之间；
[0117]
(4)菌液转移至50ml离心管，室温1000g，离心5min，取上清；
[0118]
(5)使用25ml无菌水重悬，1000g去上清；
[0119]
(6)用1.5ml 1x te/1x liac轻轻重悬细胞，制成感受态细胞；
[0120]
(7)分装感受态细胞，100ul每管，分别加入含有10ul carrier dna(沸水煮10min，冰上5min)和ad
‑
vdac1和bd
‑
ft质粒的混合液，轻轻混合均匀；
[0121]
(8)每管加0.6mlpeg/liac高速震荡10s，28℃，200rpm，30min；
[0122]
(9)加70uldmso,轻轻混匀；
[0123]
(10)42℃水浴热激15min，冰上放置1
‑
2min；
[0124]
(11)13000rpm离心1min，加200ul 1x te吹匀；
[0125]
(12)取200ul菌液涂板(sd/
‑
leu
‑
trp)，30℃培养2天；
[0126]
(13)2天后取单克隆溶于20ul灭菌水中，点板(sd/
‑
leu
‑
trp
‑
ade
‑
his)。
[0127]
2.农杆菌介导的烟草瞬时转化实验
[0128]
(1)将转化cluc
‑
vdac和ft
‑
nluc农杆菌的载体存菌重新在含有kan

,rif

的lb培养皿上分别活化，挑取大小一致的单菌落于5ml液体lb(含kan

,rif

)中摇菌(28℃，200rpm)过夜。
[0129]
(2)第二天取1ml菌液到10ml液体lb(含kan

,rif

)中扩大培养，od
600nm
至0.5后离心(5000rpm)收菌。
[0130]
(3)用10mm ms
‑
mes(ph5.6)溶液重悬菌体洗涤两次，最后用as
‑
ms
‑
mes(ph5.6)溶液重悬菌体，调od至0.5。
[0131]
(4)将上步调好的cluc
‑
vdac和ft
‑
nluc农杆菌按照n端c端结合原理进行1：1配比，室温放置3小时，使菌液充分混合。然后于健康平整的烟草表面，将混匀菌液适量注射于叶片表面直至晕开一个圆圈。
[0132]
(5)将注射过菌液的烟草放置于黑暗条件下28℃培养48小时，然后恢复光照，持续光照16小时。
[0133]
(6)进行luc活性检测：在烟草叶片表面喷洒1mm虫荧光素酶，轻轻拍打以便叶片沾染均匀。避光处理5min。
[0134]
(7)使用预冷至
‑
120℃的ccd成像装置捕捉luc图像，每张获取luc图像时的曝光时间为7
‑
9min，捕捉叶片叶绿体自发荧光成像的曝光时间为，光照1min后再曝光2min。
[0135]
以上证据证明，vdac1通过于ft相互作用。突变的vdac1基因，可能通过影响ft蛋白的功能，从而改变植株的开花期。
[0136]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使用相应技术方案本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。