固相微萃取头及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种固相微萃取头及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前，硝基呋喃类药物代谢物的检测标准主要有《gb/t21311
‑
2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱
‑
串联质谱法》、《gb/t20752
‑
2006猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱
‑
串联质谱法》，以上标准中的方法均为高效液相色谱
‑
串联质谱法(hplc
‑
ms/ms)，其常用的提取净化方法为液液萃取和固相萃取。
3.但是对于上述方法而言，液液萃取提取物范围较广泛，共提出物质较多，对极致复杂的样品可能造成干扰；而且液液萃取依赖人工完成，无法实现自动化。此外，如果采用《gb/t20752
‑
2006猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱
‑
串联质谱法》固相萃取法进行前处理，其也存在如下缺点：
①
过柱需要用甲醇、水预洗
→
提取液过柱
→
水清洗杂质
→
洗脱等步骤，操作较繁；
②
固相萃取柱成本较高；
③
可通过全自动固相萃取仪实现自动化，但全自动固相萃取仪的价格昂高贵，一般实验室难以配备；
④
对粘稠性、胶体状复杂性样品存在易产生堵塞、不宜洗脱等问题。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种固相微萃取头及其制备方法和应用，所得固相微萃取头对硝基呋喃类代谢物具有高效的吸附和解吸能力，以及杂质的优异去除能力，可有效提高硝基呋喃类代谢物的定量限，且效果明显优于国标的检测结果。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种固相微萃取头的制备方法，包括以下步骤：
6.将聚丙烯腈pan粉末溶解于二甲基甲酰胺中，室温下搅拌溶解，得到饱和溶液；
7.将hlb颗粒研磨至预定粒径后，加入pan溶液中混合均匀，得到pan
‑
hlb浆料；
8.将所得浆料以1800
‑
2000转/分钟的转速充分震荡，使颗粒混合物均匀分布后，将其均匀涂布于牙签头上；
9.将涂布有pan
‑
hlb浆料的牙签于溶剂溶液中以1500
‑
1800转/分钟的转速充分震荡清洗，以去除残留；
10.将牙签固相微萃取头浸泡于体积比为1：1的甲醇/水混合物中进行预处理，激活牙签上的hlb，干燥，得到固相微萃取头。
11.本发明上述方案提出了一种新的固相微萃取的理念，并且基于该理念研制出了牙签固相微萃取头，该技术具有无需溶剂、萃取速度快、重现性好、样品消耗量小、操作简便、可进行现场分析等特点，是对动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量检测过程中前处理技术的改进和优化。需要说明的是，上述方案中使用的hlb颗粒可通过商购的方式获得，例如购买于waters公司，为一种固相萃取吸附剂的商品名，由亲脂性二乙烯苯和亲水性n
‑
乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有亲水
‑
亲脂平衡性。
12.具体的，本发明所采用的固相微萃取(spme)技术与现有的固相萃取(spe)技术是有显著不同的。其中，spe技术有三个重要过程：首先，样品通过固体吸附剂，样品中的目标分析物被完全萃取出来；其次，使用淋洗溶剂将干扰成分从吸附剂中洗脱下来；最后，使用洗脱溶剂将目标分析物从吸附剂上洗脱下来。spe追求的是目标物的绝对回收率，因而spe的各步骤都有严格的操作要求。但商品化的spe填充过程都使用了过量的填料，残留检测绝大多数阳性样品的含量是ppb级的，这就造成了极大的浪费。
13.与其不同之处在于，本发明采用的spme技术是利用平衡萃取和选择性吸附的原理将目标分析物从样品体系中转移到涂层上，主要有两个步骤：第一步将涂层暴露于样品中，由于涂层对分析物有极强的亲和性因而分析物被有选择性的萃取；第二步将涂层上萃取的物质解吸下来。由于spme不需要完全将目标物吸附，因此它所追求的是相对回收率(通过内标法加以实现)，这就极大的简化了操作步骤，降低了检测成本，检测时间大大缩短。
14.作为优选，所述hlb颗粒的粒径为25
‑
30μm。在一优选中，所述hlb颗粒的粒径为30μm。可以理解的是，选择该粒径下的hlb颗粒是因为hlb粒径大小会显著影响其对待测化合物的吸附能力，随着粒径增大，吸附因子也随之增大(350
‑
500)。
15.作为优选，所述pan
‑
hlb浆料中hlb颗粒的含量为0.025g
‑
0.075g。可以理解的是，对上述浆料中的hlb颗粒的含量加以限定，目的在于pan作为hlb和牙签的吸附剂，其与hlb的含量比关系显著影响spme的制备。若pan的质量过大，hlb的配比不足则会影响对目标分子的吸附效果，而pan质量过大，则很难粘合在牙签上，因此发明人经过多次试验，得到最佳比例。
16.作为优选，所述溶剂溶液为甲醇、异丙醇和乙腈的混合溶液，其体积比为50:25:25。
17.本发明还提供了一种根据上述任一项技术方案所述的制备方法制备得到的固相微萃取头。
18.本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的固相微萃取头在快速检测动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量中的应用。
19.本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的固相微萃取头快速检测动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量的方法，包括以下步骤：
20.将制备好的固相微萃取头放入调节好ph的含动物源性食品的硝基呋喃代谢物衍生液中，置于36
‑
37℃的恒温振荡器中以1500
‑
1800转/分钟的转速震荡萃取30
‑
40min；
21.取出固相微萃取头放入装有水的离心管中，置于36
‑
37℃恒温振荡器中以1500
‑
1800转/分钟的转速震荡清洗；
22.清洗完毕后，取出固相微萃取头放入装有乙酸乙酯的离心管中，置于36
‑
37℃恒温振荡器中以1500
‑
1800转/分钟的转速震荡解吸30
‑
40min；
23.随后于45
‑
50℃下用氮气吹干，用流动相定容至0.5ml，通过0.2μm滤膜过滤至样品瓶中，采用液相色谱质谱测定硝基呋喃类代谢物残留量。
24.作为优选，液相色谱质谱测定的色谱测定条件为：
25.色谱柱：zorbaxeclipseplusc18(1.8μm，2.1
ⅹ
50mm)；柱温：40℃，流速：0.3ml/min，进样量：10μl；流动相：a：10mm乙酸铵 0.1％甲酸水，b：甲醇；
26.梯度洗脱程序：0
→
3.0min，由10％b
→
90％b；3.0
→
5.0min，90％b；5.0
→
6.5min，
由90％b
→
10％b，平衡1min。
27.作为优选，液相色谱质谱测定的质谱条件为：
28.电离方式：esi

；扫描方式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压：5500v；雾化气压力(gs1)：55psi；气帘气压力(cur)：35psi；辅助气压力(gs2)：50psi。
29.作为优选，含动物源性食品的硝基呋喃代谢物衍生液的制备方法为：
30.将含动物源性食品的均质试样加入50ml聚丙烯离心管中，加入0.1μg/ml的内标工作溶液30μl，然后分别加入17ml 0.125mol/l盐酸溶液和1.0ml衍生剂，均质1min，置于36
‑
37℃恒温振荡器中保持16
‑
17h；
31.以10000r/min离心10min，取上清10ml，加入1ml磷酸氢二钾溶液，用1mol/l氢氧化钠溶液和0.1mol/l的盐酸水溶液调节ph至7.0；
32.然后加入5ml正己烷，涡混2min除油，以10000r/min离心10min，弃去正己烷层，得到含动物源性食品的硝基呋喃代谢物衍生液。
33.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
34.1、本发明采用自制的固相微萃取头即可实现动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量的快速检测，该过程中通过在牙签头上包裹约1cm左右的填料自制成了固相微萃取头就实现了对传统的固相萃取柱的替代，在效果良好的前提下，实现了成本的极大节约，可节省固相萃取柱费用的十分之一；
35.2、进一步，在上述检测过程中，采用震荡搅拌的方式替代了过柱，克服了对粘稠性、胶体状复杂性样品存在易产生堵塞、不宜洗脱的问题；同时，也克服复杂样品基质液液萃取净化效果差，ahd检测过程中可能存在干扰的问题(见图9)；
36.3、进一步，采用本发明所提供的方法还无需购置昂贵的全自动固相萃取仪，借助衍生化中用到的恒温震荡水浴即可实现牙签固相微萃取头的大批量吸附、清洗、解吸的半自动化处理，极大的提高了处理效率。
附图说明
37.图1为采用gb/t21311
‑
2007中方法测定的0.5μg/kg鸡肉添加回收amoz色谱图；
38.图2为本发明实施例提供的0.5μg/kg鸡肉添加回收amoz色谱图；
39.图3为采用gb/t21311
‑
2007中方法测定的0.5μg/kg鸡肉添加回收aoz色谱图；
40.图4为本发明实施例提供的0.5μg/kg鸡肉添加回收aoz色谱图；
41.图5为采用gb/t21311
‑
2007中方法测定的0.5μg/kg鸡肉添加回收ahd色谱图；
42.图6为本发明实施例提供的0.5μg/kg鸡肉添加回收ahd色谱图；
43.图7为采用gb/t21311
‑
2007中方法测定的0.5μg/kg鸡肉添加回收sem色谱图；
44.图8为本发明实施例提供的0.5μg/kg鸡肉添加回收sem色谱图；
45.图9为本发明研制的牙签固相萃取头的重复利用情况。
具体实施方式
46.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
47.本发明涉及的四种硝基呋喃代谢物的名称及缩写见表1：
48.表1.四种硝基呋喃代谢物的名称及缩写
[0049][0050][0051]
实施例1牙签固相微萃取头的制备方法
[0052]
1、将7g聚丙烯腈pan粉末溶解在100ml二甲基甲酰胺(dmf)中，室温下不断搅拌确保均匀溶解。
[0053]
2、oasis hlb颗粒(30μm)是使用球磨机在240rpm下研磨2小时而成。
[0054]
3、1g hlb与10ml pan溶液混合获得最终的pan
‑
hlb浆料。然后在振荡器上以1800转/分钟的转速震荡混匀12小时，以提供足够均匀的颗粒混合物。
[0055]
4、用牙签蘸取pan
‑
hlb浆料，长度约1厘米，使其均匀涂布于牙签上，稍微干燥后再蘸取涂布一次，
[0056]
5、将牙签在溶剂溶液中以1500转/分钟的速度震荡清洗两次(甲醇，异丙醇和乙腈(meoh/ipa/acn，50:25:25)，共15分钟，以去除残留。
[0057]
6、将牙签固相微萃取头泡在甲醇/水混合物中预处理(meoh/h2o，50:50)，激活牙签上的hlb，晾干后备用。
[0058]
实施例2牙签固相微萃取头的吸附效果研究
[0059]
1、衍生一定浓度的硝基呋喃代谢物标准品，具体为：
[0060]
取200μl浓度为0.1μg/ml的4种硝基呋喃代谢物工作液，分别加入17ml 0.125mol/l盐酸溶液和1.0ml 2
‑
硝基苯甲醛，置于37℃恒温振荡器衍生反应16h，加入1ml磷酸氢二钾溶液，用1mol/l氢氧化钠溶液和0.1mol/l的盐酸水溶液调节ph7.2至7.4之间，备用。
[0061]
2、将衍生好的标准品平均分为两份，一份用乙酸乙酯反提取，氮吹，定容后上机检测，计算其中衍生物质量w0；另一份用制备好的牙签固相微萃取头震荡萃取吸附3分钟，取出萃取头后，剩余液用乙酸乙酯反提取，氮吹，定容后上机检测，计算其中衍生物质量w1。计算吸附率k，公式为k＝(w0‑
w1)/w0×
100％
[0062]
吸附效果研究表明，本发明制备的牙签固相微萃取头对四种硝基呋喃代谢物衍生物的吸附率分别为：amoz(85％)，aoz(88％)，ahd(83％)，sem(89％)。
[0063]
实施例3牙签固相微萃取头的重复利用研究
[0064]
1、将处理完样品加标的牙签固相微萃取头在乙酸乙酯中解吸3次，氮吹，定容后上机检测，研究牙签固相微萃取头的解吸和残留情况。
[0065]
结果表明，本发明制备的牙签固相萃取头，解吸一次时的解吸率为99％，解吸两次时解析率达到100％，通过两次乙酸乙酯洗脱，可将该萃取头吸附的目标物全部解吸下来，最终无残留。
[0066]
2、将上述处理完的牙签固相微萃取头再次进行样品加标试验，计算回收率。
[0067]
为了评估牙签固相萃取头的可重复使用性，通过分析加有40μl nfs标准(浓度为0.1μg/ml)的猪肉，进行了5个周期的吸附实验。每个周期都进行了三次。5个周期对目标分子的结合能力如图9所示。在5个循环期间，每个循环都伴随着色谱信号峰的减少，这归因于由于结合点的丧失而导致的吸附能力下降。5个周期后，该spme固相萃取头对2
‑
np
‑
ahd、2
‑
np
‑
aoz和2
‑
np
‑
amoz的吸附能力保持80％以上，对2
‑
np
‑
sem的吸附能力达到了50％以上。基于这些结果牙签固相萃取头表现出良好的再生性能，可以多次循环使用。
[0068]
实施例4固相微萃取头简单快速检测鸡肉中硝基呋喃类代谢物残留量的方法
[0069]
1、提取步骤
[0070]
称取3g鸡肉的均质试样(精确到0.01g)于50ml聚丙烯离心管中，加入0.1μg/ml的内标工作溶液30μl，分别加入17ml0.125mol/l盐酸溶液和1.0ml衍生剂，均质1min，置于37℃恒温振荡器中保持16h。10000r/min离心10min，取上清10ml，加入1ml磷酸氢二钾溶液，用1mol/l氢氧化钠溶液和0.1mol/l的盐酸水溶液调节ph7.0。加入5ml正己烷，涡混2min除油，10000r/min离心10min，弃去正己烷层(针对脂肪含量高的样品基质)，得到硝基呋喃代谢物衍生液。
[0071]
2、净化步骤
[0072]
将制备好的固相微萃取头放入调节好ph(7.2～7.4)的硝基呋喃代谢物衍生液中，置于37℃恒温振荡器中1800转/分钟的转速震荡萃取半小时，取出牙签固相微萃取头放入含有5ml水的离心管中，置于37℃恒温振荡器中1800转/分钟的转速震荡清洗5分钟，取出牙签固相微萃取头放入含有5ml乙酸乙酯的离心管中，置于37℃恒温振荡器中1800转/分钟的转速震荡解吸半小时，50℃，氮气吹干，用流动相定容至0.5ml，通过0.2μm滤膜过滤至样品瓶中，供液相色谱质谱测定。
[0073]
3、色谱测定条件
[0074]
色谱柱：zorbaxeclipseplusc18(1.8μm，2.1
ⅹ
50mm)；柱温：40℃，流速：0.3ml/min，进样量：10μl；流动相：a10mm乙酸铵 0.1％甲酸水，b甲醇，梯度洗脱程序：0
→
3.0min，由10％b
→
90％b；3.0
→
5.0min，90％b；5.0
→
6.5min，由90％b
→
10％b，平衡1min。
[0075]
4、质谱条件
[0076]
电离方式：esi ；扫描方式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压：5500v；雾化气压力(gs1)：55psi；气帘气压力(cur)：35psi；辅助气压力(gs2)：50psi。
[0077]
表2.硝基呋喃代谢物及内标的质谱参数
[0078]
[0079][0080]
*：定量离子。
[0081]
5、方法学验证
[0082]
以待测化合物和内标(如表2所示)的峰面积比值为纵坐标、待测化合物的标示浓度为横坐标进行线性回归分析，得到线性回归方程、相关系数、线性范围，如表3所示，各化合物的线性关系良好，相关系数r值均大于0.997。
[0083]
表3.硝基呋喃代谢物的线性范围、线性方程及相关系数
[0084][0085]
用鸡肉作为基质添加不同量(添加浓度为0.5μg/kg、2.5μg/kg、10μg/kg)的硝基呋喃代谢物标准品后按“1、2”所述方法处理后测定，定量限根据10倍信噪比计算得出，结果见表4。
[0086]
表4.定量限、回收率和精密度
[0087][0088]
图1
‑
图8示出了鸡肉添加0.5μg/kg amoz、aoz、ahd和sem后分别采用gb/t 21311
‑
2007方法和本发明研制的方法进行前处理得到的色谱图，其结果具体为：使用本发明方法得到的四种硝基呋喃代谢物的色谱峰均没有明显的干扰物，特别值得注意的是，采用国标方法进行ahd检测时，目标峰附近有一明显的干扰峰，但采用本发明研制的方法得到的ahd色谱图上，该杂质峰被去除，足见本发明研制的固相萃取头对ahd的高选择性以及对杂质干扰的高效去除。另外，对于aoz的检测有类似的结果，虽目标物附近的干扰峰未被去除，但杂质含量明显降低。
[0089]
以上研究可以看出，尽管固相微萃取只是吸附了大部分目标物，部分的目标物还残存在溶液中，但从定量限附近目标物的响应值看，按照本发明研制的方法进行前处理已可达到或者优于按照国标gb/t 21311
‑
2007得到的结果，且定量限均远远低于欧盟、日本等
国家规定的要求。这主要是得益于研制的牙签固相微萃取对目标物高效的吸附和解吸能力(直接提高了目标物的响应值)，以及杂质的优异的去除能力，从而降低了基质效应的影响(间接提高了目标物的响应值)，尤其是aoz按照国标gb/t21311
‑
2007前处理的响应值大约是5000cps，利用本发明研制的方法进行前处理响应值可以到15000cps，并且目标物附近的杂质峰也达到降低，本发明研制的方法将aoz的定量限提高了3到4倍。