一种抗精神病个体化用药相关基因分型检测的复合扩增体系及试剂盒的制作方法

1.本发明属于临床分子检测技术领域，具体涉及一种多重荧光等位基因特异性pcr结合毛细管电泳的扩增检测技术。


背景技术：

2.据世界卫生组织和世界银行在全球范围内进行的疾病负担研究显示，神经精神障碍的疾病负担占疾病总负担的10.4％，而精神障碍占总负担的7.4％。2019年，《柳叶刀
·
精神病学》发表了北京大学医学部公布的“中国精神卫生调查”第一批主要结果，该研究是中国首次全国性精神障碍流行病学调查，针对全国31个省3.2万多人的调查，结果显示在心境障碍、焦虑障碍、精神分裂症等七类精神障碍中，焦虑障碍患病率最高，为4.98％。
3.目前，药物治疗是精神疾病的主要临床手段，据统计在fda批准的药品说明中，被推荐进行药物基因组学生物标记物的检测的前三位的分别是抗肿瘤药物、精神类药物和心血管类药物。而且大量的研究及临床数据也都显示了精神科开展个体化药学的紧要性和必要性。因此，随着药物基因组学研究的深入，抗精神病药物相关的基因多态性、体内代谢酶、受体转运体的突变，可能是影响治疗个体差异的重要因素，而利用基因检测指导精神类药物的临床治疗将成为一种新的手段。
4.精神类药物主要是通过作用神经递质类受体或者相关转运体发挥药效，多数精神类药物的作用靶位点都位于脑内，其中包括五羟色胺受体、多巴胺受体、谷氨酸受体、五羟色胺转运体等。而随着药物基因组学研究的深入，以及对药物在体内的吸收、分布、代谢及清除过程相关酶的基因多态性(如：细胞色素酶p450超家族、abc转运体家族等)和药物作用机制相关蛋白(如：靶蛋白多巴胺受体、五羟色胺受体、五羟色胺转运体的基因多态性等)的关系研究，抗精神病药物相关的基因多态性、体内代谢酶、受体转运体的突变，可能是影响治疗个体差异的重要因素。
5.目前，用于检测基因多态性的方法很多，近年来市场上建立了许多新的snp分型方法和技术，如变性高压液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromatography,dhplc),引物延伸结合飞行时间质谱分析(matrix
‑
assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,maldi
‑
tof ms)，动态等位基因特异性杂交(dynamic allele specific hybridization)和基因芯片法、taqman探针技术、焦磷酸测序技术等。它们的灵敏度及通量都比之前的方法大大提高，使其在法医检测中得到越来越广泛的应用。这些技术虽然能完成对snp的检测，但应用上也有些不足。有些检测过程繁琐，需要限制性内切酶消化；有些需两步pcr扩增反应：有些新技术虽具有通量高、易于自动化等优点，但要求成本昂贵的仪器设备；还有些技术重复性差、结果不易判读、检测位点少、检测通量低、检测周期长、检测费用高等。
6.相对于上述这些基因多态性技术的局限性，因此，建立了一种多重荧光pcr结合毛细管电泳平台的基因分型扩增检测技术，该平台不仅结合了以上技术的多种优势，并且还
有操作简单、成本低、通量高、周期短、特异性好、灵敏度高、易于判型等特点。有鉴于此，提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的是寻求一种与抗精神疾病个性化用药相关基因多态性检测的复合扩增体系及其使用方法。该体系应具有操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的检测特点。为实现上述目的，本发明具体提出如下技术方案：
8.本发明首先提供一种抗精神疾病个性化用药相关基因分型复合扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包含扩增13个snp位点的引物组合，所述snp位点包括：
9.ankk1基因2137g>a位点；
10.cyp1a2基因5732c>a位点；
11.drd2基因4651a>g位点；
12.htr2c基因324497c>g位点；
13.mc4r基因57882787c>a位点；
14.cyp2d6*2 rs1135840基因1457g>c位点；
15.cyp2d6*2 rs16947基因886c>t位点；
16.cyp2d6*3基因775dela位点；
17.cyp2d6*4基因506
‑
1g>a位点；
18.cyp2d6*6基因454delt位点；
19.cyp2d6*10基因100c>t位点；
20.cyp2d6*14基因1758g>a位点；
21.cyp2d6*35基因
‑
1584c>g位点。
22.进一步的，所述引物序列如seq id no.1
‑
39所示，具体如下：
23.ankk1基因2137g>a位点：
24.正向野生型引物：
25.正向突变型引物：
26.反向共用引物：5
’‑
tgccctctaggaaggacatgatg
‑3’
(seq id no.3)；
27.cyp1a2基因5732c>a位点：
28.正向野生型引物：5
’‑
ctccatctaccatgcgtcctag
‑3’
(seq id no.4)，
29.正向突变型引物：
30.反向共用引物：5
’‑
ggactctttggtacaatacccagcatg
‑3’
(seq id no.6)；
31.drd2基因4651a>g位点：
32.正向野生型引物：
33.正向突变型引物：
34.反向共用引物：5
’‑
cggacctcttccaacacctcctct
‑3’
(seq id no.9)；
35.htr2c基因324497c>g位点：
36.正向野生型引物：
37.正向突变型引物：
38.反向共用引物：5
’‑
ggctagagactcaatctggggaatttg
‑3’
(seq id no.12)；
39.mc4r基因57882787c>a位点：
40.正向野生型引物：
41.正向突变型引物：
42.反向共用引物：5
’‑
aggatgtatgagctctaccctgtggt
‑3’
(seq id no.15)；
43.cyp2d6*2(rs1135840)基因1457g>c位点：
44.正向野生型引物：
45.正向突变型引物：
46.反向共用引物：5
’‑
cgtacccctgtctcaaatgcggcca
‑3’
(seq id no.18)；
47.cyp2d6*2(rs16947)基因886c>t位点：
48.正向野生型引物：
49.正向突变型引物：
50.反向共用引物：5
’‑
cctgcactgtttcccagatgggct
‑3’
(seq id no.21)；
51.cyp2d6*3基因775dela位点：
52.正向野生型引物：
53.正向突变型引物：
54.反向共用引物：5
’‑
ctctgggcaaggagagagggtggag
‑3’
(seq id no.24)；
55.cyp2d6*4基因506
‑
1g>a位点：
56.正向野生型引物：
57.正向突变型引物：5
’‑
ccccttacccgcatctcccacccctaa
‑3’
(seq id no.26)，
58.反向共用引物：5
’‑
tatgcaaatcctgctcttccgaggccc
‑3’
(seq id no.27)；
59.cyp2d6*6基因454delt位点：
60.正向野生型引物：
61.正向突变型引物：
62.反向共用引物：5
’‑
gggtggtggatggtggggcta
‑3’
(seq id no.30)；
63.cyp2d6*10基因100c>t位点：
64.正向野生型引物：5
’‑
ggcagtggcagggggcctggtcg
‑3’
(seq id no.31)，
65.正向突变型引物：
66.反向共用引物：5
’‑
cccaatgggcagtgaggcagccat
‑3’
(seq id no.33)；
67.cyp2d6*14基因1758g>a位点：
68.正向野生型引物：
69.正向突变型引物：
70.反向共用引物：5
’‑
gggtggtggatggtggggcta
‑3’
(seq id no.36)；
71.cyp2d6*35基因
‑
1584c>g位点：
72.正向野生型引物：
73.正向突变型引物：正向突变型引物：
74.反向共用引物：5
’‑
gtccagagctcggcagctgccctccca
‑3’
(seq id no.39)。
75.进一步的，在上述扩增体系中还包括如下引物：
76.针对性别内参位点：
77.正向引物：5
’‑
ccctgggctctgtaaagaatag
‑3’
(seq id no.40)，
78.反向引物：5
’‑
atcagagcttaaactgggaagctg
‑3’
(seq id no.41)；
79.针对内参基因位点1：
80.正向引物：5
’‑
gtggtgtcccagataatctgtac
‑3’
(seq id no.42)，
81.反向引物：5
’‑
ggtgaataactccaaatactcc
‑3’
(seq id no.43)；
82.针对内参基因位点2：
83.正向引物：5
’‑
aggctctagcagcagctcatg
‑3’
(seq id no.44)，
84.反向引物：5
’‑
ctggaaatgacactgctacaactc
‑3’
(seq id no.45)。
85.进一步的，上述体系为多重荧光等位基因特异性pcr体系。
86.进一步的，上述引物上添加有修饰或以修饰碱基取代正常碱基，所述修饰为荧光集团修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰。
87.进一步的，所述13个snp位点和3个对照基因位点分别由两种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，两组分别为：第一组mc4r基因g.57882787c>a位点、cyp2d6*2基因c.886c>t位点、cyp2d6*35基因c.
‑
1584c>g位点、cyp1a2基因g.5732c>a位点、cyp2d6*4基因c.506
‑
1g>a位点、htr2c基因g.324497c>g位点、d5s818位点；第二组amel位点、ankk1基因c.2137g>a位点、cyp2d6*10基因c.100c>t位点、drd2基因g.4651a>g位点、cyp2d6*6基因c.454delt位点、cyp2d6*14基因c.505g>a位点、cyp2d6*2基因c.1457g>c位点、cyp2d6*3基因c.775dela位点、th01位点。
88.进一步的，所述13个snp位点和3个人基因组内参基因分别由两种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组(如表1)。
89.表1 检测位点列表
90.[0091][0092]
注：其中所述两组位点从上往下的顺序均为实际检测结果图中从小到大的片段排列顺序。
[0093]
进一步的，所述第一组为fam荧光标记，第二组为hex荧光标记。
[0094]
进一步的，所述13个snp位点的荧光标记位于共用引物的5’端，所述内参基因的荧光标记位于正向引物的5’端。
[0095]
进一步的，上述体系中，正向野生型引物：正相突变型引物：反向共用引物＝1：1：1.5比例混合；内参正向引物：反向引物＝1：1比例混合。
[0096]
进一步的，所述检测采用毛细管电泳检测，所述扩增采用多重荧光等位基因特异性pcr扩增。
[0097]
本发明还提供一种抗精神病个性化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括上述任一所述的扩增体系。
[0098]
进一步的，所述试剂盒还包含以下成分：热启动dna taq酶、udg酶和2
×
pcr扩增缓冲液、质控品和内标rox500等。
[0099]
本发明所述检测试剂盒，采用的是多重等位基因特异性pcr(allele
‑
specific pcr，aspcr)结合定量荧光pcr(quantitive fluorescent pcr，qf
‑
pcr)的方法对目的位点进行扩增，通过毛细管电泳进行扩增产物的检测，完成对目的位点分型的检测。对于每个检测位点设置三条引物，对两种分型分别设置一条不同长度的特异引物，以及一条荧光标记的下游引物。每条特异引物只能与对应基因型的dna模板结合并进行扩增。完成pcr扩增和毛细管电泳检测后，通过特定荧光标记、特定长度的扩增产物的有无即可判定样本特定位点是否存在特定基因型。
[0100]
本发明还提供上述复合扩增体系在制备抗精神病个性化用药相关基因多态性检测试剂盒中的用途。
[0101]
本发明还提供一种抗精神病个性化用药相关基因多态性检测的方法，其特征在于，包括利用上述的复合扩增体系对样本进行扩增的步骤；具体包括以下步骤：pcr扩增、遗传分析仪检测扩增产物、数据分析、检测结果的判断等。
[0102]
本发明基于abi一代测序平台进行产物的检测，具有检测灵敏度高、检测分辨率高、通量高、简单易于操作、便于自动化以及有专业的软件对结果进行判读等特点；同时，本发明本身还具有其它众多特点：涵盖位点较为全面，包括了13个与抗精神病个性化用药相关的snp位点，加入了性别确定以及样本的识别、防止污染的内参位点，并且，体系本身还加入了udg
‑
dutp防污染措施；此外，该发明试剂盒支持血液和血卡的直扩，无需任何处理，免除了提取dna的步骤。
[0103]
与现有技术相比，本发明的优势至少有如下：
[0104]
本发明的检测技术方法相对于市面上的其它检测方法极大降低了操作强度，可实
现3小时内出结果，并且大大降低了成本，涵盖检测的众多位点，为临床医生提供了更多的患者基因信息，为精神病患者提供更完善的个性化用药参考，使患者受益。
[0105]
1)本发明涵盖位点全面，包括13个与抗精神病个性化用药相关的snp位点，并且通过位点、引物以及体系的多重优化，实现多snp位点的同一体系特异性检测，同时本发明具有极高检测限和灵敏度，能够在dna量不足的情况下，完成样本的检测，且对检测结果没有影响；
[0106]
2)本发明体系结合abi一代测序平台进行产物检测，具有检测灵敏度高、分辨率高、通量高、简单易于操作、便于自动化以及有专业的软件对结果进行判读等特点；
[0107]
3)本发明还加入性别确定以及样本的识别、防止污染的内参位点，并且，体系本身还加入了udg
‑
dutp防污染措施；
[0108]
4)本发明的通过优化确立的检测体系或试剂盒能够支持血液和血卡的直扩，无需任何处理，免除了提取dna的步骤；
[0109]
5)本发明的检测技术方法相对于市面上的其它检测方法极大降低了操作强度，可实现3小时内出结果，并且大大降低了成本，涵盖检测的众多位点，为临床医生提供了更多的患者基因信息，为抑郁症患者提供更完善的个性化用药参考，使患者受益，目前已经产业化推广应用。
附图说明
[0110]
图1 rs1065852位点引物组合的筛选和鉴定(左边是片段分析结果，右边是相应的测序结果)
[0111]
图2部分位点引物组合的筛选结果(上：组合1；中：组合2；下：组合3)；
[0112]
图3检测体系分别以0.5ng(上1)、1.0ng(中2)、2.0ng(中3)和5.0ng(下4)为模板扩增检测结果；
[0113]
图4试剂盒扩增临床样本，并进行毛细管电泳检测的结果图。
具体实施方式
[0114]
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0115]
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
[0116]
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
[0117]
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
[0118]
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，
包括该名词的复数形式。
[0119]
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
[0120]
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
[0121]
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链dna的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链dna的单链核酸。
[0122]
下面结合实施例对本发明做进一步的较为完整、详细的描述。
[0123]
实施例1：抗精神病类个性化用药相关基因位点的筛选确定
[0124]
本发明中用于检测抗抑郁个性化用药基因的检测体系及试剂盒的一种实施例，该体系及试剂盒能同时检测13个基因多态性位点。
[0125]
综合根据国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》专家指南、cpic、诊疗指南、fda药物说明书以及pharmgkb数据库中临床的证据等级进行的影响抗精神病用药药效的作用靶点的筛选。
[0126]
本实施例初筛了8种抗精神病药分别为：氯丙嗪、氟哌啶醇、奥氮平、氯氮平、硫利达嗪、喹硫平、利培酮、阿立哌唑、氨磺必利、齐拉西酮。这些药物的作用靶点包括如下：
[0127]
再根据所述基因靶点，确定的检测位点以及根据pharmgkb确定的相关性等级情况如下表：
[0128]
[0129][0130]
进一步，综合各位点基因序列的特点，体系中位点的大小排布以及体系优化的难度情况，最终选择的作用靶点基因如下：ankk1、mc4r、cyp2d6、cyp1a2、htr2c、drd2。
[0131]
根据作用靶点基因最终确定的snp位点信息如下：
[0132][0133]
实施例2：一种抗精神病个性化用药相关基因位点检测体系检测性能的测试
[0134]
本实施例针对选择的抗精神病个性化用药相关基因位点进行引物的初步设计，根据等位基因特异性pcr原理，每条特异引物只能与对应基因型的dna模板结合并进行扩增，初步设计引物序列如下：
[0135]
ankk1基因2137g>a位点：
[0136]
正向野生型引物：5
’‑
agccatcctcaaagtgctggtcg
‑3’
，
[0137]
正向突变型引物：5
’‑
acacagccatcctcaaagtgctggtca
‑3’
，
[0138]
反向共用引物：5
’‑
tgccctctaggaaggacatgatg
‑3’
；
[0139]
cyp1a2基因5732c>a位点：
[0140]
正向野生型引物：5
’‑
ctccatctaccatgcgtcctgg
‑3’
，
[0141]
正向突变型引物：5
’‑
taagctccatctaccatgcgtcctgt
‑3’
，
[0142]
反向共用引物：5
’‑
ggactctttggtacaatacccagcatg
‑3’
；
[0143]
drd2基因4651a>g位点：
[0144]
正向野生型引物：5
’‑
cgctcccacccacacccagagtaat
‑3’
，
[0145]
正向突变型引物：5
’‑
actgcgctcccacccacacccagagtaac
‑3’
，
[0146]
反向共用引物：5
’‑
cggacctcttccaacacctcctct
‑3’
；
[0147]
htr2c基因324497c>g位点：
[0148]
正向野生型引物：5
’‑
ttatctacagtgactttgctaccctc
‑3’
，
[0149]
正向突变型引物：5
’‑
cagcttatctacagtgactttgctaccctg
‑3’
，
[0150]
反向共用引物：5
’‑
ggctagagactcaatctggggaatttg
‑3’
；
[0151]
mc4r基因57882787c>a位点：
[0152]
正向野生型引物：5
’‑
ttaattctgttgtcattagttccc
‑3’
，
[0153]
正向突变型引物：5
’‑
tgtcttaattctgttgtcattagttcca
‑3’
，
[0154]
反向共用引物：5
’‑
aggatgtatgagctctaccctgtggt
‑3’
；
[0155]
cyp2d6*2(rs1135840)基因1457g>c位点：
[0156]
正向野生型引物：5
’‑
tggtgtctttgctttcctggtgag
‑3’
，
[0157]
正向突变型引物：5
’‑
accatggtgtctttgctttcctggtgac
‑3’
，
[0158]
反向共用引物：5
’‑
cgtacccctgtctcaaatgcggcca
‑3’
；
[0159]
cyp2d6*2(rs16947)基因886c>t位点：
[0160]
正向野生型引物：5
’‑
agcagcttcaatgatgagaacctgc
‑3’
[0161]
正向突变型引物：5
’‑
tgagagcagcttcaatgatgagaacctgt
‑3’
[0162]
反向共用引物：5
’‑
cctgcactgtttcccagatgggct
‑3’
[0163]
cyp2d6*3基因775dela位点：
[0164]
正向野生型引物：5
’‑
gctgggctgggtcccaggtcatcctg
‑3’
[0165]
正向突变型引物：5
’‑
gggggctgggctgggtcccaggtcatcc g
‑3’
[0166]
反向共用引物：5
’‑
ctctgggcaaggagagagggtggag
‑3’
[0167]
cyp2d6*4基因506
‑
1g>a位点：
[0168]
正向野生型引物：5
’‑
ttacccgcatctcccacccccag
‑3’
[0169]
正向突变型引物：5
’‑
ccccttacccgcatctcccacccccaa
‑3’
[0170]
反向共用引物：5
’‑
tatgcaaatcctgctcttccgaggccc
‑3’
[0171]
cyp2d6*6基因454delt位点：
[0172]
正向野生型引物：5
’‑
ggcggcctcctcggtcacccac
‑3’
[0173]
正向突变型引物：5
’‑
ggcaggcggcctcctcggtcacccc
‑3’
[0174]
反向共用引物：5
’‑
gggtggtggatggtggggcta
‑3’
[0175]
cyp2d6*10基因100c>t位点：
[0176]
正向野生型引物：5
’‑
ggcagtggcagggggcctggtgg
‑3’
[0177]
正向突变型引物：5
’‑
cccgggcagtggcagggggcctggtga
‑3’
[0178]
反向共用引物：5
’‑
cccaatgggcagtgaggcagccat
‑3’
[0179]
cyp2d6*14基因1758g>a位点：
[0180]
正向野生型引物：5
’‑
tgcccttctgcccatcacccacc
‑3’
[0181]
正向突变型引物：5
’‑
tttgtgcccttctgcccatcacccact
‑3’
[0182]
反向共用引物：5
’‑
gggtggtggatggtggggcta
‑3’
[0183]
cyp2d6*35基因
‑
1584c>g位点：
[0184]
正向野生型引物：5
’‑
cccagctaattttgtattttttgtagagaccg
‑3’
[0185]
正向突变型引物：5
’‑
caatcccagctaattttgtattttttgtagagaccc
‑3’
[0186]
反向共用引物：5
’‑
aagtccagagctcggcagctg
‑3’
[0187]
为避免引物间相互扩增、协调扩增效率、改进产物峰型、便于毛细管电泳检测，本发明进一步对所有引物进行一系列特定的碱基调整或修饰。
[0188]
示例性的：
[0189]
以rs1065852位点引物筛选为例，该位点引物分别对野生型引物和突变型引物进行了5’端和3’端引入了不同强度的错配，具体筛选和鉴定结果如图1，(rs1065852位点的三条引物等比例混合，分别以金标准确定的野生、杂合、突变样本为模板进行扩增检测，结果显示正确，且无杂峰)。
[0190]
另，以体系构建过程中的部分位点引物组合的筛选为例，说明体系引物组合的优化筛选情况，由于所有位点筛选过程中引物组合和最终引物组合存在一定差异(差异包括错配、位置、修饰等，且不限于所述修饰)，在此，只体现部分组合(均不含mc4r、cyp1a2、drd2和htr2c四个基因位点引物)的扩增结果，以此体现筛选引物组合的过程，如图2，结果统计如下表：
[0191]
[0192][0193]
根据图1和上表统计结果显示，组合1、组合2效果均不佳，除上述描述的效果外，组合1整体存在有杂峰的情况，而引物组合3整体效果最佳，故后续实验将在引物组合3的基础上继续添加位点引物，并进行筛选实验。
[0194]
综上，在经过各位点引物的单独筛选以及各位点引物的组合筛选优化后，确定了本实施例所采用的经过改进优化的最终引物序列如下：
[0195]
ankk1基因2137g>a位点：
[0196]
正向野生型引物：
[0197]
正向突变型引物：
[0198]
反向共用引物：5
’‑
hex
‑
tgccctctaggaaggacatgatg
‑3’
(seq id no.3)；
[0199]
cyp1a2基因5732c>a位点：
[0200]
正向野生型引物：5
’‑
ctccatctaccatgcgtcctag
‑3’
(seq id no.4)，
[0201]
正向突变型引物：
[0202]
反向共用引物：5
’‑
ggactctttggtacaatacccagcatg
‑3’
(seq id no.6)；
[0203]
drd2基因4651a>g位点：
[0204]
正向野生型引物：
[0205]
正向突变型引物：
[0206]
反向共用引物：5
’‑
cggacctcttccaacacctcctct
‑3’
(seq id no.9)；
[0207]
htr2c基因324497c>g位点：
[0208]
正向野生型引物：
[0209]
正向突变型引物：
[0210]
反向共用引物：5
’‑
ggctagagactcaatctggggaatttg
‑3’
(seq id no.12)；
[0211]
mc4r基因57882787c>a位点：
[0212]
正向野生型引物：
[0213]
正向突变型引物：
[0214]
反向共用引物：5
’‑
aggatgtatgagctctaccctgtggt
‑3’
(seq id no.15)；
[0215]
cyp2d6*2(rs1135840)基因1457g>c位点：
[0216]
正向野生型引物：
[0217]
正向突变型引物：
[0218]
反向共用引物：5
’‑
cgtacccctgtctcaaatgcggcca
‑3’
(seq id no.18)；
[0219]
cyp2d6*2(rs16947)基因886c>t位点：
[0220]
正向野生型引物：
[0221]
正向突变型引物：
[0222]
反向共用引物：5
’‑
cctgcactgtttcccagatgggct
‑3’
(seq id no.21)；
[0223]
cyp2d6*3基因775dela位点：
[0224]
正向野生型引物：
[0225]
正向突变型引物：
[0226]
反向共用引物：5
’‑
ctctgggcaaggagagagggtggag
‑3’
(seq id no.24)；
[0227]
cyp2d6*4基因506
‑
1g>a位点：
[0228]
正向野生型引物：
[0229]
正向突变型引物：5
’‑
ccccttacccgcatctcccacccctaa
‑3’
(seq id no.26)，
[0230]
反向共用引物：5
’‑
tatgcaaatcctgctcttccgaggccc
‑3’
(seq id no.27)；
[0231]
cyp2d6*6基因454delt位点：
[0232]
正向野生型引物：
[0233]
正向突变型引物：
[0234]
反向共用引物：5
’‑
gggtggtggatggtggggcta
‑3’
(seq id no.30)；
[0235]
cyp2d6*10基因100c>t位点：
[0236]
正向野生型引物：5
’‑
ggcagtggcagggggcctggtcg
‑3’
(seq id no.31)，
[0237]
正向突变型引物：
[0238]
反向共用引物：5
’‑
cccaatgggcagtgaggcagccat
‑3’
(seq id no.33)；
[0239]
cyp2d6*14基因1758g>a位点：
[0240]
正向野生型引物：
[0241]
正向突变型引物：
[0242]
反向共用引物：5
’‑
gggtggtggatggtggggcta
‑3’
(seq id no.36)；
[0243]
cyp2d6*35基因
‑
1584c>g位点：
[0244]
正向野生型引物：
[0245]
正向突变型引物：正向突变型引物：
[0246]
反向共用引物：5
’‑
gtccagagctcggcagctgccctccca
‑3’
(seq id no.39)；
[0247]
性别内参位点：
[0248]
正向引物：5
’‑
ccctgggctctgtaaagaatag
‑3’
(seq id no.40)，
[0249]
反向引物：5
’‑
atcagagcttaaactgggaagctg
‑3’
(seq id no.41)；
[0250]
内参基因位点1：
[0251]
正向引物：5
’‑
gtggtgtcccagataatctgtac
‑3’
(seq id no.42)，
[0252]
反向引物：5
’‑
ggtgaataactccaaatactcc
‑3’
(seq id no.43)；
[0253]
内参基因位点2：
[0254]
正向引物：5
’‑
aggctctagcagcagctcatg
‑3’
(seq id no.44)，
[0255]
反向引物：5
’‑
ctggaaatgacactgctacaactc
‑3’
(seq id no.45)。
[0256]
其中，上述序列中的修饰改动注释如下：
[0257]
1.“－”单下划线代表各引物在引物的3’端
‑
2至
‑
5位改动了1至3个碱基。
[0258]
2.“＝”双下划线代表各引物在引物3’端
‑
15位之后的序列进行了改动，包括末端增加其他序列、改变部分碱基序列。
[0259]
3.所有检测位点共用引物均在5’端进行fam或hex荧光标记。
[0260]
4.对照位点正向引物均在5’端进行fam或hex荧光标记。
[0261]
实施例3：抗精神病个性化用药相关基因位点检测体系检测性能测试
[0262]
本实施例中对体系的最低检出限进行测试，同时检测13个基因多态性位点，并加入了个体化识别的三个位点，同时基于毛细管电泳平台进行判读。具体实验步骤如下：
[0263]
1、准备dna样本
[0264]
用收集的新鲜外周血样本采用天根血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)提取基因组dna，并采用nanodrop2000(thermo)测定dna的浓度及纯度，然后保存基因组dna。
[0265]
对提取的dna进行浓度梯度的稀释，浓度梯度分别为0.5ng/ul、1.0ng/ul、2ng/ul、5ng/ul。
[0266]
2、pcr扩增体系的配制
[0267]
该体系包含引物组合如实施例2确定引物，全部都在生工生物工程(上海)有限公司进行，并且所有引物按照实验过程中摸索的正向野生型引物：正相突变型引物：反向共用引物＝1：1：1.5比例进行混合；内参正向引物：内参反向引物＝1：1比例进行混合，配制成10
×
引物mix。
[0268]
该体系还包含酶、pcr扩增缓冲液，其中pcr扩增缓冲液中包含datp、dttp、dctp、dgtp、dutp，mg
2
等成分，酶包含热启动dna taq酶和udg酶。
[0269]
按照下表各组分进行pcr扩增体系的配制，振荡混匀后，根据样本数量进行分装，每管19ul。
[0270]
组分名称每20ul体系各组分用量(ul)pcr扩增缓冲液1010
×
引物mix2dna聚合酶(含udg酶)0.5模板1水6.5共计20
[0271]
3、加入模板
[0272]
向对应pcr反应管中，加入各浓度梯度的dna样本1ul，同时，设置质控对照(质控：1ul质控品，阴性对照：1ul无核酸纯水)。
[0273]
4、pcr扩增
[0274]
将各反应管放入pcr扩增仪反应槽内，设置反应体系为20ul。
[0275]
按以下反应程序进行pcr扩增：
[0276][0277][0278]
5、扩增产物进行毛细血管电泳检测
[0279]
配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液：(0.5μl分子量内标 8.5μl甲酰胺)
×
检测样品数，涡旋振荡混匀10
‑
15秒；用移液器给每个检测孔分装9μl的甲酰胺和内标混合物；取1ul扩增产物加入甲酰胺和内标混合物里，盖上封板胶盖。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。
[0280]
6、数据分析
[0281]
向genemapper软件中导入相关文件，输入检测仪下机的原始数据(.fsa文件)，分析数据。
[0282]
结果见下表总结：
[0283][0284]
根据上表统计检测结果显示，该体系以四个浓度梯度dna为模板时均能够扩增检
测出各目的位点的基因型，且结果一致，但是该体系在以0.5ngdna为模板时，整体效率低，结果经过重复检测，为保证样本的检出率，最终将该体系的最低检出限定为1ng(见图3)。
[0285]
可见，该体系的灵敏度极好，可以在dna量不足的情况下，完成样本的检测，且对检测结果没有影响，该效果超出实验预期。
[0286]
实施例4：临床血液样本的直接扩增以及与测序结果的对比
[0287]
本实施例采用本发明体系制备成试剂盒，对血液样本直接进行扩增检测，具体以1例抗凝血临床样本的为例进行扩增检测，同时，使用测序的方法对该试剂盒的扩增检测结果进行验证，进而正式本发明引物体系及试剂盒的有效性、特异性及准确性。
[0288]
一、检测体系
[0289]
本发明的试剂盒包含pcr master mix、质控品、内标。其中pcr master mix主要组分包含热启动dna taq酶、udg酶、扩增缓冲液、实施例2中确定比例的各位点扩增引物等。
[0290]
二、检测方法
[0291]
步骤1：pcr扩增反应
[0292]
1)pcr预混溶液分装(在试剂准备区完成)
[0293]
振荡混匀pcr预混溶液(pcr master mix)，预计进行3个检测数，每个pcr反应管分装19ul。
[0294]
2)加入模板(在标本制备区完成)
[0295]
向对应pcr反应管中，加入待检测血液样本1ul，同时，设置质控对照(质控：1ul质控品，阴性对照：1ul无核酸纯水)。
[0296]
3)pcr扩增(在扩增区完成)
[0297]
将各反应管放入pcr扩增仪反应槽内，设置反应体系为20μl。
[0298]
按实施例3的反应程序条件设置pcr仪，并进行pcr扩增。
[0299]
步骤2和3：扩增产物的检测和数据的分析
[0300]
按照实施例3的第5和6进行操作。
[0301]
步骤4：检测结果的判定
[0302]
如图所示，图4为临床样本的扩增检测结果图，其中图中野生型snp标识为“wt”，突变型则标识为“mu”。amel位点男性样本显示为“xy”，女性样本则显示为“x”。
[0303]
三、sanger法测序：
[0304]
根据最终确定的snp位点信息，查找各位点的基因序列，在相应的snp位点的上下游各至少100bp以上区域进行测序引物的设计(由生工生物工程(上海)有限公司进行合成)。使用设计好的各位点的测序引物，进行目标样本各位点所在片段的扩增，经电泳检测，确定有无扩增产物及目的片段大小正确后，送生工生物工程(上海)有限公司进行sanger法测序。
[0305]
四、ce结果与测序结果的对比
[0306]
根据毛细管电泳检测图，分析得到临床样本通过试剂盒扩增检测的结果分型。对测序公司测序得到的数据进行分析，得到临床样本各位点测序的结果分型。
[0307]
各位点分型对比结果如下表：
[0308]
表3 样本检测结果
[0309][0310]
由此可分别获得临床血液样本6个基因13个多态性位点的试剂盒检测结果分型以及测序结果分型，同时，检测结果显示所述试剂盒对临床血液样本进行检测的结果与扩增测序的结果一致。因此，该试剂盒的检测结果与金标准对比是可靠的，根据所检测的基因分型及其对应的临床参考信息对病人使用到的药物进行个性化用药
[0311]
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。