缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统及其制备方法与流程

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统及其制备方法。


背景技术：

2.脑卒中是世界上第二大常见的死亡原因，也是造成非正常肢体功能障碍主要原因。流行病学调查显示，不论在发达国家还是在发展中国家，脑卒中的发病率都在逐年上升。每年约1750万人死于心脑血管疾病及其并发症，高居所有疾病死亡率的首位，其中脑卒中的死亡人数约670万。由于脑卒中的高致死率和致残率，以及治疗恢复过程的长期性和预后的不确定性，罹患此疾病不仅对患者和家庭是灾难性事件，对于医疗机构和社会更是沉重的负担。由于血脑屏障的存在及药物剂型限制，目前临床上尚没有针对缺血性脑卒中病理性改变的特效治疗药物，一般以快速解除病因，即溶栓治疗为主。
3.因此，开发可高效透过血脑屏障并具有靶向性、脑保护性的药物治疗递送载体，对于提高缺血性脑卒中病人的生存率至关重要。
4.纳米颗粒作为新型的药物治疗载体，具有低毒副作用，低给药剂量，同时可克服传统静脉/口服给药剂量大，毒副作用大的缺点，是神经系统疾病治疗的研究热点。目前的研究主要集中在携带化学药物或生物制剂的纳米颗粒如何高效到达脑内并通过血脑屏障。在基础骨架的选取上，主要分为无机金属纳米颗粒和高分子有机纳米颗粒两种。已获fda批准用于颅内胶质母细胞瘤治疗的纳米递药载体为铁纳米为基础的(magforce)，该纳米颗粒临床研究显示对于胶质瘤的治疗具有一定的效果并已通过fda认证，但尚未在临床广泛应用。究其原因可能是在长期使用过程中，金属纳米颗粒不可避免的存在有局部重金属沉积的问题，长期使用有一定的中枢神经系统毒性及局部免疫原性【yarjanli,z.,ghaedi,k.,esmaeili,a.,rahgozar,s.&zarrabi,a.iron oxide nanoparticles may damage to the neural tissue through iron accumulation,oxidative stress,and protein aggregation.bmc neurosci 18,51
‑
51,doi:10.1186/s12868
‑
017
‑
0369
‑
9(2017)】。且由于重金属材料本身理化性状不可更改或难以更改，表面修饰的难度较大，因此影响了金属纳米载药系统的研究进展。高分子有机纳米颗粒具有可降解，容易表面修饰等特点，但在生物性状的均质性、功能稳定性上仍有待改进。
5.缺血性脑卒中患者，缺血区域氧化应激增加，缺血导致的无菌性炎症进一步加剧缺血性脑损伤，导致脑水肿。为了减轻炎症反应，降低损伤脑组织的代谢，在临床前动物实验和临床试验中，发现糖尿病治疗药物格列本脲对脑卒中后的脑损伤具有一定的治疗效果，能明显抑制缺血性脑卒中发生后的脑水肿，有效降低死亡率，但由于格列本脲本身作为一种降糖药物，在脑卒中治疗剂量的静脉全身用药过程中可导致严重低血糖，且半衰期较短，需要持续静脉给药并监测血糖，因此临床应用仍受制于剂量和传统全身给药的副作用【zhou,j.,atsina,k.b.,himes,b.t.,strohbehn,g.w.&saltzman,w.m.novel delivery strategies for glioblastoma.cancer j 18,89
‑
99,doi:10.1097/
ppo.0b013e318244d8ae(2012)】。
6.生理状态下机体自身产生的谷胱甘肽(gsh)对脑血管内皮功能具有保护作用，包括维持内皮细胞正常通透性、降低细胞凋亡和清除活性氧【biswas,s.k.,newby,d.e.,rahman,i.&megson,i.l.depressed glutathione synthesis precedes oxidative stress and atherogenesis in apo
‑
e(
‑
/
‑
)mice.biochem biophys res commun 338,1368
‑
1373,doi:10.1016/j.bbrc.2005.10.098(2005)】。gsh耗竭诱导细胞色素c水平升高，触发凋亡信号通路，导致氧化应激和细胞凋亡。gsh缺乏与多种中枢神经系统疾病有关，如阿尔茨海默病、帕金森病和脑卒中。一些临床研究表明，大脑中gsh水平降低可增加脑卒中风险【namba,k.,takeda,y.,sunami,k.&hirakawa,m.temporal profiles of the levels of endogenous antioxidants after four
‑
vessel occlusion in rats.j neurosurg anesthesiol 13,131
‑
137,doi:10.1097/00008506
‑
200104000
‑
00010(2001)】。gsh作为抗氧化、减轻炎症反应的药物，已在临床上常规应用于低氧血症及肝损害等疾病的的治疗。但由于其难以通过血脑屏障，在脑卒中这一有明显缺血缺氧及氧化应激反应的疾病中尚无应用。已有的报道中，搭载gsh作为功能基团的纳米颗粒均为金属材料(如金，银，铜等)，反复使用可增加重金属沉积毒性及局部免疫炎性反应的风险【pem,b.et al.toxicity and safety study of silver and gold nanoparticles functionalized with cysteine and glutathione.beilstein j nanotechnol 10,1802
‑
1817,doi:10.3762/bjnano.10.175(2019)】，在给药剂量及毒理监测上要求较高。


技术实现要素：

7.本发明旨在解决现有技术中由于血脑屏障的存在及药物剂型限制，目前临床上尚没有针对缺血性脑卒中病理性改变的特效治疗药物，一般以快速解除病因，即溶栓治疗为主的问题。为此，本发明提供一种缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统及其制备方法，合成一种具有良好的生物相容性、可降解、较高的生物膜透过性、可搭载多种化合物的纳米载药系统，使其能透过血脑屏障聚集于高细胞表面趋化受体因子(cxcr4)表达的脑缺血缺氧区，在清除氧自由基的同时，定向释放治疗药物。
8.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
9.提供一种缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统，包括纳米颗粒载体和搭载于所述纳米颗粒载体上的治疗药物；所述纳米颗粒载体由核心纳米骨架通过辅助交联剂的作用链接细胞表面趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂后再与谷胱甘肽(gsh)在常温常压下合成；所述核心纳米骨架采用具有马来酰亚胺(mal)残端和氨基(nh2)残端的核心纳米骨架。
10.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的一种较佳实施例中，所述治疗药物采用格列本脲(glyburide)。
11.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的一种较佳实施例中，所述辅助交联剂采用胱胺双丙烯酰胺(cba)。
12.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的一种较佳实施例中，所述细胞表面趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂采用plerixafor(amd3100)。
13.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的一种较佳实施例中，所述核心纳米骨架由ω
‑
十五内酯(pdl)、n
‑
甲基二乙醇胺(mdea)和3，3
’‑
(4，4
’‑
三甲基二哌
啶
‑
1，1
’‑
二基)二丙酸二乙酯(tddp)、马来酰亚胺聚乙二醇(mal
‑
peg
‑
oh)和氨基聚乙二醇(nh2‑
peg
‑
oh)形成的聚合物。
14.本发明还提供一种用于制备上述实施例中的所述缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
15.步骤s1，合成核心纳米骨架：将ω
‑
十五内酯(pdl)、n
‑
甲基二乙醇胺(mdea)和3，3
’‑
(4，4
’‑
三甲基二哌啶
‑
1，1
’‑
二基)二丙酸二乙酯(tddp)、马来酰亚胺聚乙二醇(mal
‑
peg
‑
oh)和氨基聚乙二醇(nh2‑
peg
‑
oh)按照30:70:67.5:4.9:4.9的比例(feed molar ratio)投入反应器内并加入催化剂反应得到具有马来酰亚胺(mal)残端和氨基(nh2)残端的核心纳米骨架(mal
‑
peg
‑
ppmtp
‑
peg
‑
nh2)；
16.步骤s2，将细胞表面趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂搭载于步骤s1中的核心纳米骨架；
17.步骤s3，将谷胱甘肽(gsh)搭载于步骤s2中的核心纳米骨架得到完整的纳米颗粒载体；
18.步骤s4，将格列本脲与步骤s3中的纳米颗粒载体按1:20mol比的比例合成纳米载药系统，使用10k mwco的thermo snake skin透析膜透析弃去未结合的格列本脲；
19.步骤s5，按步骤s4的方式获得不同合成比例的纳米载药系统备用。
20.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的制备方法的一种较佳实施例中，所述步骤s1中的反应第一阶段：将反应混合物在90℃和1atm压力的氮气反应环境中搅拌20小时；
21.反应第二阶段：在1.8mmhg大气压的真空下继续搅拌70小时；
22.两阶段反应结束后，将终产物加入到正己烷中以沉淀；正己烷洗涤终产物两次后将其溶于氯仿，溶于氯仿的终产物溶液在30℃、真空环境(压力小于1mmhg)过夜，得到纯化的具有马来酰亚胺(mal)残端和氨基(nh2)残端的核心纳米骨架(mal
‑
peg
‑
ppmtp
‑
peg
‑
nh2)。
23.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的制备方法的一种较佳实施例中，所述步骤s1中的所述催化剂采用novozym 435(固定化念珠菌南极脂肪酶b)。
24.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的制备方法的一种较佳实施例中，所述步骤s2具体包括以下步骤：
25.步骤s21，将胱胺双丙烯酰胺(cba)和plerixafor(amd3100)加入到含有甲醇/水混合物(体积比7/3)的玻璃瓶中，在氮气的保护下于37℃的黑暗环境中聚合反应72h；
26.步骤s22，将步骤s21中的反应混合物滴加到含1.25m盐酸的乙醇中，使混合物的酸碱度保持在ph＝3左右，离心，弃上清，收集沉淀，乙醇洗涤两次并真空干燥，得到cba化的amd3100聚合物；
27.步骤s23，将步骤s22中的聚合物溶于水中，透析2天(mwco 3.5kda)纯化，再次冷冻干燥；
28.步骤s24，将步骤s23中的聚合物在常温下使用三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐(tecp)剪切暴露二硫键残基后，加入到溶解有步骤s1中的核心纳米骨架(mal
‑
peg
‑
ppmtp
‑
peg
‑
nh2)的醋酸钠溶液中(ph＝5.2)，常温下搅拌反应2h，得到搭载有amd3100功能基团的核心纳米骨架。
29.在本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统的制备方法的一种较佳
实施例中，所述步骤s3具体包括以下步骤：
30.步骤s31，将步骤s2中的核心纳米骨架在ph＝4.6～6.0的mes缓冲液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)活化；
31.步骤s32，将步骤s31中的溶液用浓缩的磷酸钠缓冲液把ph调到7.2以上，再加入溶有谷胱甘肽(gsh)的0.1m ph＝7.2的磷酸钠缓冲液反应，使谷胱甘肽(gsh)的羧基与步骤s2中的核心纳米骨架的氨基脱水缩合，链接形成完整的纳米颗粒载体。
32.与现有技术相比，本发明提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统及其制备方法的有益效果是：
33.本发明合成的所述纳米载药系统的基础原料均为生物相容性已经得到反复验证的无毒高分子化合物，且合成的纳米颗粒的阳离子化程度极低，表面正电荷仅在1～3mv左右，克服了有些纳米颗粒阳离子化程度高所产生的的神经毒性作用；
34.本发明合成的所述纳米载药系统由于具有peg亲细胞膜基团且体积极小(平均直径约150nm)的特点，因此具有高的血脑屏障通过性及较好的进入细胞内的能力；
35.本发明合成的所述纳米载药系统中，所述马来酰亚胺聚乙二醇(mal
‑
peg
‑
oh)和氨基聚乙二醇(nh2‑
peg
‑
oh)的引入，在聚合物成球后的外表面提供了功能基团如：
‑
mal残基、
‑
nh2和
‑
oh，
‑
mal残基在正常环境下为惰性基团，保证了整个纳米颗粒的稳定性；同时，由于
‑
mal残基具有与胱胺双丙烯酰胺(cba)相结合的特性，因此可以将功能性小分子化合物cba化，通过cba与mal残基结合搭载到纳米颗粒骨架上；此外核心纳米骨架上的
‑
nh2也可与带有
‑
cooh(羧基)的小分子化合物通过脱水缩合反应结合，这样可以在不改变主体纳米骨架结构、不改变纳米颗粒主要功能性状的基础上，引入其他功能性基团，改良纳米颗粒的生物学作用。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
37.图1是本发明提供的核心纳米骨架的合成反应式图；
38.图2是本发明提供的细胞表面趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂(amd3100)的cba化反应式图；
39.图3是本发明提供的纳米颗粒载体的结构式图；
40.图4是本发明提供的纳米载药系统的制备流程图；
41.图5是本发明提供的纳米载药系统高效透过血脑屏障并靶向集结于缺血缺氧区的示意图；其中：a部分表示
‑
纳米载药系统靶向聚集到脑缺血部位并氧化裂解释放格列本脲(glyburide)；b部分表示
‑
纳米载药系统的结构放大示意图；c部分表示
‑
纳米载药系统与高表达cxcr4受体细胞靶向结合，并在ros作用下裂解释放格列本脲(glyburide)；
42.图6是本发明提供的纳米颗粒载体在扫描电镜下的纳米颗粒形态；
43.图7是本发明提供的纳米颗粒载体在偏振光散射测定的纳米颗粒粒径及表面电荷；
44.图8是本发明提供的纳米颗粒粒径对比图；
45.图9是本发明提供的纳米颗粒对星形细胞活力的影响。
具体实施方式
46.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
47.实施例一
48.本实施例提供的缺血性脑卒中靶向治疗用纳米载药系统，利用纳米颗粒载体搭载治疗药物实现治疗作用。
49.本实施例的所述纳米颗粒载体有具有马来酰亚胺(mal)残端和氨基(nh2)残端的核心纳米骨架通过辅助交联剂的作用链接细胞表面趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂后再与谷胱甘肽(gsh)在常温常压下合成，本实施例的所述治疗药物可采用格列本脲(glyburide)，格列本脲对脑卒中后的脑损伤具有一定的治疗效果，能明显抑制缺血性脑卒中发生后的脑水肿，有效降低死亡率；本实施例采用纳米颗粒载体将格列本脲靶向治疗脑卒中，避免了静脉全身用药过程中存在的问题。
50.本实施例的所述纳米颗粒载体引入的
‑
mal残端和
‑
nh2残端，在聚合物成球后的外表面提供了功能基团如：
‑
mal残基、
‑
nh2和
‑
oh，
‑
mal残基在正常环境下为惰性基团，保证了整个纳米颗粒的稳定性；由于
‑
mal残基具有与胱胺双丙烯酰胺(cba)相结合的特性，因此本实施例采用胱胺双丙烯酰胺(cba)(辅助交联剂)将与cxcr4具有高配体
‑
受体高亲和性和高特异性结合能力的小分子药物amd3100(细胞表面趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂)进行cba化搭载到核心纳米骨架上，amd3100在cba化后可与核心纳米骨架上的
‑
mal残基结合，反应可在常温常压下不需催化剂稳定进行【li,j.,zhu,y.,hazeldine,s.t.,li,c.&oupicky,d.dual
‑
function cxcr4 antagonist polyplexes to deliver gene therapy and inhibit cancer cell invasion.angew chem int ed engl 51,8740
‑
8743,doi:10.1002/anie.201203463(2012)】，因此可将amd3100搭载在纳米颗粒载体上，使其在跨过血脑屏障后靶向聚集在高表达cxcr4脑缺血区域。
51.此外，核心纳米骨架上的
‑
nh2也可与带有
‑
cooh(羧基)的小分子化合物通过脱水缩合反应结合；本实施例采用的小分子化合物为谷胱甘肽(gsh)，gsh是分子量为307的小分子化合物，gsh分子上的羧基可以与核心纳米骨架上的氨基(nh2)通过脱水缩合形成酰胺键搭载到纳米颗粒骨架上。由于gsh抗氧化的功能基团为巯基(sh)，因此gsh通过羧基搭载于纳米颗粒上，并不改变谷胱甘肽的抗氧化特性【pourmbarak mahnaie,m.&mahmoudi,h.effect of glutathione
‑
stabilized silver nanoparticles on expression of las i and las r of the genes in pseudomonas aeruginosa strains.european journal of medical research 25,17,doi:10.1186/s40001
‑
020
‑
00415
‑
4(2020)】；同时由于谷胱甘肽的分子量远小于纳米颗粒分子量，因此搭载gsh也不会改变纳米颗粒固有的生物学特性和分子极性【khan,n.u.,ali,a.,khan,h.,khan,z.u.&ahmed,z.stability studies and characterization of glutathione
‑
loaded nanoemulsion.j cosmet sci 69,257
‑
267
(2018)】；由于谷胱甘肽搭载于纳米颗粒的表面，并不与包裹于纳米载药系统内的药物起反应，也不会影响纳米载药系统的运载功能【simpson,c.a.,salleng,k.j.,cliffel,d.e.&feldheim,d.l.in vivo toxicity,biodistribution,and clearance of glutathione
‑
coated gold nanoparticles.nanomedicine 9,257
‑
263,doi:10.1016/j.nano.2012.06.002(2013)】。
52.本实施例的纳米载药系统的制备方法的工艺流程如附图4所示，具体步骤如下：
53.步骤s1，合成核心纳米骨架：将ω
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十五内酯(pdl)、n
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甲基二乙醇胺(mdea)和3，3
’‑
(4，4
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三甲基二哌啶
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1，1
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二基)二丙酸二乙酯(tddp)、马来酰亚胺聚乙二醇(mal
‑
peg
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oh)和氨基聚乙二醇(nh2‑
peg
‑
oh)按照30:70:67.5:4.9:4.9的比例(feed molar ratio)投入反应器内并加入催化剂：novozym 435(固定化念珠菌南极脂肪酶b)，第一阶段将反应混合物在90℃和1atm压力的氮气反应环境中搅拌20小时；第二阶段在1.8mmhg大气压的真空下继续搅拌70小时，两阶段反应结束后，将终产物加入到正己烷中以沉淀；正己烷洗涤终产物两次后将其溶于氯仿，溶于氯仿的终产物溶液在30℃、真空环境(压力小于1mmhg)过夜，得到纯化的具有马来酰亚胺(mal)残端和氨基(nh2)残端的核心纳米骨架(mal
‑
peg
‑
ppmtp
‑
peg
‑
nh2)，反应式如附图1所示；
54.步骤s2，将细胞表面趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂搭载于步骤s1中的核心纳米骨架，反应式如附图2所示，具体步骤如下：
55.步骤s21，将胱胺双丙烯酰胺(cba)和plerixafor(amd3100)加入到含有甲醇/水混合物(体积比7/3)的玻璃瓶中，在氮气的保护下于37℃的黑暗环境中聚合反应72h；
56.步骤s22，将步骤s21中的反应混合物滴加到含1.25m盐酸的乙醇中，使混合物的酸碱度保持在ph＝3左右，离心，弃上清，收集沉淀，乙醇洗涤两次并真空干燥，得到cba化的amd3100聚合物；
57.步骤s23，将步骤s22中的聚合物溶于水中，透析2天(mwco 3.5kda)纯化，再次冷冻干燥；
58.步骤s24，将步骤s23中的聚合物在常温下使用三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐(tecp)剪切暴露二硫键残基后，加入到溶解有步骤s1中的核心纳米骨架(mal
‑
peg
‑
ppmtp
‑
peg
‑
nh2)的醋酸钠溶液中(ph＝5.2)，常温下搅拌反应2h，得到搭载有amd3100功能基团的核心纳米骨架；
59.步骤s3，将谷胱甘肽(gsh)搭载于步骤s2中的核心纳米骨架得到完整的纳米颗粒载体，如附图3所示，具体步骤如下：
60.步骤s31，将步骤s2中的核心纳米骨架在ph＝4.6～6.0的mes缓冲液中加入1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)活化；
61.步骤s32，将步骤s31中的溶液用浓缩的磷酸钠缓冲液把ph调到7.2以上，再加入溶有谷胱甘肽(gsh)的0.1m ph＝7.2的磷酸钠缓冲液反应，使谷胱甘肽(gsh)的羧基与步骤s2中的核心纳米骨架的氨基脱水缩合，链接形成完整的纳米颗粒载体；
62.步骤s4，将治疗药物与步骤s3中的纳米颗粒载体按1:20mol比的比例合成纳米载药系统，使用10k mwco的thermo snake skin透析膜透析弃去未结合的格列本脲；
63.步骤s5，按步骤s4的方式获得不同合成比例的纳米载药系统备用。
64.本发明对所述纳米载药系统进行扫描电镜(sem)下颗粒形态(如附图6所示)及偏
振光散射(dls)测定的粒径(如附图7和附图8所示)、表面电荷测定(如附图7所示)；将不同浓度纳米载药系统颗粒加入到星形细胞中培养72小时后，检测细胞活力，评估细胞毒性(如附图9所示)。
65.结果表明：该纳米载药系统成球稳定，各项指标均在理想范围内。
66.本发明所述的纳米载药系统在治疗脑卒中过程中，纳米载药系统高效透过血脑屏障并靶向集结于缺血缺氧区如附图5所示，纳米载药系统靶向聚集到脑缺血部位与高表达cxcr4受体细胞靶向结合，并在ros作用下裂解释放格列本脲(glyburide)。
67.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。