一种选育杨树纸浆材新品种的单体型-上位性位点聚合育种模块及其应用的制作方法

一种选育杨树纸浆材新品种的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块及其应用
技术领域
1.本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及基于单体型
‑
上位性位点形成的聚合育种模块及其应用，以及利用其筛选杨树优质纸浆材新品种的分子标记辅助育种方法。


背景技术：

2.杨树生长迅速、轮伐期短、种间杂交与无性繁殖比较容易、便于遗传操作，在北半球被认为是最具前途的纤维质能源树种。特别是随着我国经济的迅猛发展，当前的林木产量及质量已远不能满足工业的需求，因此选育优良用材新种质是解决该问题的重要应对策略。
3.然而，传统的以表型性状标准或杂交常规育种选择方式进行的优良种质选育，存在着育种周期长、育种方法落后、良种选育稳定性差等缺点，严重限制了优质高产纸浆材新品种的精准筛选与高效利用。提高造纸原浆中的纤维素含量能够大幅度提高成品纸的质量，而降低微纤丝角和纤维宽度能够进一步提高木材纤维的品质，此外，造纸原浆中，过高的半纤维素含量会造成木质素抽提难度大幅度增加，所以工业中一般需要对原浆中的半纤维素进行预抽提，以减少抽提木质素时的工业能耗。因此，选择纤维素、半纤维素、纤维宽和微纤丝角等4个制浆造纸品质指标进行分子早期选育，能够为造纸原浆及成品纸的工业制造提供更加高值化的原材料，并能够减少造纸业中木质素、半纤维素抽提的能源损耗和造成的环境污染。
4.基因标记辅助选择育种，是指利用与目标性状基因紧密连锁的dna分子标记对目标性状进行基因型选择的一种现代育种方法，具有操作稳定性强、不易受环境因素干扰等优点，可以极大地提高育种效率。而木材品质性状属于复杂多基因调控的数量性状，受到了多基因、多层次的协同调控作用，其遗传机制非常复杂，因此运用单一位点进行育种设计远远不够，现有技术中多采用单体型进行育种，与单标记相比，单体型作为具有紧密连锁关系的线性等位位点组合，不易受基因重组的影响，在分离重组中作为一个整体单元遗传，在关联作图中具有更大的应用潜力。但是，在杨树多性状选育中单体型内的多个连锁位点易造成目标性状连锁累赘效应，导致育种改良程序周期长、单体型的育种效力低等。
5.因此，有必要提供一种育种精度高、能够在杨树生长发育早期快速、准确地鉴定出纸浆材优异种质的分子标记，且其能够有效降低由于单体型中标记的连锁累赘造成的对目标性状的负效应。


技术实现要素：

6.为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：利用wgcna(weighted correlation network analysis，加权基因共表达网络分析)在杨树全生长时期木材组织转录组中筛选共表达基因网络，在确定稳定表达的网络内提取候选基因，并进行候选基因关联分析，能够获得显著影响杨树木材品质的稳定单体型；在确定了稳定单体型的基础上，
通过利用单体型所在基因与另一基因的上位性效应，能够解决多性状选育中单体型内多个连锁位点造成的目标性状连锁累赘效应，优化缩短了育种改良程序。基于一个稳定的单体型和一个上位性位点联合构建的聚合育种模块进行分子辅助育种，能够在分子水平对杨树的4种木材重要品质性状做出精准评价，在杨树幼苗期精准高效地筛选高品质的树种，提高单位时间内育种群体的木材品质，从而完成了本发明。
7.具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
8.第一方面，提供一种改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块，所述聚合育种模块包括1个单体型分子标记和1个上位性分子标记，
9.其中，所述单体型分子标记由标记1、标记2、标记3、标记4组合而成，均位于杨树alg14基因内。
10.第二方面，提供用于检测第一方面所述聚合育种模块的引物组，所述引物组包括引物对i和引物对ii，其中，
11.所述引物对i为单体型分子标记的检测引物对，其正向引物具有如seq id no：1所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no：2所示的核苷酸序列；
12.所述引物对ii为上位性分子标记的检测引物对，其正向引物具有如seq id no：3所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no：4所示的核苷酸序列。
13.第三方面，提供用于检测第一方面所述聚合育种模块的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的引物组。
14.第四方面，提供第一方面所述聚合育种模块、第二方面所述的引物组或第三方面所述的试剂盒在杨树选育中的用途，优选在选育优良木材品质的杨树品种中的用途。
15.第五方面，提供一种改善杨树木材品质的方法，所述方法包括以下步骤：
16.步骤1，获得第一方面所述改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块；
17.步骤2，检测杨树的聚合育种模块类型。
18.本发明所具有的有益效果包括：
19.(1)本发明提供的改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块，不受杨树的生长阶段的限制，可在杨树幼苗期实现优良品种的早期选育，显著促进杨树的育种进程；
20.(2)本发明提供的改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块，相比于单标记育种，单体型分子育种方式能够联合多个调控目标性状的强力功能标记，大幅度提高对表型的影响和育种效率；而通过上位性互作效应，能够有效消除由于单体型中位点的连锁累赘导致某一个或几个目标性状产生互斥效应，大大提高单体型标记的效力，并消除单体型育种的缺陷，提高单位时间内育种群体的木材品质；
21.(3)本发明提供的改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块的获得，利用wgcna在杨树全生长时期木材组织转录组中筛选共表达基因网络，在确定稳定表达的网络内提取候选基因，并进行候选基因关联分析，大大提高了解析复杂数量性状遗传变异的分辨率和效率；
22.(4)本发明提供的改善杨树木材品质的方法，能够在分子水平对杨树的4种木材重要品质性状做出精准评价，在杨树幼苗期精准高效地筛选高品质的树种，缩短杨树育种周
期。
附图说明
23.图1～4分别示出本发明实施例1中位于alg14基因上的单体型01和单体型02对杨树纤维素含量、微纤丝角、纤维宽、半纤维素含量的表型效应图；图5示出本发明实施例1中聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
和gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
对杨树微纤丝角的表型效应图；图6～8分别示出本发明实施例1中聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
与单体型02(hap_02
alg14
)对杨树纤维素含量、纤维宽和半纤维素含量的表型效应图。
具体实施方式
24.下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
25.在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
26.基因的上位性效应指的是由不同基因位点的非等位基因之间相互作用对基因型值所产生的非加性效应，本发明人研究发现，应用上位性位点加入多分子标记联合育种中，能够有效降低由于单体型中标记的连锁累赘造成的对某个目标性状的负效应。
27.因此，本发明对在加性、显性和上位性条件下控制木材生长的等位基因和单体型的测定，颠覆了对传统多性状选择和经典分子标记辅助选择育种的认识。一方面，关联分析捕获snp(单核苷酸多态性)和indel(插入/缺失)位点后构建的单体型可以在多年生树木苗期或幼期检测优良品种；另一方面，在确定了稳定单体型的基础上，通过利用单体型所在基因与另一基因的上位性效应，解决多性状选育中单体型内多个连锁位点造成的目标性状连锁累赘效应，优化缩短了育种改良程序，大大提高了单体型的育种效力和可用性。
28.本发明的第一方面，提供了一种改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块，所述聚合育种模块包括1个单体型分子标记和1个上位性分子标记，
29.其中，所述单体型分子标记由标记1、标记2、标记3、标记4组合而成，均位于杨树alg14基因内。
30.优选地，所述标记1为snp标记，位于杨树alg14基因内第724位碱基处，表现为c/t多态性，
31.标记2为indel标记，位于杨树alg14基因内第733位碱基处，其多态性表现为2个碱基(tc)的插入/缺失，
32.标记3为snp标记，位于杨树alg14基因内第3252位碱基处，表现为g/t多态性，
33.标记4为indel标记，位于杨树alg14基因内第3273位碱基处，其多态性表现为3个碱基(aag)的插入/缺失；
34.所述上位性标记为snp标记，位于杨树irx15
‑
l基因上游第980位碱基处，表现为a/g多态性，其与杨树alg14基因内第2714位碱基的snp标记有上位性作用。
35.本发明人研究发现，上位性的两个位点(位于杨树irx15
‑
l基因上游第980位碱基处的snp标记与杨树alg14基因内第2714位碱基的snp标记)都是各自基因关联分析中的主效位点，在两个位点上位性互作调控中能够充分体现两个基因的互作关系。在本发明中，无
论杨树alg14基因内第2714位碱基的snp标记是什么基因型，都存在上位性，根据本发明的实施例，从基因型
‑
表型效应分析中可看出该位点的多态性对目标育种性状没有显著影响，因此只需关注杨树irx15
‑
l基因的上位性位点和聚合育种模块即可。
36.更优选地，所述木材品质的性状包括纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量。
37.本发明人研究发现，杨树alg14编码n
‑
乙酰氨基葡萄糖转移酶(udp
‑
n
‑
acetylglucosamine transferase)，其拟南芥同源基因alg家族与植物多种多糖的合成和降解有关；杨树irx15
‑
l的拟南芥同源基因irx15被证实参与木聚糖生物合成通路。因此，基于上述两个基因在杨树木材品质性状上的等位遗传效应差异，开发稳定的分子辅助育种标记，能够在筛选优质纸浆材杨树新品种中发挥显著作用。
38.根据本发明一种优选的实施方式，所述单体型分子标记包括单体型01和单体型02，
39.其中，单体型01为标记1的多态性表现为c，标记2的多态性表现为tc片段的插入，标记3的多态性表现为t，且标记4的多态性表现为aag片段的插入；
40.单体型02为标记1的多态性表现为t，标记2的多态性表现为tc片段的缺失，标记3的多态性表现为g，且标记4的多态性表现为aag片段的缺失。
41.其中，上述各标记位点均为纯合基因型。
42.在进一步优选的实施方式中，所述单体型01为c
‑
ttc
‑
t
‑
caag，单体型02为t
‑
t__
‑
g
‑
c___；
43.其中，“_”表示碱基缺失。
44.根据本发明的实施例，当仅考虑单体型的育种效应时，单体型分子标记类型为单体型01的杨树个体，相对于单体型02的杨树个体，具有较高的纤维素含量、较大的微纤丝角、较低的纤维宽和较低的半纤维素含量。
45.进一步地，为降低单体型中标记的连锁累赘造成的对某个目标性状的负效应，需要综合考虑上位性位点的作用。
46.根据本发明的实施例，所述杨树个体的上位性标记(杨树irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp)基因型为aa时，其对应的微纤丝角显著低于该位点基因型为gg的个体。
47.将上述单体型和上位性位点联合，形成聚合育种模块。
48.优选地，上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块对应的杨树个体，相对于上位性标记的基因型为gg、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块对应的杨树个体，具有显著较低的微纤丝角；
49.上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块对应的杨树个体，其微纤丝角与单体型分子标记的类型为单体型02的杨树个体接近；
50.上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块对应的杨树个体，其纤维素含量显著高于单体型分子标记的类型为单体型02的杨树个体，纤维宽和半纤维素含量显著低于单体型分子标记的类型为单体型02的杨树个体。
51.因此，根据本发明一种优选的实施方式，上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块对应的杨树个体，具有较高的纤维素含量、较小的微纤丝角、较低的纤维宽及较低的半纤维素含量。
52.其中，当采用针对上述聚合育种模块的特异引物对待测杨树个体的基因组dna进行pcr扩增检测时，通过对pcr产物进行测序，能够有效地确定待测杨树个体的纤维素含量、微纤丝角大小、纤维宽和半纤维素含量，具体地，当测序结果显示杨树个体上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01时，可以确定其具有高纤维素含量、低微纤丝角、低纤维宽和低半纤维素含量，符合制浆造纸业育种目标的要求；当测序结果显示杨树个体上位性标记的基因型为gg、且单体型分子标记的类型为单体型01，或杨树个体单体型分子标记的类型为单体型02时，则该个体未达到纸浆造纸育种目标的要求。
53.本发明的第二方面，提供了用于检测第一方面所述聚合育种模块的引物组，所述引物组包括引物对i和引物对ii，其中，
54.所述引物对i为单体型分子标记的检测引物对，其正向引物具有如seq id no：1所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no：2所示的核苷酸序列；
55.所述引物对ii为上位性分子标记的检测引物对，其正向引物具有如seq id no：3所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no：4所示的核苷酸序列。
56.其中，上述单体型分子标记和上位性分子标记的鉴定，优选均需要一个引物对对待测个体的基因组dna进行pcr扩增，然后对产物进行测序。因此，上述用于检测聚合育种模块的引物组，能够有效用于杨树的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现低成本、高准确性地选育优良木材品质的杨树新品种。
57.在本发明中，在seq id no：1～seq id no：4所示序列的5'端和3'端分别增加1～20个碱基并能得到基本相同dna片段(上游和下游引物之间的dna序列相同)的引物对，均包括在本发明的引物组中。
58.本发明的第三方面，提供了一种用于检测第一方面所述聚合育种模块的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的引物组。
59.本发明所述的试剂盒，能够有效用于杨树的分子标记辅助育种，以辅助早期实现低成本、高准确性地选育杨树优质纸浆材新品种。
60.优选地，所述试剂盒还包括pcr扩增试剂，所述pcr扩增试剂包括pcr缓冲液、dntp和dna聚合酶。
61.本发明的第四方面，提供了第一方面所述的聚合育种模块、第二方面所述的引物组或第三方面所述的试剂盒在杨树选育中的用途，优选在选育优良木材品质的杨树品种中的用途，更优选在选育高纤维素含量、低微纤丝角、低纤维宽且低半纤维素含量的杨树品种中的用途。
62.本发明的第五方面，提供了一种改善杨树木材品质的方法，所述方法包括以下步骤：
63.步骤1，获得改善木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块；
64.步骤2，检测杨树的聚合育种模块类型。
65.以下进一步描述所述改善杨树木材品质的方法：
66.步骤1，获得改善木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块。
67.其中，步骤1包括以下子步骤：
68.步骤1
‑
1，选择群体，测定木材品质相关的表型性状。
69.在本发明中，优选选取位于山东冠县苗圃的15年生的435株毛白杨个体组成的种
质资源群体作为获得聚合育种模块的分析群体。
70.优选地，所述木材品质相关的表型性状包括纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量。
71.其中，每个个体的各个性状取三个生物学重复，各指标采集方式优选按照文献“duet al.,variation in growth,leaf,and wood property traits of chinese white poplar(populus tomentosa),a major industrial tree species in northern china 2014,canadian journal of forest research,44:326
‑
339”中所述方法进行测定。
72.步骤1
‑
2，提取步骤1
‑
1中群体的rna，进行基因转录本表达水平定量分析。
73.其中，步骤1
‑
2包括以下子步骤：
74.步骤1
‑2‑
1，提取群体中每株个体胸径处木材组织的rna，建立rna单链特异性文库。
75.其中，采用现有技术中常用方法或试剂盒法提取个体的rna，如the qiagen rnaeasy kit(qiagen china,shanghai,china)试剂盒。
76.在本发明中，对建立rna单链特异性文库的方法不做特别限定，可以采用现有技术中常用的方法进行。
77.例如，采用超微量分光光度计(nanodrop 1000，nd1000)和安捷伦2100生物分析仪(agilent bioanalyzer 2100)对样品rna进行评估；再利用的ultratm rna文库制备试剂盒(neb，美国)建立rna单链特异性文库。
78.步骤1
‑2‑
2，对rna单链特异性文库进行重测序。
79.在本发明中，对rna单链特异性文库进行重测序的方法不做特别限定，可以采用现有技术中常用的方法进行。
80.例如，利用illumina hiseq 2500对rna单链特异性文库进行重测序，生成10
‑
nt的双端reads(读取)，即raw data(原始数据)；去除掉含有adapter(接头)、ploy
‑
n(条码，即barcode也称为index，是一段很短的寡居核酸链，用于在多个样品混合测序时，标记不同的样品)以及低质量的reads后，得到clean data(干净数据)。
81.步骤1
‑2‑
3，进行基因转录本表达水平定量。
82.优选地，利用cuffquant软件对基因转录本表达水平进行定量。
83.步骤1
‑
3，获得与木材形成相关的基因。
84.优选地，采用r语言中的wgcna软件包进行加权基因共表达网络分析，构建共表达网络。
85.进一步地，对每个共表达网络模块进行go(gene ontology)和kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，获得与木材形成相关功能通路，并提取通路内基因，即为与木材形成相关的基因。
86.根据本发明的实施例，最终获得80个与木材形成相关的基因。
87.步骤1
‑
4，获得与木材形成相关的所有snp位点。
88.在本发明中，优选采用vcftools软件对上述获得的与木材形成相关的基因进行筛选，获得与木材形成相关的所有snp位点。根据本发明的实施例，对80个基因进行筛选得到21828个snp。
89.其中，优选地，筛选的条件为：最小等位基因频率(minor allele frequency，maf)
＞0.05，缺失基因型(missing genotype,mg)＜0.2，且连锁不平衡(r2)<0.2。
90.利用筛选得到的snp集合通过admixture v1.3.0软件进行群体结构分析，根据本发明的实施例，k(群体结构)值的范围是1
‑
10，在k＝3时，取得最小交叉验证误差值。
91.步骤1
‑
5，获得与纤维素、微纤丝角、纤维宽和半纤维素显著关联的snp位点及其所在的基因。
92.在本发明中，优选采用efficient mixed
‑
model association expedited(emmax)软件中的混合线性模型(mixed linear model,mlm)，对步骤1
‑
4获得的snp集合与群体表型性状(纤维素含量、微纤丝角、纤维宽、半纤维素含量)进行关联分析，获得与纤维素含量、微纤丝角、纤维宽、半纤维素含量显著关联的snp位点。
93.具体地，利用emmax软件获得亲缘关系，作为随机效应的方差
‑
协方差矩阵，以步骤1
‑
4中的群体结构作为固定效应。
94.根据本发明的实施例，当关联的显著性p≤0.001时，得到最显著的52个snp，位于14个基因上。
95.步骤1
‑
6，获得与纤维素、微纤丝角、纤维宽、半纤维素显著关联的插入缺失位点(indel)。
96.其中，利用vcftools软件对步骤1
‑
5中获得的基因提取435株毛白杨个体的indel，并按照步骤1
‑
5进行indel关联分析。
97.根据本发明的实施例，对步骤1
‑
5中的14个基因提取了435株毛白杨个体的indel，当关联的显著性p≤0.001时，得到12个高显著性的indel。
98.步骤1
‑
7，获得显著关联的位点构成的稳定单体型。
99.在本发明中，优选利用haploview v4.2软件，通过非线性回归估计位点之间物理距离的ld衰减，并构建单体型，检测步骤1
‑
5中获得的显著关联的52个snp和步骤1
‑
6中获得的显著关联的12个indel的高ld单体型块(高ld单体型块的标准是：r2>0.75；r2代表两位点间的统计相关)，得到由pto
‑
alg14(毛白杨alg14)基因内第724位碱基的snp标记、第733位碱基的插入缺失标记、第3252位碱基的snp标记和第3273位碱基的插入缺失标记构成的稳定单体型。
100.步骤1
‑
8，检验携带不同单体型的杨树表型的差异显著性。
101.在本发明中，优选采用f
‑
test和student’s t
‑
test(p≤0.05)检验两种方法检验携带不同单体型的杨树表型的差异显著性。
102.根据本发明的实施例，当毛白杨个体的单体型为单体型01(c
‑
ttc
‑
t
‑
caag)时，能够显著提高毛白杨群体中个体的纤维素含量、增大微纤丝角，并降低纤维宽和半纤维素含量。
103.在本发明中，由于单体型类型在杨树群体中几乎全部为单体型01和单体型02两类，其余类型单体型类型的频率极低(频率＜0.05)，故不考虑其他单体型情况。
104.步骤1
‑
9，检测上述获得的与纤维素、微纤丝角、纤维宽和半纤维素显著关联的snp位点和indel位点的上位性互作关系。
105.在纸浆造纸工业中，对于木材原料通常以提高其纤维素含量，降低微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量为育种目标。在本发明中，优选利用episnp_v4.2软件检测52个snp和12个indel的上位性互作关系。根据本发明的实施例，发现pto
‑
irx15
‑
l基因(毛白杨irx15
‑
l
基因)上游第980位碱基的snp与pto
‑
alg14基因第2714位碱基的snp标记在微纤丝角中有上位性作用，进一步通过f
‑
test和student’s t
‑
test发现，当pto
‑
irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp基因型为aa时，群体中携带aa基因型的个体mfa显著低于gg基因型个体(p≤0.05)。
106.步骤1
‑
10，获得改善木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块。
107.在本发明中，将irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp与单体型分子标记联合，综合考虑对表型性状的影响，获得改善木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块类型。
108.根据本发明的实施例，将pto
‑
irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp和单体型01(c
‑
ttc
‑
t
‑
caag)聚合(即将该上位性snp位点和单体型组合，进行聚合育种)，通过f
‑
test和student’s t
‑
test发现，上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块(aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
)对应的杨树个体，相对于上位性标记的基因型为gg、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块(gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
)对应的杨树个体，具有显著较低的微纤丝角，并接近于单体型分子标记的类型为单体型02(hap_02
alg14
)的杨树个体；上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01的聚合育种模块对应的杨树个体，其纤维素含量显著高于单体型分子标记的类型为单体型02的杨树个体，纤维宽和半纤维素含量显著低于单体型分子标记的类型为单体型02的杨树个体。
109.本发明所述的获得改善木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块的方法，利用wgcna在杨树全生长时期木材组织转录组中筛选共表达基因网络，在确定稳定表达的网络内提取候选基因，并进行候选基因关联分析，大大提高解析复杂数量性状遗传变异的分辨率和效率，能够快速筛选出调控木材品质性状的主效关键基因，并利用数个高关联信号的snp和indel位点进行单体型构建，获得了能够显著影响杨树纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量的单体型；同时综合考虑snp位点和indel位点的上位性互作作用，获得符合纸浆造纸业的育种目标的聚合育种模块类型。
110.步骤2，检测杨树的聚合育种模块类型。
111.优选地，所述步骤2包括检测杨树的单体型分子标记为单体型01还是单体型02，以及检测上位性标记的基因型的过程。
112.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤2包括以下子步骤：
113.步骤2
‑
1，以杨树的基因组dna为模板，进行pcr扩增，获得扩增产物；
114.步骤2
‑
2，根据扩增产物，确定杨树的聚合育种模块类型；
115.步骤2
‑
3，根据聚合育种模块类型，判定杨树的木材品质。
116.优选地，步骤2
‑
1中，进行pcr扩增时，采用的扩增引物为本发明第二方面所述的引物组；
117.步骤2
‑
2中，确定杨树的聚合育种模块类型(包括单体型分子标记类型和上位性标记类型)的方法包括但不限于测序。
118.步骤2
‑
3中，若杨树的聚合育种模块类型为上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01，则具有较高的纤维素含量、较小的微纤丝角、较低的纤维宽及较低的半纤维素含量；若杨树的聚合育种模块类型为上位性标记的基因型为gg、且单体型分子标记的类型为单体型01，具有较高的微纤丝角；若杨树的单体型分子标记的类型为单体型02，则具有较低的纤维素含量、较小的微纤丝角、较高的纤维宽和较高的半纤维素含量。
119.根据本发明一种优选的实施方式，在确定了杨树的聚合育种模块类型之后，选择上位性标记的基因型为aa、且单体型分子标记的类型为单体型01的杨树个体，淘汰非上述聚合育种模块类型的杨树个体，以提高优势聚合育种模块类型的频率，从而显著改善提高杨树的纤维素含量，降低微纤丝角、纤维宽及半纤维素含量。
120.本发明所述的改善杨树木材品质的方法，能够在杨树幼苗期快速、精准地筛选高纤维素含量、低微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量的品种，缩短杨树育种周期，改善纸浆造纸工业中原材料的化学品质。
121.实施例
122.以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
123.实施例1与木材品质相关的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块的获得
124.1、试验群体
125.选取位于山东冠县苗圃的15年生435株毛白杨个体组成的种质资源群体作为获得聚合育种模块的关联分析群体，该种质资源群体中的个体几乎代表了毛白杨全部的自然分布区域的生态类型。
126.2、纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量的测定
127.每个个体的各个性状取三个生物学重复，各指标采集方式优选按照文献“duetal.,variation in growth,leaf,and wood property traits of chinese white poplar(populus tomentosa),a major industrial tree species in northern china 2014,canadian journal of forest research,44:326
‑
339”中所述方法进行测定。
128.3、rna的提取
129.采用试剂盒the qiagen rnaeasy kit(qiagen china,shanghai,china)提取试验群体中每株个体胸径处木材组织的rna。
130.4、基因转录本表达水平定量分析
131.采用超微量分光光度计(nanodrop 1000，nd1000)和安捷伦2100生物分析仪(agilent bioanalyzer 2100)对样品rna进行评估；再利用的ultratm rna文库制备试剂盒(neb，美国)建立rna单链特异性文库；利用illumina hiseq 2500对rna单链特异性文库进行重测序，生成10
‑
nt的双端reads，即raw data；去除掉含有adapter、ploy
‑
n以及低质量的reads后，得到clean data；利用cuffquant软件对基因转录本表达水平进行定量。
132.5、获得与木材形成相关的基因
133.采用r语言中的wgcna软件包进行加权基因共表达网络分析，构建共表达网络；对每个共表达网络模块进行go和kegg分析，找出和木材形成相关功能的模块，并提取模块内基因，最终得到80个基因。
134.6、获得与木材形成相关的所有snp位点
135.(6.1)利用dneasy plant mini kit(qiagen china,shanghai,china)试剂盒提取种质资源群体叶片组织的基因组dna；
136.对种质资源群体每株个体的dna进行重测序获得原始数据(rawdata)，对dna原始数据进行质量控制(quality control)后得到干净数据(cleandata)；
137.其中，dna重测序为双末端测序，所述测序的深度为30
×
；所述测序采用illumina ga2重测序平台；
138.质量控制的标准是：(i)去除掉含有≥10％未识别核苷酸的读取(reads)；(ii)去除掉碱基质量＜5的数量＞50％的reads；(iii)去除掉＞10nt比对到适配器(adapter)的reads，允许≤10％的错配；(iv)删除在文库构建过程中通过pcr扩增产生的推定pcr重复片段(两个完全相同的配对的read1和read2)；
139.利用burrows
‑
wheeleralignerv0.7.5a
‑
r405(默认参数)将每个样本的cleandata比对到杨树参考基因组v3.0(http://popgenie.org/)上；利用samtoolsv1.1过滤掉低质量reads(mq＜20)；利用genome analysis toolkit(gatk)v4.0鉴定全基因组单核苷酸多态性位点(snp)，参数如下：snp:qd<5.0||mq<40.0||fs>60.0||sor>3.0||mqranksum<
‑
12.5||readposranksum<
‑
8.0；indel:qd<5.0||fs>200.0||sor>10.0||mqranksum<
‑
12.5||readposranksum<
‑
8.0；利用vcftools_0.1.13得到双等位snps。
140.(6.2)利用vcftools软件对80个基因进行筛选得到21828个snp的集合，筛选的条件为：maf＞0.05，mg＜0.2，连锁不平衡(r2)<0.2；利用该snp集合通过admixture v1.3.0软件进行群体结构分析；k值的范围是1
‑
10，在k＝3时，取得最小交叉验证误差值。
141.7、获得与纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量显著关联的snp位点及其所在的基因
142.使用efficient mixed
‑
model association expedited(emmax)软件中的混合线性模型(mixed linear model,mlm)，对步骤6中获得的snp集合与435株毛白杨种质资源群体的纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量进行关联分析，获得与纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量显著关联的snp位点。
143.其中，利用emmax软件获得亲缘关系，作为随机效应的方差
‑
协方差矩阵，以步骤6中的群体结构作为固定效应。
144.当关联的显著性p≤0.001时，得到最显著的52个snp，位于14个基因上。
145.8、获得与纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量显著关联的插入缺失位点(indel)
146.利用vcftools软件对步骤7中获得的14个基因提取435株毛白杨个体的indel位点，并按照步骤7进行indel关联分析，当关联的显著性p≤0.001时，得到12个indel。
147.9、检测上述获得的与纤维素、微纤丝角、纤维宽和半纤维素显著关联的snp位点和indel位点的上位性互作关系
148.利用episnp_v4.2软件检测52个snp和12个indel的上位性互作关系，发现pto
‑
irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp与pto
‑
alg14基因第2714位碱基的snp标记在微纤丝角中有上位性作用，进一步通过f
‑
test和student’s t
‑
test发现，当pto
‑
irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp基因型为aa时，种质资源群体中携带aa基因型的个体mfa显著低于gg基因型个体(p≤0.05)。
149.10、获得改善木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块
150.将pto
‑
irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp和haplotype01(c
‑
ttc
‑
t
‑
caag)聚合，通过f
‑
test和student’s t
‑
test发现，aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
(上位性标记的基因型为aa且单体型分子标记的类型为单体型01)的微纤丝角显著低于gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
(上位性标记的
基因型为gg且单体型分子标记的类型为单体型01)的微纤丝角，并接近于hap_02
alg14
(单体型分子标记的类型为单体型02)的微纤丝角，而aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
的纤维素含量显著高于hap_02
alg14
，纤维宽、半纤维素显著低于hap_02
alg14
，符合纸浆造纸业的育种目标。
151.位于alg14基因上的单体型01和单体型02对杨树纤维素含量、微纤丝角、纤维宽、半纤维素含量的表型效应图分别如图1～4所示；
152.聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
和gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
对杨树微纤丝角的表型效应图如图5所示，表明上位性标记(aa
irx15
‑
l
)对微纤丝角具有非常强的降低作用；
153.聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
与单体型02(hap_02
alg14
)对杨树纤维素含量、纤维宽和半纤维素含量的表型效应图分别如图6～8所示，表明聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
在降低了微纤丝角的前提下，仍然符合纤维素含量、纤维宽和半纤维素含量在纸浆造纸业中目标性状的育种期望。
154.实验例
155.实验例1
156.在毛白杨种质资源群体(位于山东冠县苗圃的15年生435株毛白杨个体组成)中随机选取85株个体，采用实施例1所述方法获得的聚合育种模块对个体的纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量指标进行评价。
157.具体步骤如下：
158.(1)提取毛白杨个体的基因组dna：采集个体的功能叶(枝条上端第3～5片成熟叶)，立即放入液氮环境(
‑
196℃)中保存；利用dneasy plant mini kit(qiagen china,shanghai,china)试剂盒提取叶片组织的基因组dna。
159.(2)测定毛白杨样品基因组dna的alg14基因内第724位碱基的snp标记、第733位碱基的插入缺失标记、第3252位碱基的snp标记和第3273位碱基的插入缺失标记，以及irx15
‑
l基因上游第980位碱基的snp标记，采用引物对i、ii进行。
160.扩增程序为：94℃：5min；(40循环)：94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；72℃，10min；之后进行4℃保存。
161.扩增体系为：
162.总体系：25μl，主要包括：pcr缓冲溶液(10x)：2.5μl；mgcl2(25mm/μl)：1.8μl；f引物(10μm)：0.8μl；r引物(10μm)：0.8μl；dntp(25μm)：0.6μl；taq酶(2.5u/μl)：0.3μl；dna(5ng/μl)：4.0μl；双蒸水：14.2μl。
163.对85株个体的单体型01(hap_01
alg14
)和单体型02(hap_02
alg14
)对于纤维素含量、纤维宽、微纤丝角和半纤维素含量的差异显著性检验(f
‑
test和t
‑
test)结果如表1所示。
164.表1
165.166.[0167][0168]
其中，变量1表示hap_01
alg14
，变量2表示hap_02
alg14
。由于实验群体个别表型值数据存在缺失，故差异显著性检验中变量1和变量2的实际检验个体数量之和有小于85株的情况存在。
[0169]
由表1可知，实验群体中单体型01和单体型02在四个木材品质性状中具有显著差异，表现为单体型01的纤维素、微纤丝角显著高于单体型02，而半纤维素和纤维宽显著低于单体型02。
[0170]
更进一步地，聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
和gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
对于微纤丝角的差异显著性检验结果如表2所示，对于纤维素、半纤维素和纤维宽的差异显著性检验结果如表3～5所示。
[0171]
表2
[0172][0173]
表3
[0174]
[0175][0176]
表4
[0177][0178]
表5
[0179][0180]
由表2～5可知，在优良聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
和次等模块gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
对于四个木材品质性状的对比中发现，aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
在纤维素上显著高于
gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
，而在微纤丝角、半纤维素和纤维宽上显著低于gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
。
[0181]
综上可知，聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
具有高纤维素含量、低微纤丝角、低纤维宽和低半纤维素含量，其4个木材品质指标的综合评价符合纸浆造纸业育种目标的要求。
[0182]
实验例2在幼龄
‑
成熟群体分别进行传统多性状评分法育种和本发明所述的聚合模块育种
[0183]
pca
‑
topsis多性状评分育种法说明：
[0184]
分别利用435株5年生幼龄毛白杨群体和435株15年生成熟毛白杨群体进行表型评分，查看幼龄群体排序得分前十的个体在成熟群体中排名情况，之后利用聚合模块育种方法，查看选育出的个体在成熟群体中的评分排名情况。
[0185]
由于育种的最终目的是利用成熟个体在工业中进行应用，因此成熟群体的表型综合评分应为在工业中优选个体的金标准。
[0186]
其中，数据正向化处理：由于本发明中4个木材品质性状都是正向指标，故无需正向处理；
[0187]
利用spss软件对4个木材品质性状进行标准化(normalize),得到标准化矩阵z；
[0188]
pca(principal component analysis)：利用spss软件对4个性状进行pca分析，得到4个性状的权重w
p
(weight)，pca分析使用spss软件的标准流程即可；
[0189]
topsis法(technique for order preference by similarity to ideal solution)可翻译为逼近理想解排序法，国内常简称为优劣解距离法。
[0190]
topsis法是一种常用的综合评价方法，其能充分利用原始数据的信息，结果能精确地反映各评价方案之间的差距(hwang cl,yoon k(1981)multiple attribute decision making
‑
method and applications,a state
‑
of
‑
the
‑
art survey.springer
‑
verlag,new york)。
[0191]
具体实施流程：
[0192]
①
最优(z

)和最坏(z
‑
)方案由z中每一列元素的最大值或最小值组成：
[0193]
最优方案
[0194]
最劣方案
[0195]
②
计算每个候选个体4个表型值与最优/最差方案之间的加权欧式距离(和)：
[0196][0197]
③
计算个体表型和最优方案之间的接近度(ci)
[0198][0199]
其中，z是表型标准化矩阵，w
p
是表型权重，(1≤i≤m),z
i
‑
＝min{z
ij
}(1≤i≤m),i＝1,2,
…
,m,j＝1,2,
…
,n.c
i
∈[0,1],c
i
越接近1，表示第i个评价对象越接近最优水平。
[0200]
经计算，4个性状5年生的权重w
p
为：cc(纤维素含量)＝0.371；hec(半纤维含量)＝
0.278；fw(纤维宽)＝0.337；mfa(微纤丝角)＝0.313。
[0201]
4个性状15年生的权重w
p
为cc＝0.256；hec＝0.257；fw＝0.242；mfa＝0.245。
[0202]
计算个体表型和最优方案之间的接近度(ci)(打分值)，结果如表6所示。
[0203]
表6
[0204]
[0205]
[0206][0207]
其中，单体型01
‑
aa即为聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
，单体型01
‑
gg即为聚合育种模块gg
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
，单体型02
‑
aa即为上位性标记的基因型为aa且单体型分子标记的类型为单体型02(聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_02
alg14
)，单体型02
‑
gg即为上位性标记的基因型为gg且单体型分子标记的类型为单体型02(聚合育种模块gg
irx15
‑
l
‑
hap_02
alg14
)。
[0208]
由上述结果可知：幼龄群体(5年生)表型评分时的前十个体，在成熟群体中只有2个(个体编号为5、6)仍排名前十；而成熟群体的评分排名，是实际纸浆工业应用中的黄金标准，该排名是对实际收获时期应砍伐木材质量的真正评价，从结果可以看出，成熟群体表型评分中，排名前十中有八个是所选优良聚合育种模块aa
irx15
‑
l
‑
hap_01
alg14
。
[0209]
因此我们可以得出结论：本发明所述的聚合育种方法在整个时期的选优效率为80％(8/10)，而传统多表型选育选优效率仅为20％(2/10)，说明本发明所提供的聚合育种模块选育显著优于传统多表型选育。
[0210]
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

技术特征：
1.一种改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块，其特征在于，所述聚合育种模块包括1个单体型分子标记和1个上位性分子标记，其中，所述单体型分子标记由标记1、标记2、标记3、标记4组合而成，均位于杨树alg14基因内。2.根据权利要求1所述的聚合育种模块，其特征在于，所述标记1为snp标记，位于杨树alg14基因内第724位碱基处，具有c/t多态性，标记2为indel标记，位于杨树alg14基因内第733位碱基处，其多态性表现为2个碱基的插入/缺失，标记3为snp标记，位于杨树alg14基因内第3252位碱基处，具有g/t多态性，标记4为indel标记，位于杨树alg14基因内第3273位碱基处，其多态性表现为3个碱基的插入/缺失；所述上位性标记为snp标记，位于杨树irx15
‑
l基因上游第980位碱基处，具有a/g多态性。3.根据权利要求1所述的聚合育种模块，其特征在于，所述木材品质的性状包括纤维素含量、微纤丝角、纤维宽和半纤维素含量。4.根据权利要求2所述的聚合育种模块，其特征在于，所述单体型分子标记包括单体型01和单体型02，其中，单体型01为标记1的多态性表现为c，标记2的多态性表现为tc片段的插入，标记3的多态性表现为t，且标记4的多态性表现为aag片段的插入；单体型02为标记1的多态性表现为t，标记2的多态性表现为tc片段的缺失，标记3的多态性表现为g，且标记4的多态性表现为aag片段的缺失。5.用于检测权利要求1至4之一所述聚合育种模块的引物组，其特征在于，所述引物组包括引物对i和引物对ii，其中，所述引物对i为单体型分子标记的检测引物对，其正向引物具有如seq id no：1所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no：2所示的核苷酸序列；所述引物对ii为上位性分子标记的检测引物对，其正向引物具有如seq id no：3所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no：4所示的核苷酸序列。6.用于检测权利要求1至4之一所述聚合育种模块的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的引物组。7.权利要求1至4之一所述聚合育种模块、权利要求5所述的引物组或权利要求6所述的试剂盒在杨树选育中的用途，优选在选育优良木材品质的杨树品种中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述杨树选育为选育高纤维素含量、低微纤丝角、低纤维宽且低半纤维素含量的杨树品种。9.一种改善杨树木材品质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，获得权利要求1至4之一所述改善杨树木材品质的单体型
‑
上位性位点聚合育种模块；步骤2，检测杨树的聚合育种模块类型。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤2包括检测杨树的单体型分子标记为单体型01还是单体型02，以及检测上位性标记的基因型的过程。
技术总结
本发明公开了一种改善杨树木材品质的单体型


技术研发人员：杜庆章 吕晨飞 卢文杰 权明洋 张德强
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2021.03.09
技术公布日：2021/6/25