LRIG-1蛋白的特异性结合分子及其用途的制作方法

lrig
‑
1蛋白的特异性结合分子及其用途
技术领域
1.本发明涉及能够特异性结合存在于调节性t细胞表面(treg细胞)的lrig
‑
1(富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1)蛋白的结合分子及其用途。


背景技术：

2.癌细胞被普遍认为可以表达免疫原性抗原，其能够诱导针对肿瘤形成的有效免疫应答。此外，肿瘤微环境富含可触发tlr信号转导以激活抗肿瘤反应的成分(参见standiford tj，keshamouni vg(2012)破坏肿瘤的耐受性：针对tlr信号传导的负调节器，肿瘤免疫学1:340
‑
345)。这意味着在疾病的早期阶段，癌细胞可能有机会被免疫系统识别并排斥，免疫系统对发展中的肿瘤具有宿主保护和肿瘤建模作用。尽管如此，癌细胞还具有许多逃避免疫监视的负调节机制，例如下调mhc分子或抗原加工和呈递机制，这增加了抑制性细胞因子的分泌并表达抑制性分子，从而诱导癌细胞的免疫耐受性。因此，癌症患者通常被认为免疫力低下。相应地，仍有需要去开发逆转癌症相关免疫抑制的药物或疗法。
3.同时，与常规药物相比，基于抗体的癌症疗法具有潜在的高特异性和低副作用的特点。这是因为抗体允许正常细胞和肿瘤细胞之间的精确分化，并且它们的作用方式取决于较小的毒性免疫抗肿瘤机制，例如细胞毒性免疫细胞的流入和互补激活。
4.基于抗体的疗法的靶标需要具有特定的性质，这是正常细胞和肿瘤细胞之间适当分化的基础。毋庸置疑，在开发有效和安全的抗体疗法中，一个仅限于肿瘤细胞或在正常组织中根本检测不到的靶点将是理想的。在另一方面，高过表达可以是治疗窗口的基础，并且由于基因扩增，人类表皮生长因子受体2型(her
‑
2)表现出的低副作用使her
‑
2成为曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(herceptin))抗体的优异靶标。
5.已经在肿瘤疗法中批准或在临床发展中批准的抗体的其他靶标具有不同的特性，其不是基于肿瘤细胞靶标分子的大量过表达。在针对蛋白多糖muc1的抗体的情况下，靶标骨架上的一个肽重复表位在肿瘤细胞中被糖基化，从而改变为正常的对应蛋白。在针对cd20(利妥昔单抗(rituximab))、cd52(campath
‑
1h)和cd22(依帕珠单抗(epratuzumab))抗体的情况下，抗体靶标在肿瘤细胞和正常淋巴细胞上具有相当的表达水平。就这一点而言，由于靶标阴性的干细胞可以恢复正常淋巴细胞库，因此抗体清除正常细胞是可以容忍的。抗体靶标的不同可用性的其他实例是癌胚抗原(cea)和碳酸酐酶ix(ca9)。这两种抗原分别在结肠和肾脏的正常上皮细胞上表达。然而，放射性标记的成像抗体确实能很好地区分肿瘤和正常组织，因此细胞毒性抗体具有良好的耐受性。这可能是因为ca9和cea的表达仅限于igg抗体无法进入的正常上皮组织的管腔侧。抗原上皮细胞粘附分子(ep
‑
cam)也属于该类别。作为上皮细胞的同型细胞粘附分子，它位于细胞间隙中。有趣的是，高亲和力的抗ep
‑
cam抗体具有很高的毒性，而中亲和力的抗体具有很好的耐受性。这表明，不仅是ep
‑
cam靶标对正常细胞的可及性，抗体结合的动力学也可能会打开新的治疗窗口。
6.已经批准了八种抗体用于治疗肿瘤组织相关疾病，但它们中的大多数是针对淋巴瘤和白血病(adams，g.p.和weiner，l.m.(2005)nat.biotechnol.23,1147
‑
1157)。只有三种
单克隆抗体，即赫赛汀(herceptin)、阿瓦斯汀(avastin)和艾比妥(erbitux)，可用于治疗实体瘤类型，其占癌症诱发的死亡率的90％以上。已批准的基本保留医疗要求和显著的临床效益的mab已被提供，并且它们显著的商业成功也为针对不同群体的患者开发新的创新方法提供了动力，其中基于抗体疗法的开发与其增强的功效得到了良好的平衡(brekke,o.h.和sandlie,i.(2003)nat.rev.drugdiscov.2,52
‑
62；carter，p.(2001)nat.rev.cancer1,118
‑
129)。
7.随着新一代以抗体为基础的癌症治疗方法的出现，将要应对的挑战之一是选择合适的靶标分子，这是获得良好的毒性/功效的关键因素。
8.目前可用于实体肿瘤治疗的抗体不能充分发挥抗体分子固有的作用模式的累积力，因为它们的靶点在正常组织中表达。例如，her2/neu，赫赛汀的靶标，在许多正常的人体组织中表达，包括心肌(crone，sa，zhao，yy，fan，l.，gu，y.，minamisawa，s.，liu，y.，peterson，kl，chen，j.，kahn，r.，condorelli，g.等.(2002)nat.med.8,459
‑
465)。所以，赫赛汀被设计为具有降低的免疫力，因此不能以最大有效量给药，否则会产生不可接受的毒性。因此，这种“钝化潜在锋利刀片的措施”限制了赫赛汀的治疗效果。
9.除了抑制与毒性相关的正常组织中的表达外，理想的抗体靶点的理想特征是在肿瘤细胞表面表现出强而高的表达水平，同时表现出肿瘤促进功能(houshmand，p.和zlotnik，a.(2003)curr.opin.cellbiol.15,640
‑
644)。
10.技术问题
11.本发明的一个目的是提供一种存在于调节性t细胞表面(treg细胞)的lrig
‑
1蛋白的特异性结合分子。
12.本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的结合分子的核酸分子。
13.本发明的又一个目的是提供一种插入有本发明的核酸分子的表达载体。
14.本发明的又一个目的是提供一种用本发明的表达载体转染的宿主细胞系。
15.本发明的又一个目的是提供一种本发明的抗体
‑
药物缀合物。
16.本发明的又一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含本发明的结合分子。
17.本发明的又一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的方法，包括将本发明提供的药物有效量的结合分子或抗体
‑
药物缀合物(adc)给予个体的步骤。
18.然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且从以下描述中本领域技术人员将清楚地理解其他未提到的问题。
19.技术问题的解决方案
20.本发明人发现了特异性地位于调节性t细胞表面上的lrig
‑
1蛋白，在蛋白质上选择表位，并生产了能够与lrig
‑
1蛋白质特异性结合的单克隆抗体，从而完成了本发明。
21.根据本发明的一个实施方式，提供了一种结合分子，其特异性结合lrig
‑
1(富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1)蛋白。
22.如本文所用，术语“结合分子”是指包含完整(intact)免疫球蛋白的可变结构域，其包括单克隆抗体，例如嵌合、人源化或人单克隆抗体，或者与抗原结合的免疫球蛋白，例如与完整免疫球蛋白竞争结合a型流感病毒的单体ha或三聚体ha的免疫球蛋白片段。无论结构如何，抗原结合片段结合完整免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可包括含有
肽或多肽，其含有结合分子的氨基酸序列中的两个或更更多个连续残基的氨基酸序列、20个或更多个连续氨基酸残基、25个或更多个连续氨基酸残基、30个或更多个连续氨基酸残基、35个或更多个连续氨基酸残基、40个或更多个连续氨基酸残基、50个或更多个连续氨基酸残基、60个或更多个连续氨基酸残基、70个或更多个连续氨基酸残基、80个或更多个连续氨基酸残基、90个或更多个连续氨基酸残基、100个或更多个连续氨基酸残基、125个或更多个连续氨基酸残基、150个或更多个连续氨基酸残基、175个或更多个连续氨基酸残基、200个或更多个连续氨基酸残基、或250个或更多个连续氨基酸残基。术语“抗原结合片段”，特别是包括fab、f(ab')、f(ab')2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价(bivalent)单链抗体、单链噬菌体抗体、单抗体(unibody)、双抗体(diabody)、三抗体、四抗体、含有至少一个足以使特定抗原结合至多肽的免疫球蛋白片段的多肽等。所述片段可以合成生产，或通过酶促或化学消化完整的免疫球蛋白的酶生产，或者可以使用重组dna技术通过基因工程方法生产。生产方法在本领域中是众所周知的。
23.在本发明中，lrig
‑
1蛋白质是存在于调节性t细胞表面上由1091个氨基酸组成的跨膜蛋白，并且由细胞外或腔侧的富含亮氨酸的重复(leucine
‑
rich repeat,lrr)和三个免疫球蛋白样结构域，细胞跨膜序列和细胞质尾部组成。lrig基因家族包括lrig1、lrig2和lrig3，其间的氨基酸高度保守。lrig1基因在正常皮肤中高度表达，可在基底细胞和毛囊细胞中表达以调节上皮干细胞的增殖。因此，lrig1基因在维持表皮的稳态中起重要作用，并且其缺失可能会产生牛皮癣或皮肤癌。据报道，当lrig1所在的染色体3p14.3部分被切断时，有可能发展成癌细胞。事实上，发现lrig1在肾细胞癌和皮肤鳞状细胞癌中的表达明显降低。最近发现，仅有约20％至30％的癌症表达lrig
‑
1。另一方面，为了本发明的目的，lrig
‑
1蛋白可以是但不限于存在于人或小鼠中的蛋白质。
24.在本发明中，lrig
‑
1蛋白可以是但不限于由seq id no：1所示的人衍生的多肽或由seq id no：3所示的小鼠衍生的多肽。
25.另外，在本发明中，由seq id no：1所示的lrig
‑
1蛋白可以由seq id no：2所示的多核苷酸编码，但不限于此。
26.另外，在本发明中，由seq id no：3所示的lrig
‑
1蛋白可以由seq id no：4所示的多核苷酸编码，但不限于此。
27.在本发明中，所述结合分子可以是包含以下所述的结合分子：
28.重链可变区域，其包含由选自下组的氨基酸序列：seq id no：5、13、21和29组成的重链cdr1；由选自下组的氨基酸序列：seq id no:6、14、22和30组成的重链cdr2；由选自下组的氨基酸序列：seq id no：seq id no:7、15、23和31组成的重链cdr3；和
29.轻链可变区，其包含由选自下组的氨基酸序列：seq id no：8、16、24和32组成的cdr1；由选自下组的氨基酸序列：seq id no：9、17、25和33组成的轻链cdr2；由选自下组的氨基酸序列：seq id no：10、18、26和34组成的轻链cdr3。
30.在本发明中，所述结合分子可以是包含以下所述的结合分子：
31.重链可变区，其选自包含下组的(a)至(d)：
32.(a)含有由seq id no：5所示的重链cdr1，由seq id no：6所示的重链cdr2，和由seq id no：7所示的重链cdr3的重链可变区；
33.(b)含有由seq id no：13所示的重链cdr1，由seq id no：14所示的重链cdr2，和由
seq id no：15所示的重链cdr3的重链可变区；
34.(c)含有由seq id no：21所示的重链cdr1，由seq id no：22所示的重链cdr2，和由seq id no：23所示的重链cdr3的重链可变区；和
35.(d)含有由seq id no：29所示的重链cdr1，由seq id no：30所示的重链cdr2，和由seq id no：31所示的重链cdr3的重链可变区；以及
36.轻链可变区域，其选自包含下组的(e)至(h)：
37.(e)包含由seq id no：8所示的轻链cdr1，由seq id no：9所示的轻链cdr2，和由seq id no：10所示的轻链cdr3的轻链可变区；
38.(f)包含由seq id no：16所示的轻链cdr1，由seq id no：17所示的轻链cdr2，和由seq id no：18所示的轻链cdr3的轻链可变区；
39.(g)包含由seq id no：24所示的轻链cdr1，由seq id no：25所示的轻链cdr2，和由seq id no：26所示的轻链cdr3的轻链可变区；
40.(h)包含由seq id no：32所示的轻链cdr1，由seq id no：33所示的轻链cdr2，和由seq id no：34所示的轻链cdr3的轻链可变区。
41.在本发明中，所述结合分子可以是选自下组的(1)至(4)中的结合分子：
42.(1)包含含有由seq id no：5所示的重链cdr1，由seq id no：6所示的重链cdr2，和由seq id no：7所示的重链cdr3的重链可变区；以及含有由seq id no：8所示的轻链cdr1，由seq id no：9所示的轻链cdr2，和由seq id no：10所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子；
43.(2)包含含有由seq id no：13所示的重链cdr1，由seq id no：14所示的重链cdr2，和由seq id no：15所示的重链cdr3的重链可变区；以及含有由seq id no：16所示的轻链cdr1，由seq id no：17所示的轻链cdr2，和由seq id no：18所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子；
44.(3)包含含有由seq id no：21所示的重链cdr1，由seq id no：22所示的重链cdr2，和由seq id no：23所示的重链cdr3的重链可变区；以及含有由seq id no：24所示的轻链cdr1，由seq id no：25所示的轻链cdr2，和由seq id no：26所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子；
45.(4)包含含有由seq id no：29所示的重链cdr1，由seq id no：30所示的重链cdr2，和由seq id no：31所示的重链cdr3的重链可变区；以及含有由seq id no：32所示的轻链cdr1，由seq id no：33所示的轻链cdr2，和由seq id no：34所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子。
46.在本发明中，所述结合分子可以是包含以下的结合分子：
47.重链可变区，其包含选自下组的任一种氨基酸序列:seq id no:11、19、27和35；和
48.轻链可变区，其包含选自下组的任一种氨基酸序列：seq id no:12、20、28和36。
49.在本发明中，所述结合分子可以是选自下组的结合分子：
50.(i)包含由seq id no:11所示的重链可变区,和由seq id no:12所示的轻链可变区的结合分子；
51.(ii)包含由seq id no:19所示的重链可变区，和由seq id no:20所示的轻链可变区的结合分子；
52.(iii)包含由seq id no:27所示的重链可变区，和由seq id no:28所示的轻链可变区的结合分子；和
53.(iv)包含由seq id no:35所示的重链可变区，和由seq id no:36所示的轻链可变区的结合分子。
54.在本发明中，所述结合分子可进一步包含片段结晶(fc)区或恒定区。这里，fc区是igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区，或由其衍生。或者，fc区可以是杂化fc(hybrid fc)区。
55.在本发明中，所述fc区可以是哺乳动物衍生的igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区，并且可以优选为人衍生的igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc区。
56.作为本发明的一个示例，所述恒定区可以是由seq id no：37所示的小鼠衍生的igg2a恒定区，但不限于此。
57.作为本发明的一个示例，所述恒定区可以是由seq id no：38所示的小鼠衍生的免疫球蛋白κ(kappa)恒定区，但不限于此。
58.作为本发明的一个示例，所述恒定区可以是由seq id no：39或53所示的人衍生的igg1恒定区，但不限于此。
59.作为本发明的一个示例，所述恒定区可以是由seq id no：40所示的人衍生的免疫球蛋白κ(kappa)恒定区，但不限于此。
60.作为本发明的一个示例，所述恒定区可以是由seq id no：41所示的人衍生的igg2恒定区，但不限于此。
61.作为本发明的一个示例，所述恒定区可以是由seq id no：42所示的人衍生的igg3恒定区，但不限于此。
62.作为本发明的一个示例，所述恒定区可以是由seq id no：43所示的人衍生的igg4恒定区，但不限于此。
63.作为本发明的一个示例，所述fc区可以是人衍生的免疫球蛋白λ恒定区，但不限于此。
64.在本发明中，所述“杂化fc”可以源自人igg亚类的组合或人igd和igg的组合。在杂化fc与生物活性分子、多肽或类似物结合的情况下，杂化fc不仅具有增加生物活性分子的血清半衰期的效果，而且当编码fc
‑
多肽融合蛋白的核苷酸序列被表达时，还增加了多肽的表达水平。
65.作为本发明的示例，所述杂化fc区可以是由seq id no：44所示的杂化fc，但不限于此。
66.在本发明的结合分子中，fc或恒定区可以通过接头(linker)连接到可变区。这里，所述接头可以与fc或恒定区的c末端连接，并且本发明的结合分子的n
‑
末端可以与接头连接。但是，本发明不限于此。
67.在本发明中，所述“接头(linker)”可以含有可被在有靶疾病的组织或细胞中过表达的酶切割的序列。在如上所述的过表达酶可以裂解接头的情况下，可以有效地防止多肽的活性因fc或恒定区域而减少。在本发明中，接头的实例可以优选地是肽接头，其由位于在血液中存在最丰富的人白蛋白的第282位至第314位部分的33个氨基酸组成，更优选地肽接头由位于人白蛋白的第292位至第304位部分的13个氨基酸组成。这一部分大多以三维结构暴露于外部，因此在体内诱导免疫反应的可能性最小。但是，所述接头不限于此。
68.本发明的结合分子可以进一步包含重链恒定区，其由选自下组的氨基酸序列组成：seq id no：37、39、41、42、43、44和55。
69.本发明的结合分子可以进一步包含轻链恒定区，其由选自下组的氨基酸序列组成：seq id no：38或40。
70.本发明的结合分子可以进一步包括：
71.由seq id no：37所示的氨基酸序列组成的重链恒定区；和
72.由seq id no：38所示的氨基酸序列组成的轻链恒定区。
73.本发明的结合分子可以进一步包括：
74.包含seq id no：39、41、42、43和55所示的氨基酸序列的重链恒定区；和
75.包含seq id no：40所示的氨基酸序列的轻链恒定区。
76.本发明的结合分子可以进一步包括：
77.包含seq id no：44所示的氨基酸序列的重链恒定区。
78.本发明的结合分子可以是选自下组的结合分子：
79.包含由seq id no：45所示的重链，和由seq id no：46所示的轻链的结合分子；
80.包含由seq id no：47所示的重链，和由seq id no：48所示的轻链的结合分子；
81.包含由seq id no：49所示的重链，和由seq id no：50所示的轻链的结合分子；和
82.包含由seq id no：51所示的重链，和由seq id no：52所示的轻链的结合分子。
83.本发明的结合分子可以是包含由seq id no：53所示的重链，和由seq id no：54所示的轻链的结合分子。
84.本发明的结合分子的特征是抗体，但不限于此。所述抗体包括所有单克隆抗体、全长抗体或作为抗体一部分的抗体片段，其具有结合lrig
‑
1蛋白的能力，并且与本发明的结合分子竞争结合lrig
‑
1上的表位。
85.如本文所用，术语“抗体”是指用作特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。为了本发明的目的，所述抗原可以是存在于调节性t细胞表面上的lrig
‑
1蛋白质。优选地，所述抗体可以特异性地识别lrig
‑
1蛋白的富含亮氨酸的区域或免疫球蛋白样结构域，但不限于此。
86.在本发明中，所述“免疫球蛋白”具有重链和轻链，并且每个重链和轻链包括恒定区和可变区。每个轻链和重链的可变区包含三个高变区，称为互补决定区域(下文中称为“cdr”)和四个框架区。cdr主要作用是与抗原上的表位结合。每种链的cdr通常从n
‑
末端开始依次称为cdr1、cdr2和cdr3，并且还由特定cdr所在的链来区分。
87.另外，如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本相同的抗体群体获得的单分子组分的抗体分子，并且对特定表位具有单一结合特异性和亲和力。
88.在本发明中，所述“全长抗体”的结构中具有两个全长轻链和两个全长重链，其中每个轻链通过二硫键连接到重链，包括iga、igd、ige、igm和igg。igg包括其亚型，igg1、igg2、igg3和igg4。
89.另外，如本文所用，术语“抗原片段”是指保留抗原结合功能的片段，并且包括fab、fab'、f(ab')2、fv等。所述fab的结构中具有轻链和重链的可变区，轻链的恒定区，和重链的第一恒定区域(ch1结构域)，并具有一个抗原结合位点。此外，fab'与fab不同的点在于fab'在重链ch1结构域的c
‑
末端具有包含至少一个半胱氨酸残基的铰链区域。f(ab')2抗体通过
在fab’铰链区的半胱氨酸残基处形成二硫键来生产。fv(可变片段)是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链fv(dsfv)被配置为重链区和轻链区通过二硫键彼此连接，并且单链fv(scfv)被配置为重链可变区域和轻链可变区彼此共价连接，通常通过肽接头。抗体片段可通过fab或f(ab')2片段在使用蛋白水解酶(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)的情况下获得，并且可以通过基因重组技术生产。
90.此外，在本发明中，抗体可以是但不限于嵌合抗体、人源化抗体、二价抗体、双特异性分子、微抗体、域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、单抗体、双抗体、三抗体、或四抗体，或其片段。
91.在本发明中，“嵌合抗体”是通过重组小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区而获得的抗体，并且与小鼠抗体相比具有大大改善的免疫应答。
92.另外，如本文所用，术语“人源化抗体”是指通过改变衍生自非人类物种的抗体的蛋白质序列，使得蛋白质序列类似于在人体中天然产生的抗体变体而获得的抗体。例如，人源化抗体可以如下制备。可以用人抗体衍生的fr和小鼠衍生的cdr重组以制备人源化的可变区，并且人源化可变区可以与优选的人抗体的恒定区重组以制备人源化抗体。
93.在本发明中，所述结合分子可以以双特异性抗体或双特异性抗原结合片段的形式提供，其能够与lrig
‑
1蛋白结合并与另一种蛋白质结合。
94.在本发明中，所述双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可包含本发明的结合分子。作为本发明的一个示例，双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含能够结合lrig
‑
1蛋白质的抗原结合结构域，其中能够与lrig
‑
1结合的抗原结合结构域可包含或由本发明的结合分子组成。
95.本发明提供的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包括抗原结合域，所述抗原结合域是能够结合本发明所述lrig
‑
1蛋白的结合分子，以及能够结合另一个靶蛋白的抗原结合域。这里，能够结合另一种靶蛋白的抗原结合结构域可以是能够与除lrig
‑
1蛋白之外的蛋白质(例如pd
‑
1或细胞表面受体)结合的抗原结合结构域。但是，所述抗原结合结构域不限于此。
96.本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以以任何合适的形式提供，例如，在kontermann mabs 2012,4(2)：182
‑
197中述及，其通过引用整体并入本文。例如，所述双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体缀合物(例如igg2、f(ab’)2或covx
‑
体(covx
‑
body))、双特异性igg或igg样分子(例如igg、scfv4
‑
ig、igg
‑
scfv、scfv
‑
igg、dvd
‑
ig、igg
‑
svd、svd
‑
igg，或2in 1
‑
igg、mab2或tandemab通用lc)，不对称双特异性igg或igg样分子(例如，kih igg、kih igg通用lc、crossmab、igg
‑
scfab、mab
‑
fv、电荷对或seed
‑
体(seed
‑
body))，小双特异性抗体分子(例如双体抗体(db)、dsdb、dart、scdb、tandab、串联scfv(tafv)、串联dab/vhh、三体、三头、fab
‑
scfv或f(ab’)2
‑
scfv2)、双特异性fc和ch3融合蛋白(例如tafv
‑
fc、双
‑
双体抗体、scdb
‑
ch 3、scfv
‑
fc
‑
scfv、hcab
‑
vhh、scfv
‑
kih
‑
fc或scfv
‑
kih
‑
ch3)，或双特异性融合蛋白(例如scfv2
‑
白蛋白、scdb
‑
白蛋白、tafv毒素、dnl
‑
fab3、dnl
‑
fab4
‑
igg、dnl
‑
fab4
‑
igg
‑
细胞因子2)。特别地，参见kontermann mabs 2012,4(2)：182
‑
19中的图2。根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以由本领域技术人员设计和制备。
97.在本发明中制备双特异性抗体的方法包括形成还原二硫化物或非还原硫醚键，以
及如上所述的抗体或抗体片段的化学交联，例如，在segal和bast，2001，双特异性抗体的生产，《免疫学最新实验方法》，14：iv：2.13：2.13.1
‑
2.13.16中所述，其全部内容通过引用并入本文。例如，n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(
‑2‑
吡啶二硫基)
‑
丙酸酯(spdp)可以被用于例如通过铰链区的sh
‑
基团化学交联fab片段，以产生二硫化物连接的双特异性f(ab)2异二聚体。
98.另外，用于在本发明中制备双特异性抗体的替代方法包括将产生抗体的杂交瘤与例如聚乙二醇融合，以产生能够分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞，如d.m.和bast，b.j.2001，双特异性抗体的生产，《免疫学最新实验方法》，14:iv:2.13:2.13.1
‑
2.13.16中所述。
99.根据本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可以通过，例如编码抗原结合分子的多肽的核酸构建体表达来重组生产，如《抗体工程：方法和方案》，第二版(humana出版社，2012)，第40章：生产双特异性抗体：二抗体和串联scfv(hornig和farber
‑
schwarz)，或french，如何制备双特异性抗体，分子医学方法，med.2000；40：333
‑
339中所述，两者在此通过引用整体并入本文。
100.例如，可以通过分子克隆技术制备dna构建物，其包含编码两个抗原结合域的轻链和重链可变域序列(即，能够结合pd
‑
1抗原结合域的轻链和重链可变域，和能够结合另一靶蛋白的抗原结合片段的轻链和重链可变域)，并包含编码在抗原结合域之间的合适的接头或二聚结构域的序列。随后，重组双特异性抗体可以通过在合适的宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中的构建体(例如，在体外)表达生产，然后表达的重组双特异性抗体可以被任选地纯化。
101.抗体可以通过亲和成熟过程生产，其中生产的修饰抗体与未修饰的亲本抗体相比，具有改善的抗原亲和力。亲和成熟的抗体可以通过本领域已知的方法生产，例如在marks等人，rio/technology 10:779
‑
783(1992)；barbas等人，美国科学院学报91：3809
‑
3813(1994)；schier等人，基因169：147
‑
155(1995)；yelton等人，免疫杂志，155：1994
‑
2004(1995)；jackson等人，免疫杂志154(7)：3310
‑
159(1995)；以及hawkins等人，分子生物学杂志226:889
‑
896(1992)中所述。
102.另外，本发明中提供的结合分子可包括氨基酸序列的变体，只要所述变体可以特异性结合lrig
‑
1蛋白质。例如，为了改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质，可以对抗体的氨基酸序列进行修饰。这种修饰包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或替代。
103.这种氨基酸变化是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷和大小。根据对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析，可以看出精氨酸、赖氨酸和组氨酸是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，可以说精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是生物功能性的等同物。
104.在引入变化时，可以考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。每种氨基酸根据其疏水性和电荷分配了亲水性指数：异亮氨酸( 4.5)；缬氨酸( 4.2)；亮氨酸( 3.8)；苯丙氨酸( 2.8)；半胱氨酸/胱氨酸( 2.5)；甲硫氨酸( 1.9)；丙氨酸( 1.8)；甘氨酸(
‑
0.4)；苏氨酸(
‑
0.7)；丝氨酸(
‑
0.8)；色氨酸(
‑
0.9)；酪氨酸(
‑
1.3)；脯氨酸(
‑
1.6)；组氨酸(
‑
3.2)；谷氨酸(
‑
3.5)；谷氨酰胺(
‑
3.5)；天冬氨酸(
‑
3.5)；天冬酰胺(
‑
3.5)；赖氨酸(
‑
3.9)；和精氨酸(
‑
4.5)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能方面具有重要意义。众所周知，具有具有相似亲水性指数的氨基酸的取代使得蛋白质保留类似的生物活性。在参考亲水性指数引入变化的情况下，取代在亲水性指数差异优选在
±
2内，更优选在
±
1内，甚至更优选在
±
0.5内的氨基酸之间进行。
105.同时，众所周知，具有相似亲水性值的氨基酸之间的取代会导致具有等效生物活性的蛋白质。如在美国专利no.4,554,101中所公开的，各氨基酸残基已被分配以下亲水性值：精氨酸( 3.0)；赖氨酸( 3.0)；天冬氨酸( 3.0
±
1)；谷氨酸( 3.0
±
1)；丝氨酸( 0.3)；天冬酰胺( 0.2)；谷氨酰胺( 0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(
‑
0.4)；脯氨酸(
‑
0.5
±
1)；丙氨酸(
‑
0.5)；组氨酸(
‑
0.5)；半胱氨酸(
‑
1.0)；甲硫氨酸(
‑
1.3)；缬氨酸(
‑
1.5)；亮氨酸(
‑
1.8)；异亮氨酸(
‑
1.8)；酪氨酸(
‑
2.3)；苯丙氨酸(
‑
2.5)；色氨酸(
‑
3.4)。在参考亲水性指数引入变化的情况下，取代在亲水性指数差异优选在
±
2内，更优选在
±
1内，甚至更优选在
±
0.5内的氨基酸之间进行。
106.在本领域中已知，蛋白质中的氨基酸交换不完全改变分子活性(h.neurath，r.l.hill，蛋白质，学术出版社，纽约(1979))。最常见的交换是氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、gln/glu之间的交换。
107.鉴于上述具有生物等效活性的变化，其可以被解释为本发明的结合分子还包括与序列表中列出的序列具有实质性同一性的序列。
108.如本文所用，术语“实质性同一性”是指当本发明的序列与任何其他序列比对时，序列显示至少61％的同源性，更优选70％的同源性，更优选80％的同源性，最优选90％的同源性，使得它们最大限度地彼此对应，并且通过使用本领域通常使用的算法来分析比对序列。用于比较序列的比对方法是本领域已知的。用于比对的各种方法和算法在smith和waterman,adv.appl.math.2：482(1981)；needleman和wunsch，j.mol.bio.48：443(1970)；pearson和lipman，methods in mol.biol.24：307
‑
31(1988年)；higgins和sharp，gene73：237
‑
44(1988)；higgins和sharp,cabios5:151
‑
3(1989)；corpet等人，nuc.acids res.16：10881
‑
90(1988)；huang等人，comp.appl.biosci.8：155
‑
65(1992)；和pearson等人，meth.mol.biol.24,307
‑
31(1994)中公开。ncbi基本局部比对搜索工具(blast)(altschul等人，j.mol.biol.215：403
‑
10(1990))可从国家生物信息中心(nbci)等访问，并且可以与互联网上的blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx相结合使用。blsat可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/中访问。序列同源性比较方法可以使用此程序在线识别(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html)。
109.在本发明中，结合分子，优选抗体，可以通过生产抗体的传统方法生产，并且可以通过亲和成熟生产。
110.如本文所用，术语“亲和力成熟”是指在免疫反应过程中活化的b细胞产生对抗原具有增强亲和力的抗体的过程。出于本发明的目的，亲和力成熟允许抗体或抗体片段由于亲和力成熟而产生，这一亲和力成熟基于发生在自然界相同过程的突变和选择原则。
111.在本发明中提供的结合分子，优选抗体，可以抑制免疫细胞，特别是调节性t免疫细胞(treg细胞)的功能，从而有效地预防、改善或治疗癌症。
112.在本发明中，术语“癌症”指或指示一种不以典型方式调节哺乳动物细胞生长为特
征的生理状态。在本发明中待预防、改善或治疗的癌症可以是是实体器官内细胞异常生长而形成团聚体的实体瘤，并且可以是但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移性癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌等，取决于实体器官的位置，优选是黑素瘤。
113.根据本发明的另一个实施方式，提供了编码本发明中提供的结合分子的核酸分子。
114.本发明的核酸分子包括将本发明提供的结合分子的氨基酸序列翻译为多核苷酸序列而获得的所有核酸分子，正如本领域技术人员所知的。因此，通过开放阅读框(orf)可以制备各种多核苷酸序列，并且所有这些多核苷酸序列也包含在本发明的核酸分子中。
115.根据本发明的又一个实施方式，提供了一种表达载体，其中插入了本发明中提供的分离的核酸分子。
116.在本发明中，“载体”是一种核酸分子，能够运输与之相连的另一种核酸。一种类型的载体是“质粒”，指环状双链dna，其中可以连接额外的dna片段。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，可以将额外的dna片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在引入宿主细胞时，可以将其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载体”或简单的“表达载体”。通常，可用于重组dna技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
117.本发明中表达载体的具体实例可以选自但不限于下组：商业上广泛使用的pcdna载体、f、r1、rp1、col、pbr322、tol、ti载体；粘粒；噬菌体，如λ、人字型(lambdoid)、m13、mu、p1 p22、qμμ、t
‑
even、t2、t3、t7；植物病毒。本领域技术人员已知的任何表达载体可作为表达载体用于本发明，并且根据靶宿主细胞的性质选择表达载体。宿主细胞中载体的导入可以通过磷酸钙转染、病毒感染、deae
‑
葡聚糖介导的转染，脂质体转染或电穿孔来进行。但是，本发明不限于此，并且本领域技术人员可以采用和使用适合于使用的表达载体和宿主细胞的导入方法。载体可以优选含有至少一个选择标记。但是，本发明不限于此，并且根据是否生产产品，可以使用不包含选择标记的载体进行选择。根据靶标宿主细胞来选择选择标记，其使用本领域技术人员已知的方法进行，因此本发明在其上没有限制。
118.在本发明中，为了促进核酸分子的纯化，可以将标签序列插入并融合到表达载体中。标签包括但不限于六组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或flag标签，以及本领域技术人员已知的任何标签，其便于纯化并可用于本发明。
119.根据本发明的又一个实施方式，提供了用本发明中提供的表达载体转染的宿主细胞系。
120.在本发明中，所述“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是多肽插入物掺入载体的受体(recipient)。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于自然的、偶然的或有意的突变，子代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因组dna补体上)。宿主细胞包括用本文的多核苷酸在体内转染的细胞。
121.在本发明中，所述宿主细胞可包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞来源的细胞，
并且可以是例如细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母细胞和毕赤酵母(pichia pastoris)；昆虫细胞如果蝇和夜蛾sf9细胞；动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、sp2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴细胞、cos、nso(小鼠骨髓瘤)、293t、鲍氏黑色素瘤细胞、ht
‑
1080、幼仓鼠肾(baby hamster kidney，bhk)细胞、人胚胎肾(hek)细胞，或perc.6(人视网膜细胞)；或植物细胞。但是，所述宿主细胞不限于此，并且可以使用本领域技术人员已知的任何细胞用作宿主细胞系。
122.在本发明中，所述转染方法可以是将所需载体注入宿主细胞中的任何方法，并且包括能够将载体注入宿主细胞中的任何已知方法。转染方法的实例可以包括但不限于，cacl2介导的转染、电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染、deae
‑
葡聚糖处理、基因枪和病毒介导的转染。
123.根据本发明的又一个实施方式，提供了包含本发明中提供的抗体和药物的抗体
‑
药物缀合物(adc)。
124.如本文所用，术语“抗体
‑
药物缀合物(adc)”是指药物和抗体彼此化学连接，而不会降低抗体和药物的生物活性的形式。在本发明中，抗体
‑
药物缀合物表示一种药物与抗体的重链和/或轻链的n
‑
末端氨基酸残基结合的形式，具体地，一种药物与抗体的重链和/或轻链的n
‑
末端的α
‑
胺基结合的形式。
125.如本文所用，术语“药物”可以指具有对细胞有某种生物活性的任何物质，这一概念包括dna、rna或肽。所述药物可以具有包含能够与α
‑
胺基反应并交联的反应基团的形式，还包括包含能够与α
‑
胺基反应并交联的反应基团并与接头相连的形式。
126.在本发明中，能够与α
‑
胺基进行反应和交联的反应性基团的实例的类型没有特别限制，只要反应性基团可以与抗体的重链或轻链n
‑
末端的α
‑
胺基反应和交联。反应性基团包括本领域已知的与胺基反应的所有类型。反应性基团可以是例如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、nhs酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸盐、芳基卤化物、亚胺酯、碳二酰亚胺、酸酐和氟苯基酯中的任何一个，但是不限于此。在本发明中，所述药物是一种能够治疗癌症(被lrig
‑
1抗体靶向的疾病)的药物，所述药物可以是抗癌剂。
127.在本发明中，所述抗癌剂可以选自但不限于下组：氮芥、伊马替尼(imatinib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、利妥昔单抗(rituximab)、厄洛替尼(erlotinib)、纳拉替尼(neratinib)、纳拉替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、尼洛替尼(nilotinib)、司马沙尼(semaxanib)、波舒替尼(bosutinib)、阿西替尼(axitinib)、西地那尼(cediranib)、来他替尼(lestaurtinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉非替尼(gefitinib)、索非替尼(bortezomib)、舒尼替尼(sunitinib)、卡铂(carboplatin)、索拉非尼(sorafenib)、贝伐单抗(bevacizumab)、顺铂(cisplatin)、西妥昔单抗(cetuximab)、槲寄生(viscum album)、天冬酰胺酶(asparaginase)、维甲酸(tretinoin)、羟基尿素(hydroxycarbamide)、达沙替尼(dasatinib)、雌莫司汀(estramustine)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依铂(heptaplatin)、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶(amsacrine)、阿仑单抗(alemtuzumab)、丙卡巴肼(procarbazine)、前列地尔(alprostadil)、硝酸钬壳聚糖(holmium nitrate chitosan)、吉西他滨(gemcitabine)、多西氟哌啶(doxifluridine)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、卡培他滨(capecitabine)、吉美拉西(gimeracil)、奥替拉西(oteracil)、阿扎
胞苷(azacitidine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、尿嘧啶(uracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟达拉滨(fludarabine)、恩西他滨(enocitabine)、氟他酰胺(flutamide)、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、克拉屈滨(cladribine)、卡莫呋(carmofur)、拉替曲塞(raltitrexed)、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、伊立替康(irinotecan)、贝洛替康(belotecan)、托泊替康(topotecan)、长春瑞滨(vinorelbine)、依托泊苷(etoposide)、长春碱(vinblastine)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(dactinomycin)、吡柔比星(pirarubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、培洛霉素(peplomycin)、替莫罗莫司(temsirolimus)、替莫唑胺(temozolomide)、白消安(busulfan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、环磷酰胺、(melphalan)、美法仑(altretamine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、噻替帕(thiotepa)、尼莫斯汀(nimustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、米托固醇(mitolactol)、亚叶酸(leucovorin)、维甲酸(tretinoin)、依西美坦(exemestane)、氨基谷氨酰胺(aminogluthetimide)、阿那格雷(anagrelide)、奥拉帕尼(olaparib)、长春瑞滨(navelbine)、法倔唑(fadrozole)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、睾内酯(testolactone)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、沃罗唑(vorozole)、比卡鲁他胺(bicalutamide)、洛莫司汀(lomustine)、5fu(5
‑
氟尿嘧啶)、伏立诺他(vorinostat)、恩提诺特(entinostat)、和卡莫司汀(carmustine)。
128.根据本发明的另一个实施方式，提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含在本发明中提供的结合分子或抗体
‑
药物缀合物(adc)作为活性成分。
129.在本发明中提供的结合分子，优选抗体，可以抑制免疫细胞，特别是调节性t免疫细胞(treg细胞)的功能，从而有效地预防、改善或治疗癌症。
130.在本发明中，术语“癌症”指或指示一种不以典型方式调节哺乳动物细胞生长为特征的生理状态。在本发明中待预防、改善或治疗的癌症可以是是实体器官内细胞异常生长而形成团聚体的实体瘤，所述实体瘤可以是但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移性癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌等，并且取决于实体器官的位置，优选是黑素瘤。另一方面，在本发明中，所述“预防”包括但不限于，任何使用本发明的药物组合物阻断疾病症状、或抑制或延缓疾病症状的行为。
131.另外，在本发明中，所述“治疗”可以包括但不限于，任何使用本发明的药物组合物改善或有利地改变疾病症状的行为。
132.在本发明中，所述药物组合物的特征可以为胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、软膏、粉末或饮料的形式，并且药物组合物的特征可以是靶向人体的。
133.在本发明中，所述药物组合物可以以口服制剂的形式配制，如粉末、颗粒剂、胶囊、片剂和水悬液，按照常规方法分别以外用制剂、栓剂和无菌注射溶液的形式制备并使用。但是，所述药物组合物不限于此。本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，粘合剂、助溶剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、颜料、香料等可用于口服给药；缓冲液、保存剂、疼痛缓解剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等可用于注射混合物；以及碱、赋形剂、润滑剂、保存剂等可用于局部给药。通过与如上所述的药学上可接受的载体混合，可以以各种方式制备本发明的药物组合物的制剂。例如，对于口
服给药，药物组合物可以以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片等形式配制。对于注射，药物组合物可以以单位剂量安瓿或多种剂型的形式配制。或者，可以将药物组合物配制成溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂等。
134.同时，作为适于制备制剂的载体、稀释剂或赋形剂的例子，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶(gum acacia)、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡啶酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等可以被使用。另外，还可以包括填料、抗凝血剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
135.本发明的药物组合物的给药途径包括但不限于口服、静脉、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、局部、舌下或直肠途径。口服或肠胃外给药是优选的。
136.在本发明中，所述“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉、肌肉内、关节内、囊内、胸骨内、硬膜内、皮损内和颅内注射或输液技术。本发明的药物组合物也可以以栓剂的形式用于直肠给药。
137.本发明的药物组合物可以根据各种因素而变化，包括所使用的某种化合物的活性、患者年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合，以及待预防或治疗某种疾病的严重程度。药物组合物的剂量取决于患者的病症、体重、疾病严重程度、药物形式、给药途径和持续时间，并且可以由本领域技术人员适当地选择。药物组合物可以每天以0.0001至50mg/kg或0.001至50mg/kg施用。给药可以每天一次或每天几次。剂量不旨在任何情况下限制本发明的范围。本发明的药物组合物可以以药丸、糖衣片剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料或悬浮液的形式配制。
138.根据本发明的又一个实施方式，提供了一种用于预防、改善或治疗癌症的方法，其包含给药步骤，给予个体药学上有效量的本发明提供的结合分子或抗体
‑
药物缀合物(adc)。
139.在本发明中提供的结合分子，优选抗体，可以抑制免疫细胞，特别是调节性t免疫细胞(treg细胞)的功能，从而有效地预防、改善或治疗癌症。
140.在本发明中，所述“个体”是疑似患有免疫相关疾病的个体，并且所述疑似患有癌症或免疫相关疾病的个体是哺乳动物，例如人类、小鼠和家畜，其已经发展或可能发展为所讨论的疾病。但是，包括但不限于施用本发明中提供的结合分子或抗体
‑
药物缀合物任何个体。
141.本发明的方法可包括施用药学上有效量的本发明提供的结合分子或抗体
‑
药物缀合物。合适的每日施用总量可以由参与的医师或兽医在适当的医疗判断范围内决定，并且可以分一次或几次进行给药。然而，出于本发明的目的，特定患者的特异性治疗有效量优选地根据各种因素不同地应用，所述因素包括要达到的类型和反应程度，包含上述特异性活性成分的组合物，包括是否视情况与其他药剂一起使用、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、包含上述特异性活性成分的组合物的分泌率、治疗持续时间，以及同时使用的药物或与特定组合物联合使用，以及医学领域中众所周知的类似因素。
142.同时，用于预防或治疗免疫相关疾病的方法可以是但不限于联合疗法，包括进一
步施用对一个或多个疾病具有治疗活性的化合物或物质。
143.在本发明中，“联合”应理解为表示同时、单独或顺序给药。在顺序或单独的方式给药的情况下，应间隔施用第二组分，使得不会失去联合的有益效果。
144.在本发明中，所述结合分子或抗体
‑
药物缀合物的剂量可以是但不限于约0.0001μg至500mg每千克患者体重。
145.发明的有益效果
146.根据本发明的特异性结合lrig
‑
1蛋白的结合分子，优选抗体，能够抑制调节性t免疫细胞的功能；以有效预防、改善或治疗癌症，特别是实体瘤。
147.另外，根据本发明的特异性结合lrig
‑
1蛋白结合分子，优选抗体，与过去商业上可获得的lrig
‑
1的抗体相比，具有更有效地靶向lrig
‑
1蛋白的优点，还具有非常好的与之结合的能力。
148.附图简要说明
149.图1示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1蛋白的结构。
150.图2示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1蛋白的结构。
151.图3示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1蛋白表位的预测结果。
152.图4示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1蛋白表位的预测结果。
153.图5示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1mrna的表达水平。
154.图6示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1mrna的表达水平。
155.图7示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1mrna的表达水平。
156.图8示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1、lrig
‑
2和lrig
‑
3mrna的表达水平。
157.图9示出了根据本发明的一个实施例，比较调节性t细胞和非调节性t细胞中lrig
‑
1蛋白的表达水平获得的结果。
158.图10示出了根据本发明的一个实施例中的调节性t细胞表面上的lrig
‑
1蛋白的表达。
159.图11示出了根据本发明的一个实施例，通过分析lrig
‑
1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)与lrig
‑
1蛋白的结合能力获得的结果。
160.图12示出了根据本发明的一个实施例，通过分析lrig
‑
1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)在调节性t细胞中调节lrig
‑
1蛋白诱导的stat3磷酸化的机制而获得的结果。
161.图13示出了根据本发明的一个实施例的lrig
‑
1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)对癌症的治疗效果的实验设计。
162.图14示出了根据本发明的一个实施例，通过分析lrig
‑
1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)对癌症的治疗效果获得的结果。
具体实施方式
163.根据本发明的一个实施方式，提供了一种结合分子，其特异性结合lrig
‑
1(富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1)蛋白，所述结合分子包括：
164.重链可变区域，其包含由选自下组的氨基酸序列：seq id no：5、13、21和29组成的重链cdr1；由选自下组的氨基酸序列：seq id no:6、14、22和30组成的重链cdr2；由选自下
组的氨基酸序列：seq id no:7、15、23和31组成的重链cdr3；和
165.轻链可变区，其包含由选自下组的氨基酸序列：seq id no：8、16、24和32组成的轻链cdr1；由选自下组的氨基酸序列：seq id no：9、17、25和33组成的轻链cdr2；由选自下组的氨基酸序列：seq id no：10、18、26和34组成的轻链cdr3。
166.在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地描述本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。
167.实施例
168.[制备实施例1]t细胞亚群细胞培养
[0169]
为了鉴定lrig
‑
1蛋白是否仅在调节性t细胞(treg)中表达，制备了t细胞的亚群，th0、th1、th2、th17和itreg。itreg是指在含有下列组合物的培养基中人工诱导分化的细胞，不像ntreg是自然分离出来的。
[0170]
诱导t细胞的亚群分化成各种细胞，首先通过从小鼠脾脏分离初始t细胞，然后使含有10％胎牛血清(fbs；hyclone，洛根市，犹他州)的rpmi1640(英杰gibco，纽约州格兰德岛)营养培养基并进一步含有下表1的相应成分，并在37℃，5％co2的培养箱中孵育72小时。
[0171]
[表1]
[0172]
分化细胞组分th0抗cd3，抗cd28th1il
‑
12，抗il
‑
4抗体th2il
‑
4，抗ifnβth17il
‑
6，tgfβ，抗ifnβ，抗il
‑
4itregil
‑
2，tgfβ
[0173]
[实施例1] lrig
‑
1的结构分析
[0174]
预测lrig
‑
1蛋白的细胞外结构域的三维空间结构，以产生针对lrig
‑
1蛋白的抗体，一种调节性t细胞的表面蛋白。
[0175]
首先，为了预测表位(epitope)的基础序列，uniprot(http://www.uniprot.org)和rcsb蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)的工具用于预测lrig
‑
1蛋白的细胞外结构域(ecd)的三维空间结构，使ecd的结构被鉴定出来。然后，结果如图1和图2所示。
[0176]
如图1中所示，在lrig
‑
1蛋白的细胞外结构域中，有lrr1至lrr15的共15个亮氨酸富集区存在于lrig
‑
lrr结构域(41至494位的氨基酸序列)中。每个lrr结构域由23至27个氨基酸组成，存在3至5个亮氨酸。
[0177]
另外，如图2所示，在lrig
‑
1蛋白的细胞外结构域中，三种免疫球蛋白样结构域存在于lrig
‑
1蛋白的氨基酸序列的494
‑
781位处。
[0178]
[实施例2]lrig
‑
1表位氨基酸序列的预测
[0179]
使用ellipro服务器(http://tools.iedb.org/ellipro/)进行上述碱基序列的预测，这是基于lrig
‑
1蛋白的结构的表位预测软件。使用ellipro搜索引擎，因为已知它对应于现存预测表位的算法中最可靠的搜索引擎。
[0180]
将实施例1中分析的细胞外结构域输入到表位预测软件中，然后在图3和4中示出
了预测表位的连续或不连续的氨基酸序列。
[0181]
如图3和图4所示，预测了总共22个连续表位氨基酸序列，以及预测了总共8个不连续的表位氨基酸序列。
[0182]
[生产实施例1至8]生产lrig
‑
1蛋白的特异性单克隆抗体
[0183]
生产根据本发明的lrig
‑
1蛋白特异性抗体。本发明的抗体不是通过指定特定的表位产生，而是作为能够与lrig
‑
1蛋白质上的任何位点结合的抗体产生。
[0184]
为了生产抗体，制备了表达lrig
‑
1蛋白的细胞。更具体地，对应于seq id no：2的dna片段和pcdna(hygro)用裂解酶切割，在37℃下孵育，并连接以产生插入lrig
‑
1蛋白的dna序列的pcdna。由此产生的插有seq id no：2的pcdna通过转染导入l细胞，使lrig
‑
1蛋白质在l细胞的表面上表达。
[0185]
能够结合细胞表面表达的lrig
‑
1的轻链和重链的氨基酸序列从人scfv文库中选择，从而总共选择了八个重链和轻链。
[0186]
所选择的重链和轻链的氨基酸序列与mlgg2a fc区或人igg1 fc区融合，以产生单克隆抗体。由此产生的单克隆抗体的序列示于下表2中。
[0187]
[表2]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191][0192]
[实施例3]鉴定调节性t细胞中lrig
‑
1mrna的特异性表达
[0193]
验证lrig
‑
1蛋白是否可以作为调节性t细胞的生物标志物。
[0194]
对于验证，使用磁体活化的细胞分选(macs)通过cd4珠子从大鼠的脾脏分离cd4
t细胞。随后，使用cd25抗体与荧光激活的细胞分选仪(facs)分离出调节性t(cd4

cd25
t)细胞和非调节性t(cd4

cd25
‑ t)细胞。对于各个细胞和在制备实施例1中分化的细胞，使用trizol提取mrna，根据制造商提供的方案，使用gdna提取试剂盒(qiagen)从基因组rna中除去gdna。通过bdsprint cdna合成试剂盒(clonetech)将去除gdna的mrna合成为cdna。
[0195]
进行实时聚合酶链反应(rt pcr)以定量鉴定cdna中lrig
‑
1mrna的表达水平。
[0196]
使用下表3所示的引物，按照供应商提供的实验方案使用sybr green(分子探针)在40次循环(包括95℃下3分钟，61℃下15秒，72℃下30秒)条件下进行实时聚合酶链反应，通过δδct方法计算相对基因表达水平，并使用hprt标准化。结果如图5到图8所示。
[0197]
[表3]
[0198][0199]
如图5中所示，可以看出，调节性t(cd4

cd25
t)细胞中lrig
‑
1的表达比非调节t(cd4

cd25
‑ t)细胞高出18.1倍。这比lag3和ikzf4(先前已知的调节t细胞的标记)的表达水平高约10倍。
[0200]
另外，如图6和图7所示，与其他类型的免疫细胞相比，lrig
‑
1mrna的表达在调节t细胞中非常高，特别是与诱导的调节性t细胞(itreg细胞)相比，在天然分离的调节性t细胞(ntreg)中非常高。
[0201]
另外，如图8所示，lrig
‑
1的表达在对应于lrig家族的lrig
‑
1、lrig
‑
2和lrig
‑
3中最高。
[0202]
根据上述结果，可以看出，根据本发明的lrig
‑
1蛋白在调节性t细胞，特别是天然存在的调节性t细胞中特异性地表达。
[0203]
[实施例4]鉴定调节性t细胞中lrig
‑
1蛋白的特异性表达
[0204]
鉴定了从lrig
‑
1mrna表达的lrig
‑
1蛋白是否在调节性t细胞中特异性表达。
[0205]
使用foxp3
‑
rfp敲入小鼠，foxp3
‑
rfp是通过将红色荧光蛋白(rfp)耦合到foxp3启动子(一种调节性t细胞特异性的转录因子)而获得，通过cd4珠子使用磁体活化细胞分选(macs)在小鼠的脾脏中分离cd4
t细胞。随后，使用rfp蛋白，通过荧光激活的细胞分选仪(facs)分离来获得调节性t(cd4

rfp
t)细胞和非调节性t(cd4

rfp
‑
t)细胞。将各细胞用所购买的lrig
‑
1抗体染色，并将同种型匹配的对照抗体染色作为阴性对照，用荧光激活的细胞分选仪来测量lrig
‑
1的表达水平。结果如图9所示。
[0206]
如图9中所示，由虚线表示的非调节性t细胞显示出与阴性对照几乎相同的lrig
‑
1的表达水平，而在调节性t细胞中有大量lrig
‑
1高表达水平的细胞。
[0207]
根据上述结果，可以看出，本发明的lrig
‑
1蛋白在调节性t细胞中特异性地表达。
[0208]
[实施例5]鉴定lrig
‑
1蛋白在调节性t细胞表面上的特异性表达
[0209]
从旨在成为细胞疗法靶标的观点来看，lrig
‑
1蛋白必须在调节性t细胞表面上表达，这反过来又允许更有效的靶向疗法，鉴定了lrig
‑
1蛋白是否在调节性t细胞的表面上表达。
[0210]
制备实施例1的各分化的t细胞亚群用抗cd4
‑
apc和抗lrig
‑1‑
pe抗体染色，使用荧光激活的细胞分选仪(facs)测量lrig
‑
1在各个细胞表面上的表达水平。结果如图10所示。
[0211]
如图10中所示，在激活的t细胞、th1细胞、th2细胞、th17细胞和初始t细胞中，lrig
‑
1的表达量为0.77
‑
15.3，而lrig
‑
1在分化诱导的t细胞中的表达高达83.9(itreg细胞)。
[0212]
根据上述结果，可以看出，本发明的lrig
‑
1蛋白不仅在调节性t(treg)细胞中特异性表达，而且特别地，在treg细胞上也较高水平地表达。
[0213]
[实施例6]评价本发明的抗体与lrig
‑
1蛋白的结合能力
[0214]
为了鉴定在生产实施例1至8中制备的本发明的单克隆抗体是否能很好识别lrig
‑
1，将生产实施例1至8的每种抗体结合到稳定表达lrig
‑
1的l细胞。然后，加入与eflour 670缀合并能识别小鼠抗体的二抗，然后用facs分析单克隆抗体与lrig
‑
1蛋白的结合能力。结果如图11所示。
[0215]
如图11中所示，发现根据本发明的所有lrig
‑
1蛋白的特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)都能有效地识别并结合存在于l细胞表面上的lrig
‑
1蛋白。
[0216]
[实施例7]通过本发明的抗体调节treg细胞中的信号转导通路
[0217]
为了分析在生产实施例1至8中制备的根据本发明的单克隆抗体如何通过lrig
‑
1蛋白影响treg细胞中的信号转导通路，使用生产实施例1至4中的抗体处理treg细胞来刺激存在于treg细胞表面上的lrig
‑
1，然后通过磷酸酪氨酸免疫印迹分析刺激的treg细胞中的stat3蛋白的酪氨酸磷酸化水平。结果如图12所示。
[0218]
如图12中所示，发现根据本发明的lrig
‑
1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)持续维持和降低stat3的磷酸化水平与itreg细胞相同。
[0219]
[实施例8]本发明的抗体对癌症的治疗效果
[0220]
为了鉴定生产实施例5
‑
8中制备的本发明的单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)在实体瘤上的治疗效果，如图13所示，将b16f10的黑素瘤细胞，以3
×
105细胞的量皮下注射到小鼠的背侧面，然后在第4、8和12天，将生产实施例5
‑
8中的抗体以200μg的量腹膜内注射到小鼠中。在移植黑素瘤细胞后，测量肿瘤体积随时间的变化，结果如图14所示。
[0221]
如图14中所示，发现与没有抗体治疗的阴性对照相比，在用本发明的lrig
‑
1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)处理的情况下，观察到肿瘤大小显著降低。
[0222]
由此，可以看出，本发明的lrig
‑
1蛋白特异性单克隆抗体可以抑制各种实体肿瘤细胞的生长，从而有效地预防、改善或治疗实体瘤。
[0223]
尽管上面已经详细描述了本发明，但是本发明的范围不限于此。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离权利要求中描述的本发明的技术精神的情况下可以进行各种修改和改变。
[0224]
工业实用性
[0225]
本发明涉及能够特异性结合存在于调节性t细胞表面(treg细胞)的富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig
‑
1)蛋白的结合分子及其用途，特别是癌症的预防或治疗用途。
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252]

技术特征：
1.一种与lrig
‑
1(富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1)蛋白特异性结合的结合分子，所述结合分子包括：重链可变区域，其包含选自seq id no：5、13、21和29所示的氨基酸序列的重链cdr1；选自seq id no:6、14、22和30所示的氨基酸序列的重链cdr2；选自seq id no:7、15、23和31所示的氨基酸序列的重链cdr3；和轻链可变区，其包含选自seq id no：8、16、24和32所示的氨基酸序列的轻链cdr1；选自seq id no：9、17、25和33所示的氨基酸序列的轻链cdr2；选自seq id no：10、18、26和34所示的氨基酸序列的轻链cdr3。2.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述lrig
‑
1蛋白包含seq id no：1或3所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述lrig
‑
1蛋白由seq id no：2或4所示的多核苷酸编码。4.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子包含：重链可变区，其选自包含(a)至(d)的下组：(a)含有seq id no：5所示的重链cdr1，seq id no：6所示的重链cdr2，和seq id no：7所示的重链cdr3的重链可变区；(b)含有seq id no：13所示的重链cdr1，seq id no：14所示的重链cdr2，和seq id no：15所示的重链cdr3的重链可变区；(c)含有seq id no：21所示的重链cdr1，seq id no：22所示的重链cdr2，和seq id no：23所示的重链cdr3的重链可变区；和(d)含有seq id no：29所示的重链cdr1，seq id no：30所示的重链cdr2，和seq id no：31所示的重链cdr3的重链可变区；和轻链可变区，其选自包含(e)至(h)的下组：(e)含有seq id no：8所示的轻链cdr1，seq id no：9所示的轻链cdr2，seq id no：10所示的轻链cdr3的轻链可变区；(f)含有seq id no：16所示的轻链cdr1，seq id no：17所示的轻链cdr2，和seq id no：18所示的轻链cdr3的轻链可变区；(g)轻链可变区，含有seq id no：24所示的轻链cdr1，seq id no：25所示的轻链cdr2，和由seq id no：26所示的轻链cdr3的轻链可变区；(h)含有seq id no：32所示的轻链cdr1，seq id no：33所示的轻链cdr2，和seq id no：34所示的轻链cdr3的轻链可变区。5.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子选自包含(1)至(4)的下组：(1)包含含有由seq id no：5所示的重链cdr1，由seq id no：6所示的重链cdr2，和由seq id no：7所示的重链cdr3的重链可变区；以及含有由seq id no：8所示的轻链cdr1，由seq id no：9所示的轻链cdr2，和由seq id no：10所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子；(2)包含含有由seq id no：13所示的重链cdr1，由seq id no：14所示的重链cdr2，和由
seq id no：15所示的重链cdr3的重链可变区；以及含有由seq id no：16所示的轻链cdr1，由seq id no：17所示的轻链cdr2，和由seq id no：18所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子；(3)包含含有由seq id no：21所示的重链cdr1，由seq id no：22所示的重链cdr2，和由seq id no：23所示的重链cdr3的重链可变区；以及含有由seq id no：24所示的轻链cdr1，由seq id no：25所示的轻链cdr2，和由seq id no：26所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子；(4)包含含有由seq id no：29所示的重链cdr1，由seq id no：30所示的重链cdr2，和由seq id no：31所示的重链cdr3；以及含有由seq id no：32所示的轻链cdr1，由seq id no：33所示的轻链cdr2，由seq id no：34所示的轻链cdr3的轻链可变区的结合分子。6.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子包括：重链可变区，其包含选自下组的任一氨基酸序列：seq id no:11、19、27和35；和轻链可变区，其包含选自下组的任一氨基酸序列：seq id no:12、20、28和36。7.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子为选自下组的结合分子：(i)包含seq id no:11所示的重链可变区，和seq id no:12所示的轻链可变区的结合分子；(ii)包含seq id no:19所示的重链可变区，和seq id no:20所示的轻链可变区的结合分子；(iii)包含seq id no:27所示的重链可变区，和seq id no:28所示的轻链可变区的结合分子；和(iv)包含seq id no:35所示的重链可变区，和seq id no:36所示的轻链可变区的结合分子。8.根据权利要求1所述的结合分子，还包括：fc区或恒定区。9.根据权利要求8所述的结合分子，其中所述fc区是igg1、igg2、igg3或igg4抗体的的fc区，或杂化fc区。10.根据权利要求1所述的结合分子，还包括：重链恒定区，其包含选自下组的任一氨基酸序列：seq id no:37、39、41、42、43、44和55。11.根据权利要求1所述的结合分子，还包括：轻链恒定区，其包含seq id no：38或40所示的氨基酸序列。12.根据权利要求1所述的结合分子，还包括：重链恒定区，其包含seq id no：37所示的氨基酸序列；和轻链恒定区，其包含seq id no：38所示的氨基酸序列。13.根据权利要求1所述的结合分子，还包括：重链恒定区，其包含选自下组的任一氨基酸序列：seq id no:39、41、42、43和53；和轻链恒定区，其包含seq id no：40所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的结合分子，还包括：重链恒定区，其包含seq id no：44所示的氨基酸序列。15.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子为选自下组的结合分子：包含seq id no：45所示的重链，和seq id no：46所示的轻链的结合分子；包含seq id no：47所示的重链，和seq id no：48所示的轻链的结合分子；包含seq id no：49所示的重链，和seq id no：50所示的轻链的结合分子；包含seq id no：51所示的重链，和seq id no：52所示的轻链的结合分子；和包含seq id no：53所示的重链，和seq id no：54所示的轻链的结合分子。16.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子是抗体或其片段。17.根据权利要求16所述的结合分子，其中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、二价抗体、双特异性分子、微抗体、域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、单抗体、双抗体、三抗体、或四抗体，或其片段。18.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至17中任一项所述的结合分子。19.一种表达载体，其中插入权利要求18所述的核酸分子。20.一种宿主细胞系，其用如权利要求19所述的表达载体转染。21.一种抗体
‑
药物缀合物，包括：抗体；和药物，其中所述抗体包含：重链可变区域，其含有选自seq id no：5、13、21和29所示氨基酸序列的重链cdr1；选自seq id no:6、14、22和30所示氨基酸序列的重链cdr2；选自seq id no：seq id no:7、15、23和31所示氨基酸序列的重链cdr3；和轻链可变区，其包含选自seq id no：8、16、24和32所示的氨基酸序列的轻链cdr1；选自seq id no：9、17、25和33所示的氨基酸序列的轻链cdr2；选自seq id no：10、18、26和34所示的氨基酸序列的轻链cdr3。22.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包含活性成分：根据权利要求1
‑
17中任一项的结合分子。23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述癌症是实体瘤。24.根据权利要求22所述的药物组合物，其中癌症是胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移性癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤或肺癌。25.一种用于预防或治疗癌症的方法，包括：给个体施用药学上有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的结合分子的步骤。26.一种用于预防或治疗癌症的方法，包括：给个体施用药学上有效量的根据权利要求21所述的抗体
‑
药物缀合物的步骤。
技术总结
本发明涉及能够与位于调节性T细胞表面的Lrig


技术研发人员：金廷镐 金范锡
受保护的技术使用者：古德T细胞有限公司
技术研发日：2019.10.17
技术公布日：2021/6/29