一种金属-儿茶素复合纳米材料及其制备方法与应用与流程

一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料及其制备方法与应用，属于生物材料技术领域。


背景技术：

2.茶多酚是美国食品药品监督管理局(fda)批准的第一个植物药，应用安全，具有优秀的生物相容性和降解性。儿茶素是绿茶多酚的一种，主要含四种成分：表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)和表儿茶素没食子酸酯(ecg)。儿茶素可促进间充质干细胞成骨分化，抑制脂肪形成，并在动物和人类中表现出抗肥胖作用；它还具有抗氧化、抗炎、抑制细菌和病毒和抗肿瘤等多种生理功能，具有广泛的生物医学应用前景。此外，儿茶素成本低，可降解并具有良好的生物相容性，这些优点也使其成为生物医学应用的独特原料。然而，由于儿茶素分子的稳定性较差，其应用受到很大的限制，而且水溶性的儿茶素分子不易被细胞摄取，在体外和体内的利用率都很低。
3.近些年来，随着纳米科学的发展，作为一种新兴手段，纳米材料由于成本低廉，渐渐被用于生物医学领域，设计合理的纳米材料引起了研究人员的广泛兴趣。纳米颗粒由于尺寸小，容易被干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞等内吞，因此，合成含有儿茶素的纳米材料应该是提高其利用率的有效途径。中国专利文献cn111195233a公开了一种叶酸
‑
壳聚糖
‑
表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)纳米粒的制备方法，工艺关键在于，制备浓度为1
‑
2mg/ml叶酸偶联壳聚糖溶液，将叶酸偶联壳聚糖溶于1％的冰醋酸溶液中，加入一定量的egcg，用1％的naoh溶液调节ph值3
‑
5，制成egcg浓度为0.5
‑
1mg/ml的叶酸偶联壳聚糖溶液。取一定量tpp用纯水溶解，将tpp溶液和叶酸偶联壳聚糖的egcg溶液分别过0.45μm的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖egcg溶液逐滴加入tpp溶液，叶酸偶联壳聚糖与tpp的比例为4
‑
6：1，最后得到负载egcg的叶酸壳聚糖纳米微球。然而，这种壳聚糖包被儿茶素的制备方法步骤复杂，依赖于tpp等有毒物质，并且得到的叶酸
‑
壳聚糖
‑
表没食子儿茶素没食子酸酯纳米粒中的儿茶素的释放难以控制。
4.因此，急需寻找一种稳定性好、安全性高、易被细胞摄取和利用率高的儿茶素纳米材料及其制备方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料及其制备方法与应用，采用金属离子和儿茶素分子进行配位，实现水溶性儿茶素分子的纳米化和固体化，所合成的纳米材料具有促进干细胞成骨分化、抑制干细胞成脂分化的功能，能够促进骨缺损修复，并且可以抑制巨噬细胞的炎性响应。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料，所述金属
‑
儿茶素复合纳米材料是金属离子和儿茶素配位结合形成的球状纳米颗粒，直径为5～500nm。
8.根据本发明优选的，所述金属离子包含但不限于fe
3
，fe
2
，cu
2
，ti
4
，ca
2
，mg
2
，sr
2
，zn
2
，gd
3
，sm
3
。
9.根据本发明优选的，所述儿茶素包含但不限于表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)和( )
‑
catechin。
10.上述金属
‑
儿茶素复合纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
11.(1)将儿茶素溶解在5～100ml溶剂中，得到10μm～300mm的儿茶素溶液；将金属盐溶解在5～100ml溶剂中，得到10μm～100mm的金属盐溶液；
12.(2)将步骤(1)中的儿茶素溶液和金属盐溶液混合，在20～80℃条件下搅拌0.5～24h进行金属
‑
有机物配位，收集沉淀；
13.(3)将步骤(2)中的沉淀经洗涤、离心和冷冻干燥后得到球状纳米颗粒，即金属
‑
儿茶素复合纳米材料。
14.根据本发明优选的，步骤(1)中所述金属盐包含但不限于fe
3
，fe
2
，cu
2
，ti
4
，ca
2
，mg
2
，sr
2
，zn
2
，gd
3
，sm
3
的氯化物、硫酸盐和硝酸盐。
15.根据本发明优选的，步骤(1)中所述儿茶素包含但不限于表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)和( )
‑
catechin。
16.根据本发明优选的，步骤(1)中所述儿茶素和金属盐的摩尔比为(5:1)～(1:5)。
17.根据本发明优选的，步骤(1)中所述溶剂包含但不限于水、酒精、二甲基亚砜和n，n
‑
二甲基甲酰胺。
18.根据本发明优选的，步骤(1)中儿茶素溶液的浓度为20～80mm，金属盐溶液的浓度为10～50mm。
19.根据本发明优选的，步骤(2)中所述金属
‑
有机物配位的条件为在20～40℃条件下搅拌1～8h。
20.上述金属
‑
儿茶素复合纳米材料的在干细胞分化中的应用，所述应用的操作步骤如下：
21.(1)将金属
‑
儿茶素复合纳米材料称重、灭菌后分散在无菌去离子水、磷酸盐缓冲液(pbs)或生理盐水中，得到金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，备用；
22.(2)将干细胞接种在细胞培养板或培养皿中，接种的干细胞悬液的体积为0.02～2ml，包含的细胞个数为1
×
103～1
×
106个，在细胞培养板或培养皿中补充0～2ml基础培养基；经过6～24h细胞贴壁后，将基础培养基更换为成骨诱导液或成脂诱导液，继续向成骨诱导液或成脂诱导液中添加金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，培养1～21天。
23.根据本发明优选的，步骤(2)中所述细胞培养的条件为37℃下含5％co2的湿润环境下培养，所述湿润环境的湿度为饱和湿度。
24.根据本发明优选的，步骤(2)中所述干细胞为人或动物的干细胞，包含但不限于人脂肪来源间充质干细胞、大鼠脂肪来源间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞或人脐带血干细胞。
25.根据本发明优选的，步骤(2)中所述基础培养基为α
‑
mem培养基、高糖或低糖dmem培养基添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗。
26.根据本发明优选的，步骤(2)中所述成骨诱导液为基础培养基添加β
‑
甘油磷酸钠、
地塞米松和抗坏血酸；成脂诱导液为基础培养基添加地塞米松、抗坏血酸、吲哚美辛和3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤；更换的成骨诱导液或成脂诱导液体积为0.5～2ml，金属
‑
儿茶素复合纳米材料在成骨诱导液或成脂诱导液中的浓度为5～100μg/ml。
27.本发明中，对所述金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理的干细胞进行基因和蛋白水平的检测，发现成骨相关基因和蛋白得到明显促进，成脂相关基因和蛋白受到明显抑制。
28.上述金属
‑
儿茶素复合纳米材料在促进骨缺损修复中的应用，所述应用的操作步骤如下：
29.把金属
‑
儿茶素复合纳米材料直接注射到骨缺损部位，或与基质胶等复合形成块体材料后注射或植入到骨缺损部位，培养2～18周。
30.本发明中，对所述金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理的骨缺损部位进行检测，发现骨组织再生得到促进。
31.上述金属
‑
儿茶素复合纳米材料在抑制巨噬细胞炎症响应中的应用，所述应用的操作步骤如下：
32.(1)将金属
‑
儿茶素复合纳米材料称重、灭菌后分散在无菌去离子水、磷酸盐缓冲液(pbs)或生理盐水中，得到金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，备用；
33.(2)将巨噬细胞接种在细胞培养板或培养皿中，接种的干细胞悬液的体积为0.02～2ml，包含的细胞个数为3
×
103～3
×
106个，在细胞培养板或培养皿中补充0～2ml基础培养基；经过0.5～24h细胞贴壁后，加入脂多糖(lps)刺激巨噬细胞产生炎症响应，经过1～24h后，继续加入金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，培养1～7天。
34.根据本发明优选的，步骤(1)中所述巨噬细胞为人或动物巨噬细胞，包括但不限于人单核白血病细胞(thp
‑
1)、小鼠单核巨噬细胞(raw264.7)或小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞。
35.根据本发明优选的，步骤(2)中所述基础培养基为高糖dmem培养基或1640培养基添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗；脂多糖(lps)在基础培养基中的浓度为5～100μg/ml，金属
‑
儿茶素复合纳米材料在基础培养基中的浓度为5～100μg/ml。
36.根据本发明优选的，步骤(2)中所述细胞培养的条件为37℃下含5％co2的湿润环境下培养，所述湿润环境的湿度为饱和湿度。
37.本发明中，对所述金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理的巨噬细胞进行基因和蛋白水平的检测，发现炎症相关基因和蛋白受到明显抑制，即巨噬细胞m1极化受到抑制。
38.有益效果：
39.1.本发明首次发现并公开了由金属离子和儿茶素配位结合形成的金属
‑
儿茶素复合纳米材料，采用金属离子和儿茶素分子进行配位，实现水溶性儿茶素分子的纳米化和固体化，直径在5～500nm之间，相比于水溶性的儿茶素分子，稳定性得到了显著提升，同时容易被干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞等具有摄取能力的细胞内吞，被细胞摄取后，由于细胞内溶酶体ph呈弱酸性，略小于中性的体液环境，使得金属
‑
儿茶素复合纳米材料的配位数降低，可以高效释放儿茶素分子，参与细胞内进程，有效地提高了儿茶素的利用率，具有广泛的体外和体内应用潜能，还具有良好的降解性。
40.2、本发明还公开了利用金属
‑
有机配位原理制备儿茶素复合纳米材料的方法，金属
‑
有机配合物的合成是一种将可溶有机分子转变成不溶性纳米颗粒的简便而又非常有效
的方法，多酚可以与各种金属离子配合形成纳米结构。儿茶素作为多酚的一种，可以作为配体与一些金属离子配合形成金属
‑
儿茶素复合纳米材料。同时，本发明所选取的金属离子生物相容性良好，在生物体内的生理进程中扮演重要角色。并且本发明所公开的制备方法成本低廉、需要的温度低、周期短且简便高效，可以实现这类纳米材料的大规模制备。
41.3、实验证实，本发明公开的金属
‑
儿茶素复合纳米材料具有高效的促成骨、抑成脂效率，可以用于基于干细胞的骨组织工程进行骨缺损修复，还可作为抗脂肪形成剂；本发明公开的金属
‑
儿茶素复合纳米材料还能够抑制巨噬细胞的炎症响应，既可用于炎症疾病的抗炎治疗，又可用于巨噬细胞辅助的骨组织修复，是一种多功能材料，具有广泛的生物医学应用前景。
附图说明
42.图1为实施例1制备得到的金属
‑
儿茶素复合纳米材料的扫描电子显微镜(sem)照片；
43.图2为实施例1中蛋白免疫印迹法(wb)检测金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理的人脂肪来源间充质干细胞中成骨标志物的蛋白印迹照片；
44.图3为实施例2中金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理的人脂肪来源间充质干细胞中成脂标志物pparγ的基因表达水平柱状图；
45.图4为实施例3中金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理的thp
‑
1炎症模型的炎症标志物tnfα、il
‑
1β和il
‑
6的表达水平柱状图；
46.图5为实施例4中金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理的大鼠股骨micro
‑
ct图像。
具体实施方式
47.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
48.同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
49.下列实施例中所使用的细胞培养基均为α
‑
mem培养基、高糖或低糖dmem培养基、或1640培养基添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗。
50.实施例1：
51.一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
52.(1)将3mmol( )
‑
catechin溶解在50ml水中，得到60mm的( )
‑
catechin溶液；将1mmol六水合氯化铁溶解在50ml水中，得到20mm的六水合氯化铁溶液；
53.(2)将步骤(1)中的( )
‑
catechin溶液和六水合氯化铁溶液混合，在25℃条件下搅拌1h，产生黑褐色沉淀；
54.(3)将步骤(2)中的沉淀用去离子水和酒精洗涤，离心和冷冻干燥后得到球状纳米颗粒，即金属
‑
儿茶素复合纳米材料。
55.将本实施例制备得到的金属
‑
儿茶素复合纳米材料通过扫描电子显微镜观察其形貌特征，其扫描电子显微镜照片如图1所示。由图1可知，金属
‑
儿茶素复合纳米材料的形貌为圆形纳米颗粒，直径在40～150nm之间。
56.将上述制备得到的金属
‑
儿茶素复合纳米材料应用于促进人脂肪来源间充质干细胞成骨分化，步骤如下：
57.(1)称取20mg金属
‑
儿茶素复合纳米材料，灭菌后分散在2ml磷酸盐缓冲液(pbs)，得到金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，备用；
58.(2)将人脂肪来源间充质干细胞接种在12孔细胞培养板中，接种的干细胞悬液的体积为1ml，包含的细胞个数为1
×
104个，在细胞培养板或培养皿中补充1ml基础培养基；将细胞置于37℃下含5％co2的饱和湿度环境下，经过12h细胞贴壁后，将基础培养基更换为2ml成骨诱导液，向成骨诱导液中分别加入金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，加入后金属
‑
儿茶素复合纳米材料在成骨诱导液中的浓度分别为0、10、20和50μg/ml，将细胞置于37℃下含5％co2的饱和湿度环境下体外培养14天，且每2天更换一次成骨诱导液。
59.将本实施例中用金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理14天的人脂肪来源间充质干细胞进行蛋白水平检测，以磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)为内参，wb检测细胞中骨桥蛋白(opn)的表达水平，结果如图2所示，金属
‑
儿茶素复合纳米材料浓度是10、20和50μg/ml的为实验组，金属
‑
儿茶素复合纳米材料浓度是0μg/ml的为空白对照组。由图2可知，opn的表达水平得到明显促进，说明金属
‑
儿茶素复合纳米材料显著促进了人脂肪来源间充质干细胞的成骨分化。
60.实施例2：
61.一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
62.(1)将3mmol( )
‑
catechin溶解在50ml水中，得到60mm的( )
‑
catechin溶液；将1mmol六水合氯化铁溶解在50ml水中，得到20mm的硝酸铁溶液；
63.(2)将步骤(1)中的( )
‑
catechin溶液和硝酸铁溶液混合，在25℃条件下搅拌2h，产生黑褐色沉淀；
64.(3)将步骤(2)中的沉淀用去离子水和酒精洗涤，离心和冷冻干燥后得到球状纳米颗粒，即金属
‑
儿茶素复合纳米材料；
65.将上述制备得到的金属
‑
儿茶素复合纳米材料应用于抑制人脂肪来源间充质干细胞成脂分化，步骤如下：
66.(1)称取10mg金属
‑
儿茶素复合纳米材料，灭菌后分散在1ml磷酸盐缓冲液(pbs)，得到金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，备用；
67.(2)将人脂肪来源间充质干细胞接种在12孔细胞培养板中，接种的干细胞悬液的体积为1ml，包含的细胞个数为2
×
104个，在细胞培养板或培养皿中补充2ml基础培养基；将细胞置于37℃下含5％co2的饱和湿度环境下，经过24h细胞贴壁后，将基础培养基更换为1ml成脂诱导液，向成脂诱导液中分别加入金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，加入后金属
‑
儿茶素复合纳米材料在成脂诱导液中的浓度分别为0、10、20和50μg/ml，将细胞置于37℃下含5％co2的饱和湿度环境下体外培养14天，且每2天更换一次细胞培养基。
68.将本实施例中用金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理14天的人脂肪来源间充质干细胞进行基因水平检测，检测成脂标志物pparγ的表达水平，结果如图3所示，金属
‑
儿茶素复合纳米材料浓度是10、20和50μg/ml的为实验组，金属
‑
儿茶素复合纳米材料浓度是0μg/ml的为空白对照组。由图3可知，pparγ的表达水平得到明显抑制，分别为对照组的0.59
±
0.01、0.63
±
0.01、0.63
±
0.10倍，说明金属
‑
儿茶素复合纳米材料显著抑制了人脂肪来源间充质
干细胞的成脂分化。
69.实施例3：
70.一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
71.(1)将1.5mmol( )
‑
catechin溶解在50ml水中，得到30mm的( )
‑
catechin溶液；将0.2mmol硝酸铁溶解在20ml水中，得到10mm的硝酸铁溶液；
72.(2)将步骤(1)中的( )
‑
catechin溶液和硝酸铁铁溶液混合，在25℃条件下搅拌3h，产生黑褐色沉淀；
73.(3)将步骤(2)中的沉淀用去离子水和酒精洗涤，离心和冷冻干燥后得到球状纳米颗粒，即金属
‑
儿茶素复合纳米材料。
74.将上述制备得到的金属
‑
儿茶素复合纳米材料应用于抑制thp
‑
1细胞的m1极化，步骤如下：
75.(1)称取50mg金属
‑
儿茶素复合纳米材料，灭菌后分散在10ml磷酸盐缓冲液(pbs)，得到金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，备用；
76.(2)将thp
‑
1细胞接种在12孔细胞培养板中，接种的干细胞悬液的体积为1ml，包含的细胞个数为1
×
105个，在细胞培养板或培养皿中补充1ml基础培养基；将细胞置于37℃下含5％co2的饱和湿度环境下，经过12h细胞贴壁后，加入100μg lps刺激巨噬细胞产生炎症响应，经过2h后，分别加入金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，加入后金属
‑
儿茶素复合纳米材料在基础培养基中的浓度分别为0、50μg/ml，将细胞置于37℃下含5％co2的饱和湿度环境下体外培养培养1d。
77.将本实施例中用金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理后的巨噬细胞进行炎症标志物的基因水平检测，检测tnfα、il
‑
1β和il
‑
6的表达水平，结果如图4所示，金属
‑
儿茶素复合纳米材料浓度是50μg/ml的为实验组，金属
‑
儿茶素复合纳米材料浓度是0μg/ml的为空白对照组。由图4可知，经金属
‑
儿茶素复合纳米材料处理后，实验组三种标志物的表达水平均低于对照组，说明巨噬细胞的炎症响应得到了显著抑制。
78.实施例4：
79.一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料的制备方法，具体步骤如下：
80.(1)将3mmol( )
‑
catechin溶解在50ml水中，得到60mm的( )
‑
catechin溶液；将1mmol六水合氯化铁溶解在50ml水中，得到20mm的六水合氯化铁溶液；
81.(2)将步骤(1)中的( )
‑
catechin溶液和六水合氯化铁溶液混合，在25℃条件下搅拌1h，产生黑褐色沉淀；
82.(3)将步骤(2)中的沉淀用去离子水和酒精洗涤，离心和冷冻干燥后得到球状纳米颗粒，即金属
‑
儿茶素复合纳米材料。
83.将上述制备得到的金属
‑
儿茶素复合纳米材料应用于大鼠股骨骨缺损修复，步骤如下：
84.(1)除毛、暴露大鼠股骨后，用电钻沿大鼠股骨的胫骨端造缺损，扫除1cm范围内所有骨髓质，并用生理盐水冲洗；
85.(2)金属
‑
儿茶素复合纳米材料与基质胶混合，每200μl基质胶负载20μg金属
‑
儿茶素复合纳米材料，将200μl金属
‑
儿茶素复合纳米材料与基质胶混合物和200μl基质胶分别注射入缺损的股骨骨髓腔内，缝合后，在spf级鼠房中培养大鼠6周。
86.将本实施例中用金属
‑
儿茶素复合纳米材料与基质胶混合物处理后大鼠股骨进行micro
‑
ct表征检测，结果如图5所示，注射基质胶 金属
‑
儿茶素复合纳米材料的为实验组，注射基质胶的为对照组。由如5可知，包含金属
‑
儿茶素复合纳米材料的实验组的骨缺损修复情况明显优于基质胶对照组，说明金属
‑
儿茶素复合纳米材料具有促进骨缺损修复的作用。
87.对比例
88.用( )
‑
catechin以50μg/ml的浓度处理人脂肪来源干细胞，相比同等浓度的金属
‑
儿茶素复合纳米材料，细胞活性较低，且摄取率较低。

技术特征：
1.一种金属
‑
儿茶素复合纳米材料，其特征在于，所述金属
‑
儿茶素复合纳米材料是金属离子和儿茶素配位结合形成的球状纳米颗粒，直径为5～500nm。2.如权利要求1所述的金属
‑
儿茶素复合纳米材料，其特征在于，所述金属离子包含但不限于fe
3
，fe
2
，cu
2
，ti
4
，ca
2
，mg
2
，sr
2
，zn
2
，gd
3
，sm
3
；所述儿茶素包含但不限于表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)和( )
‑
catechin。3.权利要求1所述金属
‑
儿茶素复合纳米材料的制备方法，具体包括步骤如下：(1)将儿茶素溶解在5～100ml溶剂中，得到10μm～300mm的儿茶素溶液；将金属盐溶解在5～100ml溶剂中，得到10μm～100mm的金属盐溶液；(2)将步骤(1)中的儿茶素溶液和金属盐溶液混合，在20～80℃条件下搅拌0.5～24h进行金属
‑
有机物配位，收集沉淀；(3)将步骤(2)中的沉淀经洗涤、离心和冷冻干燥后得到球状纳米颗粒，即金属
‑
儿茶素复合纳米材料。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述金属盐包含但不限于fe
3
，fe
2
，cu
2
，ti
4
，ca
2
，mg
2
，sr
2
，zn
2
，gd
3
，sm
3
的氯化物、硫酸盐和硝酸盐；步骤(1)中所述儿茶素包含但不限于表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)和( )
‑
catechin。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述儿茶素和金属盐的摩尔比为(5:1)～(1:5)；步骤(1)中所述溶剂包含但不限于水、酒精、二甲基亚砜和n，n
‑
二甲基甲酰胺；步骤(1)中所述儿茶素溶液的浓度为20～80mm，金属盐溶液的浓度为10～50mm；步骤(2)中所述金属
‑
有机物配位的条件为在20～40℃条件下搅拌1～8h。6.权利要求1所述金属
‑
儿茶素复合纳米材料在干细胞分化中的应用，所述应用的操作步骤如下：(1)将金属
‑
儿茶素复合纳米材料称重、灭菌后分散在无菌去离子水、磷酸盐缓冲液(pbs)或生理盐水中，得到金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，备用；(2)将干细胞接种在细胞培养板或培养皿中，接种的干细胞悬液的体积为0.02～2ml，包含的细胞个数为1
×
103～1
×
106个，在细胞培养板或培养皿中补充0～2ml基础培养基；经过6～24h细胞贴壁后，将基础培养基更换为成骨诱导液或成脂诱导液，继续向成骨诱导液或成脂诱导液中添加金属
‑
儿茶素复合纳米材料分散液，培养1～21天。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述细胞培养的条件为37℃下含5％co2的湿润环境下培养，所述湿润环境的湿度为饱和湿度；步骤(2)中所述干细胞为人或动物的干细胞，包含但不限于人脂肪来源间充质干细胞、大鼠脂肪来源间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞或人脐带血干细胞；步骤(2)中所述基础培养基为α
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mem培养基、高糖或低糖dmem培养基添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗；步骤(2)中所述成骨诱导液为基础培养基添加β
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甘油磷酸钠、地塞米松和抗坏血酸；成脂诱导液为基础培养基添加地塞米松、抗坏血酸、吲哚美辛和3
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异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤；更换的成骨诱导液或成脂诱导液体积为0.5～2ml，金属
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儿茶素复合纳米材料在成骨诱导液或成脂诱导液中的浓度为5～100μg/ml。
8.权利要求1所述金属
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儿茶素复合纳米材料在促进骨缺损修复中的应用，所述应用的操作步骤如下：把金属
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儿茶素复合纳米材料直接注射到骨缺损部位，或与基质胶等复合形成块体材料后注射或植入到骨缺损部位，培养2～18周。9.权利要求1所述金属
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儿茶素复合纳米材料在抑制巨噬细胞炎症响应中的应用，所述应用的操作步骤如下：(1)将金属
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儿茶素复合纳米材料称重、灭菌后分散在无菌去离子水、磷酸盐缓冲液(pbs)或生理盐水中，得到金属
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儿茶素复合纳米材料分散液，备用；(2)将巨噬细胞接种在细胞培养板或培养皿中，接种的干细胞悬液的体积为0.02～2ml，包含的细胞个数为3
×
103～3
×
106个，在细胞培养板或培养皿中补充0～2ml基础培养基；；经过0.5～24h细胞贴壁后，加入脂多糖(lps)刺激巨噬细胞产生炎症响应，经过1～24h后，继续加入金属
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儿茶素复合纳米材料分散液，培养1～7天。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述巨噬细胞为人或动物巨噬细胞，包括但不限于人单核白血病细胞(thp
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1)、小鼠单核巨噬细胞(raw264.7)或小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞；步骤(2)中所述基础培养基为高糖dmem培养基或1640培养基添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗；脂多糖(lps)在基础培养基中的浓度为5～100μg/ml，金属
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儿茶素复合纳米材料在基础培养基中的浓度为5～100μg/ml；步骤(2)中所述细胞培养的条件为37℃下含5％co2的湿润环境下培养，所述湿润环境的湿度为饱和湿度。
技术总结
本发明涉及一种金属


技术研发人员：王书华 孔颖 刘锋 桑元华 李刚 薛皓 刘宏
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2021.03.18
技术公布日：2021/6/29