一种禽蛋中微纳塑料的检测方法

1.本发明涉及一种禽蛋中微纳塑料的检测方法，属于食品检测领域。


背景技术：

2.塑料是一类具有高分子量的长链有机聚合物。由于其易于生产、重量轻、稳定性高、多功能性和绝缘性(热和电)，众多类型的塑料被广泛应用于各行各业。塑料颗粒一旦释放到环境中，会受到外界水的冲刷、紫外线辐射以及生物代谢等等各种外部因素的影响，导致风化和碎裂，从而形成较小的塑料颗粒，即微塑料(mps)和纳米塑料(nps)。目前，聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚氯乙烯(pvc)等塑料被大量使用，广泛应用于日常生活中。因此，生产的大多数mps和nps(m/nps)也是由这些材料制成的。mps被定义为合成固体颗粒或聚合物基体，具有规则或不规则的形状，尺寸范围为1μm至5mm。相应地，nps被定义为颗粒或聚合物形式的塑料，尺寸为1nm至1μm。研究表明m/nps可以保留在各种生态系统中，包括海洋生态系统、陆地生态系统和淡水生态系统，甚至在空气中也被检测到。因此，我们可以推断出m/nps会进入食物链，并最终通过我们对各种食物的消费回到我们的餐桌上。
3.目前食品中微纳塑料的检测方法主要有肉眼观察，色谱法和光谱法等。纯粹的肉眼观察容易出现高估或低估的情况，如果单纯用色谱法和光谱法普遍存在操作复杂且操作技术性强、难以寻找到微纳塑料的具体位置以及仪器设备昂贵等缺陷，难以满足目前针对微纳塑料的检测要求。此外，针对于禽蛋这一类食品样品中微纳塑料的检测这一领域几乎是空白的状态，同时也缺乏有关于禽蛋中微纳塑料检测的相关报道。因此，建立一种针对于禽蛋中微纳塑料，实现较为准确和快速的检测方法具有重要的意义。


技术实现要素：

4.[技术问题]
[0005]
现有检测微纳塑料的方法操作复杂且操作技术性强、仪器设备昂贵，且针对禽蛋类食品中微纳塑料的检测为空白状态。
[0006]
[技术方案]
[0007]
为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种利用染色观察同时配合红外光谱以及扫描电镜等表征手段对禽蛋中微纳塑料进行测的方法，本发明的方法操作简单、没有过高的技术要求，可以在保证准确度的情况下做到有效检测。
[0008]
本发明的第一个目的是提供一种禽蛋中微纳塑料的检测方法，包括如下步骤：
[0009]
(1)禽蛋的预处理：打破禽蛋，保留蛋清与蛋黄，并将蛋液搅拌均匀；
[0010]
(2)禽蛋液的消化：向搅拌均匀的蛋液中加入koh溶液，并放入摇床中进行消化；
[0011]
(3)蛋液的过滤：待消化后的蛋液冷却后，使用抽滤装置对蛋液进行过滤，之后将滤纸烘干；
[0012]
(4)染色剂的配制：取尼罗红固体溶解于丙酮中，并在0-4℃的条件下保存于暗处；
[0013]
(5)样品的染色：染色之前用超纯水稀释染色剂尼罗红的丙酮溶液，并滴加在步骤(3)得到的过滤蛋液后的滤纸上，然后放入水浴锅中进行孵育；
[0014]
(6)样品的镜检：将孵育之后的滤纸用显微镜分别在明场下和荧光激发下的观察计算微纳塑料的浓度。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，可以将过滤后的样品进行扫描电子显微镜(sem)和衰减全反射傅里叶红外光谱(atr-ft-ir)的表征，以进一步确定颗粒是否为微纳塑料。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中koh溶液的浓度为10％。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中在摇床中震荡，时间为24～48h，温度为60
±
1℃，转速为100
±
5rpm。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中过滤所采用的滤纸为玻璃纤维滤纸。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中染色剂的浓度为1mg/ml。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中所述的要将染色剂稀释至20μg/ml后使用。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中孵育的条件为：温度为50
±
1℃，时间为30
±
5min。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中荧光激发的发射波长为450-490nm。
[0023]
本发明的第二个目的是提供上述方法在食品检测领域中的应用。
[0024]
本发明的第三个目的是提供上述方法在禽蛋中检测微纳塑料的应用。
[0025]
本发明的有益效果：
[0026]
(1)本发明运用强碱达到对鸡蛋中的有机成分的消化去除，然后通过过滤分离得到鸡蛋中的微纳塑料，从而实现对其进行检测。
[0027]
(2)本发明的检测方法加标回收率达到92.06
±
9.39％，表明本发明的方法精确度和准确度较好。
[0028]
(3)本发明的方法通过尼罗红染色配合镜检可以达到对鸡蛋中微纳塑料定量的目的，为鸡蛋中微纳塑料进行初步定量检测提供了一种快速便捷的检测方法。
[0029]
(4)本发明的方法可以通过衰减全反射红外光谱和扫描电子显微镜等表征方法实现对鸡蛋中微纳塑料进行定性分析，为鸡蛋中微纳塑料进行定性筛查检测提供了一种快速便捷的检测方法。
附图说明
[0030]
图1为未加标时，明场下观察到的实际样品中的微纳塑料。
[0031]
图2为未加标时，荧光激发下观察到的实际样品中的微纳塑料。
[0032]
图3为未加标时，实际样品中微纳塑料的衰减全反射红外光谱图。
[0033]
图4为未加标时，实际样品中微纳塑料的扫描电子显微镜图。
[0034]
图5为未加标时，实际样品中微纳塑料的能量色散x射线光谱图。
[0035]
图6为加标后明场下观察到的微纳塑料。
[0036]
图7为加标后荧光激发下观察到的微纳塑料。
具体实施方式
[0037]
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
[0038]
实施例1
[0039]
一种定性定量检测鸡蛋中微纳塑料的方法，包括如下步骤：
[0040]
(1)鸡蛋的预处理：
[0041]
准备一只干净的碗和一根干净的玻璃棒，先用无水乙醇冲洗三次，再用超纯水冲洗三次，60℃烘箱烘干，备用；打破一颗鸡蛋至碗中，丢弃掉蛋壳，保留蛋清与蛋黄，并用玻璃棒将蛋清与蛋黄搅拌成均匀的蛋液。
[0042]
(2)染色剂的配制：
[0043]
称取5mg尼罗红的标准品，用丙酮在溶解后转移至5ml棕色容量瓶，得到1mg/ml的标准溶液，然后用超纯水稀释成浓度为20μg/ml的尼罗红标准溶液，在4℃的条件下暗处保存备用。
[0044]
(3)消化液的配制：
[0045]
称取20mg的固体koh，将其溶解于200ml超纯水中，得到浓度为10％的koh溶液作为消化液，置于室温条件下保存备用
[0046]
(4)鸡蛋的消化：
[0047]
将搅拌均匀的蛋液(一颗鸡蛋约为50ml)转移至洗干净的锥形瓶中，加入200ml的naoh溶液，用锡纸将锥形瓶的瓶口封住。将锥形瓶放入摇床中，转速为100rpm，温度为60℃，时间为24h。
[0048]
(5)蛋液的过滤：
[0049]
将消化后装有鸡蛋液的锥形瓶从摇床中取出，待冷却至室温，使用抽滤装置配合玻璃纤维滤纸对蛋液进行过滤。然后将玻璃纤维滤纸放置到干净的玻璃培养皿中烘干。
[0050]
(6)样品的染色：
[0051]
将装有过滤后的玻璃纤维滤纸的玻璃培养皿从烘箱中取出，待冷却至室温，向玻璃纤维滤纸上滴加已配置好的尼罗红染色剂。将其置于60℃的水浴锅中进行孵育染色。
[0052]
(7)镜检观察：
[0053]
将染色完成的玻璃纤维滤纸拿到显微镜下进行观察，可以观察到在玻璃纤维滤纸上的微纳塑料(图1)。为了进一步确认我们所找到的就是微纳塑料，再通过470nm的荧光激发，可以观察到法绿光的微纳塑料(图2)；
[0054]
(5)样品的表征：
[0055]
将实际样品进行atr-ft-ir和sem-edx的表征，所得到的图谱分别为图3-5。图3是衰减全反射傅里叶红外光谱图，通过将其与相关文献和谱图数据库进行对比，可以发现该谱图与聚乙烯(pe)的谱图几乎完全一致，在1729cm-1
的位置可以观察到一个峰，该峰可以归结为c＝c，另外，在2925cm-1
和2852cm-1
的位置也有两个峰，分别可以归为-ch3和-ch
2-。图4是扫描电镜图，可以观察到鸡蛋中的微塑料的外观形貌并不是十分光滑，并且主要呈现出颗粒状。图5是能量色散x射线光谱图(edx)，从图上可以的看到鸡蛋中的微塑料的主要元素组成是c和o，正好可以契合图3中所证明的其主要成分是pe。
[0056]
实施例2染色溶剂的优化
[0057]
调整实施例1中染色剂的配置中的溶剂丙酮为乙醇或将稀释溶剂改为乙醇/丙酮(v/v，1:1)，其他和实施例1保持一致，进行检测。
[0058]
检测结果为：发现溶解溶剂为丙酮且稀释溶剂为超纯水时，对微纳塑料的染色效果较好，且在荧光激发下能更好的观察，并不容易猝灭。当染色剂配置时使用乙醇作为溶剂的时候，可以发现染色非常不好，难以在荧光激发下的显微镜下观察到微纳塑料；而当稀释溶剂变更为乙醇/丙酮(v/v，1:1)的时候，可以发现虽然同样具有很好的染色效果，但是当在荧光激发下非常容易猝灭，不是十分稳定。因此，综合考虑，选择使用丙酮为溶解溶剂，超纯水为稀释溶剂，在这一条件下，具有最好的染色效果和稳定性。
[0059]
实施例3消化方式的优化
[0060]
调整实施例1中鸡蛋的消化方式变为酸消化(hno3，55％)、氧化消化(h2o2，35％)，其他和实施例1保持一致，进行检测。
[0061]
检测结果为：发现当使用酸消化的时候，虽然酸消化具有较好的消化效果，但是有两大劣势，一是需要较高的消化温度(80℃)，二是酸消化会对于微纳塑料具有较强的侵蚀作用，导致微纳塑料的粒径和外观形貌等多项性质发生较大的改变，从而使得后期出现较大误差；此外，酸消化的进行往往需要配合较高的温度以及较高的浓度才能实现，因此，从实验的安全性和便捷性方面考虑，也不宜选择酸消化的方式。当使用氧化消化的时候，虽然条件较为温和，但是消化效率较低，需要72-96h才能达到与碱消化类似的效果。
[0062]
实施例4消化时间的优化
[0063]
调整实施例1中鸡蛋的消化时间为12h以及48h，其他和实施例1保持一致，对鸡蛋中的微纳塑料进行观察与检测。
[0064]
检测结果为：当消化时间为12h时，消化后的鸡蛋液中有明显的肉眼可见的未消化完全的残留物质，当未消化完全的时候，证明其中还含有食品中的有机成分，会产生基质干扰，同时也有悖于我们进行消化处理的初衷，从而影响到我们后续对微纳塑料的进一步检测与分析；当消化时间为48h时，消化后的鸡蛋液从外观上看与消化时间为24h的无异，并在显微镜下观察微纳塑料也没有明显差异。
[0065]
实施例5消化温度的优化
[0066]
调整实施例1中鸡蛋的消化温度为50℃以及70℃，其他和实施例1保持一致，对鸡蛋中的微纳塑料进行观察与检测。
[0067]
检测结果为：当消化温度为50℃时，消化后的鸡蛋液中有明显的肉眼可见的未消化完全的残留物质，当未消化完全的时候，证明其中还含有食品中的有机成分，会产生基质干扰，同时也有悖于我们进行消化处理的初衷，从而影响到我们后续对微纳塑料的进一步检测与分析；当消化温度为70℃时，消化后的鸡蛋液从外观上看与消化温度为60℃的无异，并在显微镜下观察微纳塑料也没有明显差异。
[0068]
实施例6加标实验测定回收率
[0069]
调整实施例1中鸡蛋预处理步骤中，在搅拌成均匀蛋液后在其中添加pe微塑料20-25mg，其他和实施例1保持一致，并进行观察与检测。回收率(r)的具体计算公式如下：
[0070][0071]
其中m1(mg)是所添加的pe微塑料的质量；m2(mg)是未使用的玻璃纤维滤纸的质量；
m3(mg)是过滤并干燥后的玻璃纤维滤纸和微塑料的总质量。
[0072]
通过多次计算，所得到回收率可达到92.06
±
9.39％，证明该方面可以实现对鸡蛋中有机成分的去除，并且有效的将微纳塑料分离出来。
[0073]
对照例1
[0074]
样品染色后将装有染色玻璃纤维滤纸的培养皿放置于60℃的烘箱中进行孵育染色，其他和实施例1保持一致，进行检测。
[0075]
检测结果为：由于烘箱的温度会加速染色剂的溶剂蒸发速度，导致染色剂在玻璃纤维滤纸上失去流动性，从而在显微镜下观察时只能发现小部分微纳塑料被染色，绝大部分无法被染色。染色的主要目的是为了辅助观察从而实现对微纳塑料的计数并减少误差，当微纳塑料没有被完全染色的时候，就会使的观察和计数的时候出现较大的误差，无法实现对微纳塑料进行定量的目标。而使用水浴锅的话，既可以提供60℃的温度来进行孵育，同时还可以保证染色剂的溶剂不会过快蒸发，保持其流动性，因此具有更好的染色效果。
[0076]
对照例2
[0077]
使用荧光显微镜进行观察的时候将荧光激发波长换为520nm，其他和实施例1保持一致，进行检测。
[0078]
检测结果为：当荧光激发波长为520nm的时候，无法在显微镜下观察到荧光图像；当荧光激发波长为480nm的时候，可以在显微镜下观察到较好的荧光图像。
[0079]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的技术和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种禽蛋中微纳塑料的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)禽蛋的预处理：打破禽蛋，保留蛋清与蛋黄，并将蛋液搅拌均匀；(2)禽蛋液的消化：向搅拌均匀的蛋液中加入koh溶液，并放入摇床中进行消化；(3)蛋液的过滤：待消化后的蛋液冷却后，使用抽滤装置对蛋液进行过滤，之后将滤纸烘干；(4)染色剂的配制：取尼罗红固体溶解于丙酮中，并在0-4℃的条件下保存于暗处；(5)样品的染色：染色之前用超纯水稀释染色剂尼罗红的丙酮溶液，并滴加在步骤(3)得到的过滤蛋液后的滤纸上，然后放入水浴锅中进行孵育；(6)样品的镜检：将孵育之后的滤纸用显微镜分别在明场下和荧光激发下的观察计算微纳塑料的浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中koh溶液的浓度为10％。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中在摇床中震荡，时间为24～48h，温度为60
±
1℃，转速为100
±
5rpm。4.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中过滤所采用的滤纸为玻璃纤维滤纸。5.根据权利要求1～4任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中染色剂的浓度为1mg/ml。6.根据权利要求1～5任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中所述的要将染色剂稀释至20μg/ml后使用。7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中孵育的条件为：温度为50
±
1℃，时间为30
±
5min。8.根据权利要求1～7任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(6)中荧光激发的发射波长为450-490nm。9.权利要求1-8任一项所述的检测方法在食品检测领域中的应用。10.权利要求1-8任一项所述的检测方法在在检测禽蛋中微纳塑料的应用。

技术总结
本发明公开了一种禽蛋中微纳塑料的检测方法，属于食品检测领域。本发明以鸡蛋为例进行解释说明，对鸡蛋进行了包括消化、过滤等前处理操作，已达到更好的将微纳塑料从鸡蛋中分离出来的效果；以尼罗红染色的方法能够提高镜检的准确度；配合衰减全反射傅里叶红外光谱以及扫描电子显微镜能够更好地对鸡蛋中的微纳塑料进行定性；加标回收率实验表示该方法的精确度和准确度较好。本发明的方法可以实现对禽蛋中微纳塑料的分离以及后续的定量与定性，为禽蛋中微纳塑料的初步定性定量检测提供了一种快速便捷的检测方法。种快速便捷的检测方法。种快速便捷的检测方法。


技术研发人员：姚卫蓉 刘青润 谢云飞 于航 杨方威
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2021.10.21
技术公布日：2022/1/28