玉米南方锈病病原菌潜育期PCR定量检测方法及试剂盒

id no.1-3。
7.进一步地，所述方法为用于检测多堆柄锈菌潜育状态下的侵染量的定量检测方法。
8.进一步地，所述方法中还使用了根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针。
9.进一步地，所述根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针核苷酸序列为seq id no.4-6。
10.进一步地，所述方法包括建立多堆柄锈菌和玉米的qpcr标准曲线；样品dna提取；分别使用多堆柄锈菌的引物及探针和玉米的引物及探针进行qpcr扩增；将ct值分别通过多堆柄锈菌和玉米的标准曲线计算出样品中病原菌的dna量和玉米的dna量。
11.进一步地，所述方法还包括计算分子病情指数mdi的步骤：
[0012][0013]
优选地，玉米dna的标准曲线方程为y＝-0.303x+9.256(r2＝0.995，p＜0.001)；玉米南方锈菌dna的标准曲线方程为y＝-0.288x+6.842(r2＝0.997，p＜0.001)。
[0014]
另一方面，本技术提供了一种用于检测多堆柄锈菌潜育状态下的侵染量的试剂盒，其特征在于，包括根据多堆柄锈菌的its序列设计的引物和探针以及根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针。
[0015]
进一步地，所述根据多堆柄锈菌的its序列设计的引物和探针核苷酸序列为seq id no.1-3。
[0016]
进一步地，所述根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针核苷酸序列为seq id no.4-6。
[0017]
优选地，所述试剂盒中还包核酸提取和pcr反应用试剂，核酸提取和pcr反应用试剂可选市售种类和根据本领域工具书自制的种类。
[0018]
优选地，本技术的方法和试剂盒可用于以下方面：
[0019]
(1)在玉米南方锈菌鉴定的应用；
[0020]
(2)在玉米南方锈菌定量检测的应用；
[0021]
(3)在玉米南方锈菌潜育期侵染量的应用；
[0022]
(4)在玉米南方锈菌预测预报的应用；
[0023]
(5)在玉米南方锈病防治中的应用；
[0024]
(6)在玉米南方锈菌早期分子检测的应用
[0025]
有益效果：
[0026]
本发明根据多堆柄锈菌的its序列和玉米actin2基因序列分别设计多堆柄锈菌特异性引物ppof/ppor和taqman探针ppop以及玉米特异性引物zmf/zmr和taqman探针zmp，经测定引物和探针均具有较高的特异性和灵敏度，建立了玉米南方锈菌和玉米的qpcr扩增体系。以定量测定玉米南方锈菌在潜育状态下的侵染量，以期实现玉米南方锈病的早期分子检测，为该病害的早期预测和防治提供技术支撑。
附图说明
[0027]
图1显示多堆柄锈菌引物ppof/ppor的探针ppop的特异性检测结果；
no.2)和探针ppop(hex-acacatcaagtcaatccactccatct-bhq1，seq id no.3)。根据玉米的actin2基因序列，用beacon designer 8.2软件设计引物zmf(5＇-cctgatgaagatccttactg-3＇，seq id no.4)/zmr(5＇-ctgcaccgattgtgataa-3＇，seq id no.5)和探针zmp(fam-ctacgactgccgagcgagaa-bhq1，seq id no.6)。引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。
[0040]
以相同浓度的多堆柄锈菌dna、其他11种病原菌dna和健康玉米叶片dna为模板，进行qpcr扩增，每个样品3个重复，确定引物ppof/ppor和探针ppop的特异性。将多堆柄锈菌dna用ddh2o 10倍梯度稀释为100、10、1、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
ng/μl共7个浓度进行灵敏度检测，每个浓度3次重复。20μl反应体系：10
×
pcr buffer(mg
2+
plus)2μl、2.5mmol/l dntp mixture 1.2μl、10μmol/l上下游引物各0.4μl、10μmol/l探针0.3μl、5u/μl taq酶0.3μl、dna模板2μl、ddh2o 13.4μl。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。
[0041]
多堆柄锈菌特异性结果如图1所示：多堆柄锈菌扩增引物ppof/ppor和探针ppop的特异性检测结果表明，只有以多堆柄锈菌dna为模板时能扩增出来，而其他11种对照病原菌和健康玉米叶片dna均没有扩增曲线，表明此对引物ppof/ppor和探针ppop对多堆柄锈菌具有特异性，能够将多堆柄锈菌与其他常见玉米病原菌区分开，且不会受到玉米叶片dna的影响。
[0042]
以相同浓度的7个不同玉米品种叶片dna和多堆柄锈菌及其他11个病原菌dna为模板，进行qpcr扩增，每个样品3个重复，确定引物zmf/zmr和探针zmp的特异性。将玉米dna用ddh2o 10倍梯度稀释为100、10、1、10-1
、10-2
、10-3
ng/μl共6个浓度，每个浓度3次重复，通过qpcr扩增进行灵敏度检测。20μl反应体系：10
×
pcr buffer(mg
2+
plus)2μl、2.5mmol/l dntp mixture 1.2μl、10μmol/l上下游引物各0.3μl、10μmol/l探针0.25μl、5u/μl taq酶0.25μl、dna模板2μl、ddh2o 13.7μl。反应程序：94℃预变性4min；94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。
[0043]
玉米特异性结果如图2所示：玉米扩增引物zmf/zmr和探针zmp的特异性检测结果表明，只有以不同品种玉米dna为模板时能扩增出来，而其他对照病原菌和多堆柄锈菌dna均没有扩增曲线(图2)，表明此对引物和探针对玉米具有特异性，不会受到玉米品种和玉米上病原菌dna的影响。
[0044]
灵敏度结果如图3和图4所示：qpcr扩增灵敏度检测结果显示，随着dna浓度的降低，对应的ct值逐渐增大。在多堆柄锈菌7个浓度中前6个浓度均可扩增出且基本呈10倍梯度关系，而仅10-4
ng/μl由于与前一浓度不成10倍关系(图3)，所以检测不够准确而排除，因此灵敏度可达到10-3
ng/μl。在玉米6个浓度中前五个浓度均可扩增出且基本呈10倍梯度关系，仅10-3
ng/μl扩增曲线的荧光值低于阈值，检测不到荧光信号(图4)，表明该体系检测的灵敏度为10-2
ng/μl。
[0045]
实施例2潜育期多堆柄锈菌的定量分析
[0046]
qpcr标准曲线的建立：
[0047]
为对潜育期多堆柄锈菌进行定量分析，需要分别建立多堆柄锈菌和玉米的qpcr标准曲线。将“主要材料、试剂和方法”部分提取的多堆柄锈菌dna梯度稀释为100、10、1、10-1
、10-2
、10-3
ng/μl共6个浓度，作为模板进行qcr扩增，并用ddh2o作阴性对照，每个浓度3个重
复，得到各自的循环阈值(threshold cycle，ct)，分析ct值与已知多堆柄锈菌dna浓度的关系，以ct值为横坐标、dna浓度对数值为纵坐标制作标准曲线，并建立线性方程。将“主要材料、试剂和方法”部分提取的玉米dna梯度稀释为100、10、1、10-1
、10-2
ng/μl共5个浓度，作为模板进行qpcr扩增，并用ddh2o作阴性对照，每个浓度3个重复。采用上述方法建立ct值与玉米dna浓度对数值之间的线性方程。
[0048]
结果表明：ct值与dna量的对数值之间呈负相关，以qpcr扩增的ct值为x轴，以dna初始浓度的对数值为y轴，建立多堆柄锈菌dna的标准曲线方程为y＝-0.288x+6.842(r2＝0.997，p＜0.001)，扩增效率为93.9％；建立玉米dna的标准曲线方程为y＝-0.303x+9.256(r2＝0.995，p＜0.001)，扩增效率为100.7％；表明建立的标准曲线线性好，扩增效率高。
[0049]
qpcr定量检测接种后叶片中病原菌的变化：
[0050]
选取生长至3-4叶期的郑单958玉米幼苗，每盆10株，洗苗(用手指轻捋叶片2-3下)后备用。
[0051]
收集多堆柄锈菌新鲜夏孢子，用含2
‰
tween-80水溶液配制成5个不同浓度120 000、24000、4 800、960、480个/ml的孢子悬浮液。将配好的孢子悬浮液均匀地喷布于玉米叶片上，每个浓度取25ml平均地接种于12盆苗，其中每4盆为1个重复，每个浓度3个重复。将接菌后的玉米苗放入装有少量水的保湿箱中，保湿24h后取出，继续在温室培养。
[0052]
接种后24h进行第1次采样，用直径6mm打孔器在玉米叶片上打孔取圆片，每株玉米取第2、3片叶子，每片叶子打1-2个孔，每个重复共采集120片左右圆片，收集圆片装入干净的信封，并及时置于-20℃冰箱保存。之后每隔1d采集1次样品，直到叶片的第一个孢子堆破裂为止，周期为10-11d，共采集5次样品，即分别为接种后第1、3、5、7、9d。样品采集后将采集样品用无菌水清洗后，按照1.2.1方法全部提取dna。将dna稀释5倍，每个样品分别用多堆柄锈菌的引物及探针和玉米的引物及探针进行qpcr扩增，反应体系和程序同1.2.2，每个样品设置3次技术重复。将qpcr检测所得的ct值分别通过多堆柄锈菌和玉米的标准曲线计算出样品中病原菌的dna量和玉米的dna量。
[0053]
数据分析
[0054]
样品中病原菌dna量远远低于玉米dna的量，经标准曲线得到的病原菌dna量用pg为单位，玉米dna量用ng为单位。每个样品各有病原菌的量和玉米的量，用以下方法计算分子病情指数(molecular-detected disease index，mdi)。用excel软件建立mdi和天数之间的关系，分析不同接种浓度下mdi随时间的动态变化。
[0055][0056]
qpcr检测结果表明，所有浓度处理均能够在接种后1d即检测到目标病原菌，表明此方法具有较高的灵敏度。将mdi数据做对接种后天数的曲线分析，发现潜育期内多堆柄锈菌在玉米叶片中呈指数增长趋势，以接种后天数为x，mdi为y，分别建立不同接种浓度下mdi与接种后天数的指数方程，如图5所示。120000spores/ml接种浓度所得的方程为y＝0.6070e
0.6327x
(r2＝0.9433，p＝0.0058)，表现为初始侵入叶片的病原菌量较大，且病原菌的量在叶片中快速增长；24000spores/ml、4800spores/ml、960spores/ml、480spores/ml接种浓度所得的方程分别为：y＝0.0310e
0.8052x
(r2＝0.9636,p＝0.0030)、y＝0.1089e
0.4647x
(r2＝0.8110,p＝0.0371)、y＝0.0369e
0.4232x
(r2＝0.9880,p＝0.0006)、y＝0.0075e
0.5353x
(r2＝
0.7868，p＝0.0448)，基本表现为随着接种浓度的降低，初始侵入的病原菌量减少，病原菌量的增长速度也减慢。

技术特征：
1.一种检测玉米南方锈病病原菌多堆柄锈菌的pcr定量检测方法，其特征在于，所述方法中使用了根据多堆柄锈菌的its序列设计的引物和探针。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述根据多堆柄锈菌的its序列设计的引物和探针核苷酸序列为seq id no.1-3。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法为用于检测多堆柄锈菌潜育状态下的侵染量的方法。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法中还使用了根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针核苷酸序列为seq id no.4-6。6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其中所述方法包括建立多堆柄锈菌和玉米的qpcr标准曲线；样品dna提取；分别使用多堆柄锈菌的引物及探针和玉米的引物及探针进行qpcr扩增；将ct值分别通过多堆柄锈菌和玉米的标准曲线计算出样品中病原菌的dna量和玉米的dna量。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括计算分子病情指数mdi的步骤：8.一种用于检测多堆柄锈菌潜育状态下的侵染量的试剂盒，其特征在于，包括根据多堆柄锈菌的its序列设计的引物和探针以及根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述根据多堆柄锈菌的its序列设计的引物和探针核苷酸序列为seq id no.1-3。10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述根据玉米actin2基因序列设计的引物和探针核苷酸序列为seq id no.4-6。

技术总结
本发明涉及一种基于实时荧光定量PCR技术对玉米南方锈病病原菌多堆柄锈菌检测技术和试剂盒。本申请根据玉米南方锈菌的ITS和玉米的Actin2基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，基于这两对引物和探针，建立玉米南方锈菌潜育期的PCR定量检测体系。本发明的玉米南方锈菌和玉米的引物和探针，具有特异性和灵敏度高的特点。本发明建立的多堆柄锈菌潜育期PCR定量检测体系，不仅能够检测潜育期的多堆柄锈菌，还能够对侵染后不同时间的侵染量进行检测，本体系可用于多堆柄锈菌的早期检测和定量检测。本发明涉及的研究方法能够有效应用于多堆柄锈菌的早期分子检测，在玉米南方锈病的早期预测预报和综合治理等方面就有重要意义。期预测预报和综合治理等方面就有重要意义。期预测预报和综合治理等方面就有重要意义。


技术研发人员：马占鸿 张克瑜 孙秋玉 李磊福 黄莉群 董佳玉 高建孟
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2021.12.09
技术公布日：2022/1/28