本文所公开的主题涉及用于调节细胞培养中重组腺相关病毒(raav)产生的组合物和方法。具体地，本文所公开的主题涉及通过对aav rep蛋白的表达的可逆翻译后调节来克服aav rep蛋白介导的细胞毒性，从而实现受调节的raav产生的策略。
背景技术：
1、存在多种aav产生系统用于在细胞培养中产生raav。这些系统包括人胚肾(hek)293细胞的质粒瞬时转染、hela生产细胞系(producer cell line)、基于bhk21的平台和基于杆状病毒的产生系统。这些系统中的每一者都有优点和缺点。例如，鉴于腺病毒e1a蛋白在启动raav的产生中的重要性，表达e1a的细胞(例如，hek293细胞)对于产生raav是有吸引力的，因为它们消除了另外将e1a基因引入宿主细胞基因组的需要。表达e1a的细胞，例如hek293细胞，还可以提供生长的容易性和在悬浮液中生长的适应性。然而，创建稳定且可传代的产生raav的表达e1a的细胞系的工作受到由e1a诱导的aav rep蛋白积累所引起的细胞毒性的阻碍。鉴于前述，本领域需要新的raav产生策略，其中可以调节rep蛋白的积累以避免rep介导的细胞毒性，从而实现受调节的raav产生。
技术实现思路
1、在某些实施方案中，本公开涉及调节重组腺相关病毒(raav)载体颗粒的产生的方法，该方法包括：将包含目的基因的raav以及编码融合蛋白的核酸引入细胞中，其中该融合蛋白包含aav蛋白和降解配体依赖性降解结构域；在适用于产生该raav载体颗粒的条件下培养细胞；以及使该细胞与降解配体接触，其中该降解配体与降解结构域结合以调节aav蛋白的表达并由此调节raav载体颗粒的产生。
2、在某些实施方案中，编码融合蛋白的核酸包含rep蛋白、接头和降解配体依赖性降解结构域。在某些实施方案中，配体依赖性降解结构域来源于fkbp。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域为dhfr。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域为生长素诱导的降解结构域。在某些实施方案中，降解配体为小分子配体。在某些实施方案中，小分子为shield1。在某些实施方案中，小分子为tmp。在某些实施方案中，小分子为生长素。在某些实施方案中，小分子为dtag13。
3、在某些实施方案中，编码融合蛋白的核酸包含cap蛋白、接头和降解配体依赖性降解结构域。在某些实施方案中，配体依赖性降解结构域来源于fkbp。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域为dhfr。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域为生长素诱导的降解结构域。在某些实施方案中，降解配体为小分子配体。在某些实施方案中，小分子为shield1。在某些实施方案中，小分子为tmp。在某些实施方案中，小分子为生长素。在某些实施方案中，小分子为dtag13。
4、在某些实施方案中，编码融合蛋白的核酸包含辅助蛋白、接头和降解配体依赖性降解结构域。在某些实施方案中，辅助蛋白为e2。在某些实施方案中，配体依赖性降解结构域来源于fkbp。降解配体依赖性降解结构域为dhfr。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域为生长素诱导的降解结构域。在某些实施方案中，降解配体为小分子配体。在某些实施方案中，小分子为shield1。在某些实施方案中，小分子为tmp。在某些实施方案中，小分子为生长素。在某些实施方案中，小分子为dtag13。
5、在某些实施方案中，细胞为表达e1a的细胞。在某些实施方案中，表达e1a的细胞为hek293细胞。
6、在某些实施方案中，rep蛋白为rep78、rep68、rep52或rep40蛋白。
7、在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域融合至aav蛋白的c末端。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域融合至aav蛋白的n末端。
8、在某些实施方案中，接头为柔性接头。在某些实施方案中，接头为刚性接头。
9、在某些实施方案中，本公开的方法包括将编码cap蛋白的核酸引入细胞中。在某些实施方案中，使用至少一种质粒将编码融合蛋白的核酸和编码cap蛋白的核酸引入细胞中。在某些实施方案中，使用相同的质粒将编码融合蛋白的核酸和编码cap蛋白的核酸引入细胞中。在某些实施方案中，使用单独的质粒将编码融合蛋白的核酸和编码cap蛋白的核酸引入细胞中。在某些实施方案中，编码aav融合蛋白的基因和/或cap基因处于调节元件的控制下。在某些实施方案中，调节元件为启动子。在某些实施方案中，调节元件为tet应答元件。
10、在某些实施方案中，细胞为真核细胞。在某些实施方案中，真核细胞为动物细胞。在某些实施方案中，动物细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞为hek细胞。
11、在某些实施方案中，本公开涉及产生raav的细胞，其中该细胞包含编码融合蛋白的核酸，该融合蛋白包含aav蛋白和降解配体依赖性降解结构域。在某些实施方案中，编码融合蛋白的核酸包含aav蛋白、接头和降解配体依赖性降解结构域。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域来源于fkbp。在某些实施方案中，配体依赖性降解结构域来源于fkbp。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域为dhfr。在某些实施方案中，降解配体依赖性降解结构域为生长素诱导的降解结构域。在某些实施方案中，降解配体为小分子配体。在某些实施方案中，小分子为shield1。在某些实施方案中，小分子为tmp。在某些实施方案中，小分子为生长素。在某些实施方案中，小分子为dtag13。
12、在某些实施方案中，产生raav的细胞为真核细胞。在某些实施方案中，真核细胞为动物细胞。在某些实施方案中，动物细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞为hek细胞。在某些实施方案中，细胞为表达e1a的细胞。在某些实施方案中，表达e1a的细胞为hek293细胞。
13、在某些实施方案中，产生raav的细胞包含经由接头融合至aav蛋白的c末端的配体依赖性降解结构域。在某些实施方案中，配体依赖性降解结构域经由接头融合至aav蛋白的n末端。在某些实施方案中，接头为柔性接头。在某些实施方案中，接头为刚性接头。
14、在某些实施方案中，细胞包含编码cap蛋白的核酸。在某些实施方案中，使用至少一种质粒将编码融合蛋白的核酸和编码cap蛋白的核酸引入细胞中。在某些实施方案中，使用相同的质粒将编码融合蛋白的核酸和编码cap蛋白的核酸引入细胞中。在某些实施方案中，使用单独的质粒将编码融合蛋白的核酸和编码cap蛋白的核酸引入细胞中。在某些实施方案中，编码aav融合蛋白的基因和/或cap基因处于调节元件的控制下。在某些实施方案中，调节元件为启动子。在某些实施方案中，调节元件为tet应答元件。
1.一种调节重组腺相关病毒(raav)载体颗粒的产生的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸编码融合蛋白，其中所述融合蛋白包含所述aav蛋白、接头和降解配体依赖性降解结构域。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述aav蛋白为cap。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述aav蛋白为辅助蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述辅助蛋白为e2。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述aav蛋白为rep。
7.根据权利要求1至6所述的方法，其中配体依赖性降解结构域来源于fkbp。
8.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述降解配体依赖性降解结构域为二氢叶酸还原酶(dhfr)。
9.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述降解配体依赖性降解结构域为生长素诱导的降解结构域。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述降解配体为小分子配体。
11.根据权利要求7所述的方法，其中小分子为shield1。
12.根据权利要求8所述的方法，其中小分子为甲氧苄氨嘧啶(tmp)。
13.根据权利要求9所述的方法，其中小分子为生长素。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞为表达e1a的细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达e1a的细胞为hek293细胞。
16.根据权利要求6至15中任一项所述的方法，其中rep蛋白为rep78、rep68、rep52或rep40蛋白。
17.根据权利要求6至16中任一项所述的方法，其中所述降解配体依赖性降解结构域融合至rep蛋白的c末端。
18.根据权利要求6至16中任一项所述的方法，其中所述降解配体依赖性降解结构域融合至rep蛋白的n末端。
19.根据权利要求2所述的方法，其中所述接头为柔性接头。
20.根据权利要求2所述的方法，其中所述接头为刚性接头。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其包括将编码cap蛋白的核酸引入所述细胞中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中使用至少一种质粒将编码所述融合蛋白的所述核酸和编码cap蛋白的所述核酸引入所述细胞中。
23.根据权利要求21所述的方法，其中使用相同的质粒将编码所述融合蛋白的所述核酸和编码cap蛋白的所述核酸引入所述细胞中。
24.根据权利要求21所述的方法，其中使用单独的质粒将编码所述融合蛋白的所述核酸和编码cap蛋白的所述核酸引入所述细胞中。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中rep、cap或辅助基因处于调节元件的控制下。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述调节元件为启动子。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述调节元件包括tet应答结合元件。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述真核细胞为动物细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为hek细胞。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
33.一种产生raav的细胞，其中所述细胞包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含aav蛋白和降解配体依赖性降解结构域。
34.根据权利要求33所述的产生raav的细胞，其中所述核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含aav蛋白、接头和降解配体依赖性降解结构域。
35.根据权利要求33或34所述的产生raav的细胞，其中所述aav蛋白选自由rep、cap和辅助蛋白组成的组。
36.根据权利要求35所述的产生raav的细胞，其中所述aav蛋白为cap。
37.根据权利要求35所述的产生raav的细胞，其中所述aav蛋白为辅助蛋白。
38.根据权利要求35所述的产生raav的细胞，其中所述aav蛋白为rep。
39.根据权利要求33至38所述的产生raav的细胞，其中所述降解配体为小分子配体。
40.根据权利要求33至39所述的产生raav的细胞，其中所述降解配体依赖性降解结构域来源于fkbp。
41.根据权利要求33至39所述的产生raav的细胞，其中所述降解配体依赖性降解结构域为二氢叶酸还原酶(dhfr)。
42.根据权利要求33至39所述的产生raav的细胞，其中所述降解配体依赖性降解结构域为生长素诱导的降解结构域。
43.根据权利要求40所述的产生raav的细胞，其中小分子为shield1。
44.根据权利要求41所述的产生raav的细胞，其中小分子为甲氧苄氨嘧啶(tmp)。
45.根据权利要求42所述的产生raav的细胞，其中小分子为生长素。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为真核细胞。
47.根据权利要求46所述的产生raav的细胞，其中所述真核细胞为动物细胞。
48.根据权利要求47所述的产生raav的细胞，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
49.根据权利要求48所述的产生raav的细胞，其中所述哺乳动物细胞为hek细胞。
50.根据权利要求48所述的产生raav的细胞，其中所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
51.根据权利要求33至45所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为表达e1a的细胞。
52.根据权利要求51所述的产生raav的细胞，其中所述表达e1a的细胞为hek293细胞。
53.根据权利要求38至45中任一项所述的产生raav的细胞，其中配体依赖性降解结构域经由所述接头融合至rep蛋白的c末端。
54.根据权利要求38至45中任一项所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且配体依赖性降解结构域经由所述接头融合至rep蛋白的n末端。
55.根据权利要求34所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且所述接头为柔性接头。
56.根据权利要求34所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且所述接头为刚性接头。
57.根据权利要求48至56所述的产生raav的细胞，其进一步包括将编码cap蛋白的核酸引入所述细胞中。
58.根据权利要求57所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且使用至少一种质粒将编码所述融合蛋白的所述核酸和编码cap蛋白的所述核酸引入所述细胞中。
59.根据权利要求57所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且使用相同的质粒将编码所述融合蛋白的所述核酸和编码cap蛋白的所述核酸引入所述细胞中。
60.根据权利要求57所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且使用单独的质粒将编码所述融合蛋白的所述核酸和编码cap蛋白的所述核酸引入所述细胞中。
61.根据权利要求48至60中任一项所述的产生raav的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，并且rep、cap或辅助基因处于调节元件的控制下。
62.根据权利要求61所述的产生raav的细胞，其中所述调节元件为启动子。
63.根据权利要求61所述的产生raav的细胞，其中所述调节元件包括tet应答结合元件。
64.根据权利要求1至32中任一项所述的方法或根据权利要求33至63中任一项所述的产生raav的细胞，其中两种或更多种不同的aav蛋白独立地融合至降解配体依赖性降解结构域。
65.根据权利要求64所述的方法或产生raav的细胞，其中每种不同的aav蛋白独立地融合至不同的降解配体依赖性降解结构域。
