本发明涉及一种具有酶响应木质素型载体及其纳米颗粒的制备方法，具体涉及碱木质素的改性和以改性木质素为载体负载脂溶性生物活性物质制备纳米颗粒，可应用于食品、医药和饲料技术等领域。
背景技术：
1、木质素在自然界中的储备量仅次于纤维素，全球年产量约为600亿吨，作为可再生的生物质能源，它的热解产品已被证明是能源、化学品和材料中部分化石能源的最佳替代品之一。然而，木质素增值利用的主要障碍是芳香族化合物的多样性和不规则聚合物结构的复杂性，工业上主要作为制浆造纸工艺和生物精炼厂的副产物，增殖产品仅仅只有5％，绝大部分作为废弃物用于燃烧供热和发电，或者直接以“黑液”形式排放，极大地浪费了绿色资源(schneider w.d.h.,et al.biotechnology advances,2021,47:107685)。尽管如此，可再生的木质素是具有生物相容性、可生物降解和毒副作用性小的多酚类聚合物，木质素中的苯环、羟基、共轭结构等使其具有抗氧化性和紫外吸收的性质，而工业木质素中含有更多的酚羟基，表现出抗菌特性和益生菌效应，有利于肠道健康(baurhoo b.,etal.animal feed science and technology,2008,144(3-4):175-184)。同时木质素还是两亲性聚合物，可应用于递送系统，如纳米颗粒、pickering乳液、水凝胶、纳米胶束等包埋递送系统。
2、生物活性物质是指对生命活动起调节作用的生理活性成分，它可作为功能性食品、膳食补充剂或饲料添加剂，有些生物活性物质还具有药物的作用。大多数的生物活性物质是脂溶性的，主要问题是溶解度差，且化学性质不稳定，易被光、热、氧破坏(luo y.,etal.journal of agricultural and food chemistry,2020,68(46):12993-13000)。包埋递送系统可解决生物活性物质溶解性低和稳定性差的问题，还可以达到靶向控制释放的作用，提高生物利用率。基于木质素优异的生物性能和两亲性，人们广泛研究了木质素纳米颗粒(lnps)的制备。
3、lu等人对碱木质素进行醚化改性，然后用十二烷基苯磺酸钠对碱木质素进行疏水改性，采用溶剂置换法制备了负载布洛芬的纳米颗粒，该纳米颗粒具有ph敏感性(lu f.,etal.industrial crops and products,2023,202:117012)。alqahtani m.s.等人利用柠檬酸作为交联剂制备了负载姜黄素的有机溶剂lnps，它具有较高的包封率和控制释放的效果(alqahtani m.s.,et al.journal of materials chemistry b,2019,7(28):4461-4473)。meng等人利用硬脂酰氯对木质素进行超疏水改性，改性得到的木质素硬脂酸酯通过自组装得到了可以控制的纳米结构(meng h.,et al.industrial crops and products,2022,183:114969)。在这些研究中，虽然都对其进行了酯化或醚化改性，增加木质素的两亲性，提高lnps的稳定性和包封率，或者具有靶向控制释放的功能，如ph响应性，但是对于脂肪酶响应木质素型载体及其纳米颗粒的报道非常罕见。
4、以木质素递送、保护和控制释放脂溶性生物活性物质，可提高活性物质的生物利用率和木质素的高值化利用率。具有脂肪酶响应的高分子聚合物作为递送系统材料的研究少见报道。而对于具有脂肪酶响应的木质素在这方面的报道更少之又少，几乎没有。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种具有酶响应木质素型载体及其纳米颗粒的制备方法，载体材料可以递送、保护和控制释放脂溶性生物活性物质，从而提高活性物质的生物利用率和木质素的高值化利用率。
2、本发明通过对碱木质素进行醚化和酯化改性，制备具有脂肪酶响应的木质素型载体，载体的结构通式如下：
3、
4、式中：r＝h或ch3；r1＝ch2或co(ch2)ncooch2或coch＝chcooch2，n＝1,2,3,4；r2＝cocnh2n+1，n＝7,9,11,13,15,17；或者r2＝cocnh2n-1，n＝13,15,17；r3＝r2或h。
5、本发明基于肠道中存在脂肪酶，能够响应刺激油脂水解为游离脂肪酸、甘油单酯和甘油双酯等物质，所以本发明往木质素上接入具有长碳链的甘油酯基团，使其首先通过自组装形成纳米颗粒，提高脂溶性生物活性物质的载药量；然后在脂肪酶作用下，纳米颗粒中的特定酯键断裂被破坏，达到载体控制释放的作用；木质素甘油酯水解生成的游离脂肪酸，以及混合肠液中的磷脂、胆碱盐等物质可以形成混合胶束或囊泡，从而提高脂溶性生物活性物质的生物利用率。
6、本发明提供了如下技术方案以实现上述目的：
7、一种具有酶响应木质素型载体及其纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
8、(1)碱木质素的改性：
9、将碱木质素与去离子水混合，调节体系ph值至弱碱性，30～80℃碱化0.5～3h，然后缓慢加入溶解在有机溶剂i中的脂肪酸缩水甘油酯，搅拌反应，加入过去离子水结束反应，调节ph值至酸性，透析反应混合液，再利用有机溶剂ii离心洗涤，对沉淀进行真空干燥，得到木质素-脂肪酸甘油单酯；
10、或者，将碱木质素与有机碱混合，50～90℃搅拌，然后加入酸酐搅拌反应4～6h，加入两倍量的去离子水结束反应，调节ph值至酸性，水洗离心，对沉淀进行真空干燥，得到羧酸木质素；再将羧酸木质素、季铵盐与去离子水混合，调节体系ph值至弱碱性，30～80℃碱化0.5～3h，然后缓慢加入溶解在有机溶剂i中的脂肪酸缩水甘油酯，搅拌反应，加入过量去离子水结束反应，调节ph值至酸性，透析反应混合液，再利用有机溶剂ii离心洗涤，对沉淀进行真空干燥，得到木质素-脂肪酸甘油双酯；
11、(2)纳米颗粒的制备：
12、称取改性木质素、非离子表面活剂和去离子水，将其混合均匀配制成ph值为7.5～10.0的水溶液，得到水相；称取与上述水相中同一种改性木质素、生物活性物质、酰基甘油和有机溶剂，将其混合均匀，得到油相；在搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，再搅拌3h以上，然后进行超声波分散和蒸馏，得到纳米颗粒分散液，通过干燥制得纳米颗粒。
13、进一步优选为：步骤(1)中，以碱木质素中羟基摩尔数计，碱木质素与脂肪酸缩水甘油酯的摩尔比为5:1～1:5；碱木质素与酸酐的摩尔比为1:1～1:30；以羧酸木质素中羟基摩尔数计，羧酸木质素与脂肪酸缩水甘油酯的摩尔比为5:1～1:5；以羧酸木质素中羧基摩尔数计，羧酸木质素与季铵盐的摩尔比为1:0.05～1:0.5。
14、进一步优选为：步骤(1)中，所述脂肪酸缩水甘油酯为硬脂酸缩水甘油酯、油酸缩水甘油酯、棕榈酸缩水甘油酯、棕榈油酸缩水甘油酯、肉豆蔻酸缩水甘油酯、肉豆蔻油酸缩水甘油酯、月桂酸缩水甘油酯、癸酸缩水甘油酯和辛酸缩水甘油酯中的一种；所述酸酐包为丙二酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、胶酸酐和己二酸酐中的一种。
15、进一步优选为：步骤(1)中，所述有机碱为三乙胺、吡啶、环己亚胺、咪唑和哌啶中的一种；所述季铵盐为四甲基氯化铵、四乙基溴化铵和四丙基溴化铵中的一种。
16、进一步优选为：步骤(1)中，所述有机溶剂i为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种；所述有机溶剂ii为石油醚、环己烷、正己烷、甲醇和乙醇中的一种或两种。
17、进一步优选为：步骤(2)中，所述非离子表面活性剂质量分数为0.05～20％；改性木质素与脂溶性生物活性物质的质量比为1:10～10:1；酰基甘油与脂溶性生物活性物质的质量比为1:10～10:1。
18、进一步优选为：步骤(2)中，所述脂溶性生物活性物质为β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素、白藜芦醇、维生素a和姜黄素中的一种。
19、进一步优选为：步骤(2)中，所述非离子表面活性剂为碳链长度为c8～c18之间的烷基葡糖苷，十二烷基-β-d-麦芽糖苷、十六烷基-β-d-麦芽糖苷和碳链长度为12，14，16或18的聚氧乙烯失水山梨醇(20)脂肪酸酯中的一种；所述酰基甘油为单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯中的一种或两种以上；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮和二甲基亚砜中的一种或两种以上。
20、发明有益效果
21、(1)本发明通过醚化和酯化，引入具有长碳链的甘油酯基团，制备了酶响应木质素型载体，为工业木质素的增值利用提供了参考；
22、(2)本发明制备的酶响应木质素型纳米颗粒，具有较高的载药量和包封率，提高了生物活性物质的氧稳定性和光稳定性；
23、(3)本发明在碱木质素中引入酰基甘油结构，提高了改性木质素的封装能力，使其具有脂肪酶响应控制释放的效果，酶水解的游离脂肪酸对混合胶束或囊泡的形成是有利的，提高了脂溶性生物活性物质的生物利用率；
24、(4)本发明制备的酶响应木质素型载体及其纳米颗粒，具有较好的成本优势。
1.一种具有脂肪酶响应木质素型载体，其特征在于载体的结构通式如下：
2.一种具有脂肪酶响应木质素型纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，以碱木质素中羟基摩尔数计，碱木质素与脂肪酸缩水甘油酯的摩尔比为5:1～1:5；碱木质素与酸酐的摩尔比为1:1～1:30；以羧酸木质素中羟基摩尔数计，羧酸木质素与脂肪酸缩水甘油酯的摩尔比为5:1～1:5；以羧酸木质素中羧基摩尔数计，羧酸木质素与季铵盐的摩尔比为1:0.05～1:0.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述脂肪酸缩水甘油酯为硬脂酸缩水甘油酯、油酸缩水甘油酯、棕榈酸缩水甘油酯、棕榈油酸缩水甘油酯、肉豆蔻酸缩水甘油酯、肉豆蔻油酸缩水甘油酯、月桂酸缩水甘油酯、癸酸缩水甘油酯和辛酸缩水甘油酯中的一种；所述酸酐为丙二酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、胶酸酐和己二酸酐中的一种。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述有机碱为三乙胺、吡啶、环己亚胺、咪唑和哌啶中的一种；所述季铵盐为四甲基氯化铵、四乙基溴化铵和四丙基溴化铵中的一种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述有机溶剂i为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种；所述有机溶剂ii为石油醚、环己烷、正己烷、甲醇和乙醇中的一种或两种。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述非离子表面活性剂质量分数为0.05～20％；改性木质素与脂溶性生物活性物质的质量比为1:10～10:1；酰基甘油与脂溶性生物活性物质的质量比为1:10～10:1。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述脂溶性生物活性物质为β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素、白藜芦醇、维生素a和姜黄素中的一种。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述非离子表面活性剂为碳链长度为c8～c18之间的烷基葡糖苷，十二烷基-β-d-麦芽糖苷、十六烷基-β-d-麦芽糖苷和碳链长度为12，14，16或18的聚氧乙烯失水山梨醇(20)脂肪酸酯中的一种；所述酰基甘油为单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯中的一种或两种以上；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮和二甲基亚砜中的两种或两种以上。
