本发明涉及生物工程领域，尤其涉及工程化外泌体基因工程细胞系的制备方法。
背景技术：
1、人的间充质干细胞(human mesenchymal stem cell，hmsc)具有多谱系分化的潜能。在一定的诱导条件下，能够分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，并且具有调节免疫、代谢、新生血管等功能。因而具备很高的临床应用和商业开发价值。
2、外泌体(exosomes)属于细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)的一种，大小为30-150nm，由细胞内的多泡小体(multi-vesicular bodies,mvb)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外。外泌体在生物体内的主要生物功能是广泛参与细胞间的物质运输与信息传递，因而外泌体天然具备跨越各种生物屏障的能力。同时，外泌体具有生物相容性高、免疫原性低、组织靶向性、生物条件下的稳定性高和半衰期长等优势，所以外泌体成为最具有应用前景的可以跨越生物屏障的新一代药物递送载体。
3、在外泌体的临床应用和药物递送研究中，最受关注和应用价值最高的是来源于msc的外泌体。这是因为：与肿瘤细胞来源的外泌体相比，msc外泌体天然包含多种能够呈现干细胞活性的生物分子(如细胞因子、mrnas、mirnas等)，同时其生物安全性更高；与其他干细胞或原代培养细胞相比，msc细胞的来源和培养更方便，也更适合制备外泌体。
4、目前msc来源的外泌体仍处于小规模制备和研发阶段，暂时还无法实现大规模的工程化生产和制备。其最大的制约瓶颈是msc细胞无法大规模工程化培养，因为msc原代细胞在连续传代培养过程中会发生复制性细胞衰老，表现为细胞分裂扩增能力的逐渐丢失，同时伴随基因表达谱的变化和干细胞活性的显著降低。通过增加原代msc细胞来源和数量的方式又难以保持批次间的稳定性和一致性。
5、解决这一核心制约瓶颈问题和技术难题的理想方法，是通过细胞永生化来阻止msc细胞的衰老。目前相关的研究报道相对较少。以前已报道的方法主要利用慢病毒载体或逆转录病毒载体转染，将htert或sv40lt整合到msc细胞的基因组，从而实现msc细胞的永生化。
6、提高细胞外泌体工程化生产的产量，有一种技术方案是通过基因工程方法增强外泌体的生物合成和分泌效率，从而进一步促进细胞外泌体的产生。研究报道，瞬时转染steap3(参与外泌体生物合成)、syndecan-4(sdc-4；支持内体膜形成多泡体的出芽)和细菌来源的l-天冬氨酸氧化酶片段(nadb；通过调节柠檬酸循环促进细胞代谢)的表达载体，可以显著提升外泌体的产量，而且此促进作用已在包括msc细胞的多种细胞系中得以验证。但是瞬时转染的外源基因同样无法在msc细胞中稳定维持表达，因而这一方案也难以在实践上应用于外泌体的大规模工程化生产中。
7、crispr/cas9基因编辑技术已经被广泛应用于各种物种细胞(包含人类各种细胞类型)基因组的定向编辑，将外源基因整合插入细胞染色体的基因组上时，与基于病毒载体转染的方法相比较，crispr/cas9技术更为成熟和稳定，而且可以方便快捷地将外源基因敲入基因组的任意指定位点。安全港位点(safe harbor site,shs)是已经被广泛证实和应用的基因组位点，在该位点插入外源基因通常不会造成基因组其他位点正常基因的异常转录。
8、利用crispr/cas9系统可以靶向性基因编辑的优势，可以将永生化基因或促进外泌体生产的外源基因分别靶向插入msc细胞基因组的特定位点，比如shs位点，既可以实现外源基因的稳定表达，也可以避免对基因组其它位置正常基因的干扰。
9、目前基于病毒转染的技术制备永生化msc时，由于永生化基因整合到染色体的几率很小，所以实验成功率比较低；且整合插入基因组的过程为自然发生的非靶向随机插入，得到的细胞系之间可能基因型互不相同，无法预测和控制是否对基因组和细胞的正常功能产生何种影响，也无法保证细胞系的稳定性和标准化。此外，病毒转染方法存在一定程度的生物安全问题(激活潜在疾病，细胞毒性，诱发基因突变，使细胞恶性转化)。
10、瞬时转染外泌体促进基因仅能在msc细胞中维持表达1～3天，难以应用于外泌体的大规模工程化生产中。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了工程化外泌体基因工程细胞系的制备方法。本发明通过增强外泌体的生物合成和分泌。在永生化的msc细胞系的基础上，将外泌体生物合成和分泌路径中的多个增效基因，以多顺反子方式通过基因编辑插入细胞基因组的安全港位点，实现了外源增效基因在msc细胞中长期稳定的基因表达，最终得到可以显著提升外泌体产量(至少5倍以上)的msc基因工程细胞系。本发明还采用基因编辑技术制备永生化的msc细胞系，使其可以无限制扩增和培养，从而解决外泌体生产制备时msc细胞母细胞数量上的大批量需求以及批次上的稳定性需求等核心问题。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体，包括：启动子、转录增强元件和多顺反子基因；所述多顺反子基因包含steap3基因、t2a调控序列、sdc-4基因、p2a调控序列、hsnadb基因、ires调控序列和红色荧光蛋白标签编码序列。
4、在本发明的一些实施方案中，上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体中，所述启动子包括：pef1a启动子或pcag启动子。
5、在本发明的一些实施方案中，上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体中，所述转录增强元件包括pucoe序列。
6、在本发明的一些实施方案中，上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体中，所述荧光蛋白标签序列包括红色荧光蛋白编码基因。
7、在本发明的一些实施方案中，上述红色荧光蛋白编码基因包括tdtomato。
8、在本发明的一些实施方案中，上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体：
9、所述转录增强元件具有：
10、(1)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或
11、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
12、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
13、所述多顺反子基因具有：
14、(4)、如seq id no:12所示的核苷酸序列；或
15、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
16、(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
17、所述steap3基因具有：
18、(7)、如seq id no:13所示的核苷酸序列；或
19、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
20、(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
21、所述sdc-4基因具有：
22、(10)、如seq id no:14所示的核苷酸序列；或
23、(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
24、(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
25、所述hsnadb基因具有：
26、(13)、如seq id no:15所示的核苷酸序列；或
27、(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
28、(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
29、所述t2a调控序列具有：
30、(16)如seq id no:16所示的核苷酸序列；或
31、(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
32、(18)、与(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
33、所述p2a调控序列具有：
34、(19)如seq id no:17所示的核苷酸序列；或
35、(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
36、(21)、与(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
37、所述ires调控序列具有：
38、(22)、如seq id no:18所示的核苷酸序列；或
39、(23)、如(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(22)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
40、(24)、与(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
41、所述红色荧光蛋白标签编码序列具有：
42、(25)、如seq id no:19所示的核苷酸序列；或
43、(26)、如(25)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(25)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
44、(27)、与(25)或(26)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
45、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:3的序列为：
46、
47、
48、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:12的序列为：
49、
50、
51、
52、
53、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:13的序列为：
54、
55、
56、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:14的序列为：
57、
58、
59、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:15的序列为：
60、
61、
62、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:16的序列为：
63、
64、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:17的序列为：
65、
66、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:18的序列为：
67、
68、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:19的序列为：
69、
70、
71、在本发明的一些实施方案中，上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体中还包括基因敲入辅助序列和切割识别序列；所述基因敲入辅助序列具有：
72、(28)、如seq id no:5所示的核苷酸序列；或
73、(29)、如(28)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(28)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
74、(30)、与(28)或(29)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
75、所述切割识别序列具有：
76、(31)、如seq id no:20所示的核苷酸序列；或
77、(32)、如(31)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(31)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
78、(33)、与(31)或(32)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
79、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:20的序列为：gcctcccccatagtaccattgg。
80、在本发明的一些实施方案中，上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体具有：
81、(34)、如seq id no:12所示的核苷酸序列；或
82、(35)、如(34)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(34)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
83、(36)、与(34)或(35)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
84、本发明还提供了上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体在制备外泌体中的应用。
85、本发明还提供了基因编辑酶载体，包括：启动子、n57编码序列、连接多肽、抗性基因编码序列、sgrna序列和crispr/cas9。
86、在本发明的一些实施方案中，上述基因编辑酶载体中，所述启动子包括pcag启动子或强u6启动子。
87、在本发明的一些实施方案中，上述基因编辑酶载体中，所述n57编码序列包括spcas9-n57。
88、在本发明的一些实施方案中，上述基因编辑酶载体中，所述连接多肽包括t2a多肽序列。
89、在本发明的一些实施方案中，上述基因编辑酶载体中，所述抗性基因编码序列包括嘌呤霉素抗性基因编码序列。
90、在本发明的一些实施方案中，上述基因编辑酶载体中，所述sgrna序列靶向shs231位点。
91、在本发明的一些实施方案中，上述基因编辑酶载体中，所述sgrna包括骨架结构序列和转录终止序列。
92、在本发明的一些实施方案中，上述基因编辑酶载体中所述sgrna序列具有：
93、(37)、如seq id no:21所示的核苷酸序列；或
94、(38)、如(37)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(37)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
95、(39)、与(37)或(38)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
96、(40)、如seq id no:22所示的核苷酸序列；或
97、(41)、如(40)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(40)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
98、(42)、与(40)或(41)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
99、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:21的序列为：gcctcccccatagtaccat。
100、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:22的序列为：tatgtgctcactgagtctga。
101、本发明还提供了上述基因编辑酶载体在通过基因编辑制备外泌体中的应用。
102、本发明还提供了外泌体的制备方法，包括：取上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体和上述基因编辑酶载体，转染或转化至永生化msc细胞，获得所述外泌体。
103、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述永生化细胞经永生化供体载体和基因编辑载体转染或转化至msc细胞获得。
104、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述永生化供体载体包括启动子、永生化基因、转录增强元件、基因串联间隔序列、ires调控序列和荧光蛋白标签序列。
105、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述启动子包括pef1a启动子或pcag启动子。
106、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述永生化基因包括：htert基因，sv40lt基因，或hpv e6/e7基因。可以单独采用这三种永生化基因，实现msc细胞的永生化，也可以采用htert和sv40lt，htert和hpv e6/e7，或sv40lt和hpv e6/e7的双永生化基因组合方案，以提高msc细胞永生化的效率。
107、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述永生化基因包括：htert基因和sv40lt基因。
108、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述转录增强元件包括：pucoe序列。
109、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述基因串联间隔序列包括gsg-t2a序列。
110、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述荧光蛋白标签序列包括绿色荧光蛋白egfp的编码序列。
111、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述永生化供体载体还包括：polya转录终止序列、基因敲入辅助序列和基因供体的切割引导序列。
112、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述poly a转录终止序列包括sv40的poly a转录终止序列。
113、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述永生化基因具有：
114、(43)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或
115、(44)、如(43)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(43)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
116、(45)、与(43)或(44)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
117、(46)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或
118、(47)、如(46)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(46)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
119、(48)、与(46)或(47)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
120、所述转录增强元件具有：
121、(49)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或
122、(50)、如(49)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(49)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
123、(51)、与(49)或(50)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
124、所述基因串联间隔序列具有：
125、(52)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或
126、(53)、如(52)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(52)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
127、(54)、与(52)或(53)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
128、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法所述基因敲入辅助序列具有：
129、(55)、如seq id no:5所示的核苷酸序列；或
130、(56)、如(55)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(55)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
131、(57)、与(55)或(56)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
132、所述切割引导序列具有：
133、(58)、如seq id no:6所示的核苷酸序列；或
134、(59)、如(58)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(58)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
135、(60)、与(58)或(59)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
136、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:1的序列为：
137、
138、
139、
140、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:2的序列为：
141、
142、
143、accggcatcgacagccagagccaaggcagctttcaggcccctcagtct
144、agccagagcgtccacgaccacaaccagccttaccacatctgccggggc
145、ttcacctgcttcaagaagcctccaacccctcctcccgagcctgagacatga。
146、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:3的序列为：
147、
148、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:4的序列为：
149、
150、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:5的序列为：
151、
152、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:6的序列为：gtcaccaatcctgtccctagtgg。
153、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法所述基因编辑载体包括：启动子、crispr/cas9、n57编码序列、linker短肽序列、核定位序列、抗性基因编码序列和sgrna序列。
154、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述启动子包括pcag启动子或强u6启动子。
155、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述n57编码序列包括密码子人源化的转座酶sb100x的pai结构域n57编码序列。
156、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述sgrna序列包括骨架结构序列和转录终止序列。
157、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述crispr/cas9包括spcas9，sacas9或cjcas9中的一种或多种。
158、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述基因编辑载体还包括安全港位点，上述安全港位点包括aavs1。
159、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法，所述n57编码序列具有：
160、(61)、如seq id no:7所示的核苷酸序列；或
161、(62)、如(61)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(61)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
162、(63)、与(61)或(62)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
163、所述sgrna序列具有：
164、(64)、如seq id no:8所示的核苷酸序列；或
165、(65)、如(64)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(64)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
166、(66)、与(64)或(65)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和
167、(67)、如seq id no:9所示的核苷酸序列；或
168、(68)、如(67)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(67)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
169、(69)、与(67)或(68)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
170、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:7的序列为：
171、
172、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:8的序列为：accccacagtggggccacta。
173、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:9的序列为：gtcaccaatcctgtccctag。
174、本发明还提供了永生化基因整合pcr鉴定的上游引物ki-f，其序列如seq id no:10所示；seq id no:10的序列为：cacgataataccatggtg agcaag。
175、本发明还提供了永生化基因整合pcr鉴定的下游引物ki-r，其序列如seq id no:11所示；seq id no:11的序列为：ccttcttgtaggcctgca tcatcac。
176、本发明还提供了产品，包括上述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体、上述基因编辑酶载体或上述制备方法获得外泌体。
177、本发明所述的各种分子生物学试剂，细胞培养试剂和仪器设备等均可以采用相同目的的不同类型产品，或同类型的不同品牌产品来达到相同的技术目的。所述的具体实验操作均为常规实验技术，因技术操作人员的偏好以及正常的实验扰动，在实际操作中出现一定程度的实验参数浮动属于正常现象。
178、本发明所述技术方案可以用于将各种来源的人msc细胞制备为高产外泌体的永生化msc基因工程细胞系，包括来源于脂肪、骨髓或脐带胎盘的人多能间充质干细胞。本发明所述技术方案同样可以用于所有类型的人原代培养细胞的高产外泌体永生化基因工程细胞系。
179、本发明所述技术方案中用于插入永生化基因的msc基因组的安全港位点包括但不限于aavs1,shs231,ccr5,hbb，或hrosa26等位点。
180、本发明所述的永生化基因为htert基因，sv40lt基因，或hpv e6/e7基因。可以单独采用这三种永生化基因，实现msc细胞的永生化，也可以采用htert和sv40lt，htert和hpve6/e7，或sv40lt和hpv e6/e7的双永生化基因组合方案，以提高msc细胞永生化的效率。
181、本发明所述的外泌体促进基因包括steap3(参与外泌体生物合成)、syndecan-4(sdc-4；支持内体膜形成多泡体的出芽)和细菌来源的l-天冬氨酸氧化酶片段(nadb；通过调节柠檬酸循环促进细胞代谢)，同时将这三种基因整合插入msc细胞基因组，可以显著提升外泌体的产量。删除或替换这三种基因中的1个或2个基因，也可能起到增强外泌体产量的效果，尽管效果可能有一定程度的差异。
182、本发明所述技术方案中采用在msc中具有高转录活性的启动子(例如pef1a或pcag启动子)，以及转录增强元件(例如pucoe序列)来增强永生化基因的稳定表达，换用其他类型或长度的启动子和转录增强元件可以达到同样的技术目标。
183、本发明所述的crispr/cas9基因编辑技术采用spcas9-n57编辑酶实现外源基因的靶向敲入。换用streptococcus pyogenes(s.pyogenes)来源的spcas9，或其在别的物种的同源体cas9(例如staphylococcus aureus来源的sacas9，campylobacterjejun来源的cjcas9等)，以及基于这些cas9基因的各种优化版本，均可能达到同样的技术目标，尽管实验效率可能存在一定程度的差别。
184、本发明描述了两种细胞转染方法将外源基因供体和crispr/cas9载体导入msc细胞，其他常规细胞转染技术也可能达到同样的技术目标，尽管实验效率可能存在一定程度的差别。
185、本发明采用有限稀释法制备单克隆msc细胞系，此技术步骤或可以省略，或通过两轮facs分选和富集荧光蛋白表达阳性的msc细胞，经过进一步的后续鉴定得到基因编辑的msc细胞系。
186、本发明的关键是通过crispr/cas9基因编辑技术将永生化基因和外泌体促进基因同时靶向整合插入msc基因组上不同的shs位点，从而制备高产外泌体的永生化msc基因工程细胞系。
187、(1)双永生化基因一次性整合于msc基因组：两种永生化编码基因之间通过p2a短肽(或t2a，ires等)序列串联连接，并由同一启动子pef1a(或pcag)来启动其内源转录，可以实现一次性将两种永生化基因同时整合于msc的基因组中。此设计不仅可以提高永生化的效率，同时较于分两次依次整合单永生化基因节约一半工作量和成本。
188、(2)三种外泌体促进基因一次性整合于msc基因组：三种促进基因之间通过p2a短肽和t2a短肽序列串联连接，并由同一启动子pef1a来启动其内源转录，可以实现一次性整合于msc的基因组中。此设计极大程度上提高了基因整合的效率，并节约工作量和成本。
189、(3)优化的基因供体设计：基因供体包括以下主要元件：在msc中具有高转录活性的启动子(例如pef1a或pcag启动子)，转录增强元件(例如pucoe序列)，串联的多顺反子外源基因，以及两种颜色的荧光蛋白标签序列。此设计保证了外源基因在msc细胞中可以稳定的内源高表达，荧光蛋白标签方便细胞系的克隆筛选和后期外源基因表达的检测。
190、(4)靶向基因组shs位点：永生化基因的整合位点确定和安全，不影响基因组其他位点正常基因的转录，不影响msc细胞的正常形状和功能。
191、(5)优化的crispr/cas9基因编辑技术：采用优化的spcas9-n57版本的基因工程编辑酶进行msc细胞的永生化基因编辑。该编辑酶采用人类密码子优化的spcas9基因，并在末端融合一种超活性转座酶sb100x的pai结构域n57的编码序列。可以强有力的催化靶向dna整合，靶向整合的效率比由常规cas9介导的整合更高，同时具有极高的全基因组特异性。spcas9-n57可以介导10kb以上长度的大dna片段的基因组定向整合。在载体上同时设计抗性基因(如嘌呤霉素)的编码序列，以方便转染细胞的初筛。
192、(6)高产外泌体的永生化msc基因工程细胞系：在永生化的msc细胞系的基础上，本发明将促进外泌体合成及分泌的多种增效基因通过基因编辑技术插入msc基因组的安全港位点，实现了这些外源增效基因在msc细胞中长期稳定的基因表达，最终得到可以显著提高外泌体产量(至少5倍以上)的msc基因工程细胞系。
193、通过在msc细胞基因组的shs位点特性性靶向整合插入外源基因，不会造成基因组其他位点正常基因的异常转录，可以避免基于常规病毒载体转导法制备永生化msc时，基因组插入位点不确定带来的不稳定性和潜在的细胞功能受干扰的风险。与常规方案比较，本发明制备的高产外泌体的永生化msc基因工程细胞系基因组均一性极高，细胞生物性能稳定，潜在副作用微弱可控。
194、通过优化设计的基因编辑技术，可以快速高效的将外源基因靶向插入msc的shs位点。crispr/cas9技术进行外源基因敲入编辑的效率远远大于常规病毒转染方法的外源基因随机整合于基因组的效率，因而本发明具有极高的实验成功率。
195、本发明提供了促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体，包括：启动子、转录增强元件和多顺反子基因；所述多顺反子基因包含steap3基因、t2a调控序列、sdc-4基因、p2a调控序列、hsnadb基因、ires调控序列和红色荧光蛋白标签编码序列。本发明还提供了基因编辑酶载体以及外泌体供体载体的应用，外泌体的制备方法和产品。
196、本发明的有益效果包括：
197、(1)本发明通过优化设计的基因编辑技术方案，可以高效快速制备永生化的msc细胞系。本发明的技术方案选择已经验证过的shs位点，通过crispr/cas9基因编辑技术导入永生化基因，进而实现对msc细胞的永生化基因编辑改造，不仅基因编辑效率高，而且对msc细胞的潜在风险微弱并可控。
198、(2)瞬时转染外泌体促进基因仅能在msc细胞中维持表达1～3天，难以应用于外泌体的大规模工程化生产中。本发明在msc永生化基因编辑的基础上，继续通过crispr/cas9技术将外泌体促进基因高效插入msc细胞的shs基因组位点，从而实现外泌体促进基因在msc细胞基因组上的稳定整合和细胞培养时的持续性高表达。
199、(3)永生化基因改造的msc不仅可以长期稳定的体外扩增培养，保持了原代msc细胞的所有功能特性，对细胞自身的各种生物学特性也没有影响。外泌体促进基因改造的msc，外泌体产量显著增加。
200、(4)本发明所制备的高产外泌体永生化msc细胞系能够无限的传代增殖，突破了原代msc细胞的培养代数局限，并保持着msc表面标志物的表达，同时具备多能干细胞的分化潜能，能够向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。
201、(5)在本发明制备的高产外泌体永生化msc细胞系，在外泌体载药产品工程化制备和临床药物研发中具有巨大的应用价值和商业化前景。
1.促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体，其特征在于，包括：启动子、转录增强元件和多顺反子基因；所述多顺反子基因包含steap3基因、t2a调控序列、sdc-4基因、p2a调控序列、hsnadb基因、ires调控序列和红色荧光蛋白标签编码序列。
2.如权利要求1所述的促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体，其特征在于：
3.如权利要求1或2所述的促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体，其特征在于，还包括：基因敲入辅助序列和切割识别序列；
4.如权利要求1至3任一项所述的促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体，其特征在于，其具有：
5.如权利要求1至4任一项所述的促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体在制备外泌体中的应用。
6.基因编辑酶载体，其特征在于，包括：启动子、n57编码序列、连接多肽、抗性基因编码序列、sgrna序列和crispr/cas9。
7.如权利要求6所述的基因编辑酶载体，其特征在于，所述sgrna序列具有：
8.如权利要求6或7所述的基因编辑酶载体在通过基因编辑制备外泌体中的应用。
9.外泌体的制备方法，其特征在于，包括：取如权利要求1至4任一项所述促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体和如权利要求6或7所述的基因编辑酶载体，转染或转化至永生化msc细胞，获得所述外泌体。
10.产品，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的促进外泌体合成增效的基因编辑供体载体、如权利要求6或7所述的基因编辑酶载体或如权利要求9所述制备方法获得外泌体。
