本发明涉及生物，具体涉及复合水凝胶的制备方法及应用。
背景技术：
1、骨缺损给人类的生理功能和心理健康造成巨大影响。2型糖尿病(t2dm，type 2diabetes mellitus)是一种以血糖升高为主要特点的全身代谢性疾病，会抑制骨组织再生，增加骨缺损的风险。目前，针对t2dm引起骨缺损面临的主要问题是：如何在血糖波动条件下，通过抗炎和促成骨实现骨代谢的精准调控。
2、受制于治疗惰性及饮食习惯，血糖波动是t2dm患者控糖治疗中的常见现象，但血糖波动对骨组织再生具有严重危害。血糖波动导致骨组织局部微血管收缩及损伤，影响血液供应及氧气运输，并导致线粒体能量代谢功能障碍，升高氧化应激水平，促进活性氧(reactive oxygen，ros)及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,mmps)产生，从而加重局部炎症反应，进而引起骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bmscs)和巨噬细胞(macrophage)等骨组织再生中关键细胞的功能障碍，导致骨愈合受损。
3、血糖波动是t2dm患者骨缺损修复治疗的重要挑战，目前的研究主要包括以下几个方面：①干细胞治疗：利用牙源性干细胞、骨源性干细胞或其他类型的干细胞移植来促进骨再生，这些细胞可以在体内成为骨组织的构成部分，促进骨的生长和修复，目前的研究表明，干细胞移植能够有效促进t2dm患者骨的再生，但干细胞治疗存在免疫抑制问题，且无法精确调控血糖波动，另外仍需进一步的临床研究来验证其安全性和有效性。②生物材料：应用生物材料来填充和修复受损的骨组织，这些生物材料可以提供支架结构，促进新骨的生长和修复，同时在生物材料上可以添加一些抗炎和控糖药物，一些研究表明，利用生物材料如水凝胶等，可以有效控制血糖波动，改善t2dm患者骨组织的再生能力，但在临床应用中仍存在一些挑战，如材料的生物相容性和稳定性等问题。③生长因子治疗：利用生长因子或基因治疗来促进t2dm骨组织的再生和修复，这些生长因子可以刺激干细胞的增殖和分化，促进骨细胞的生长和新骨的形成。④基因治疗，通过多组学筛选t2dm患者与正常患者差异表达的基因，引入特定的基因序列来改造动态血糖微环境，促进骨组织的再生，具有仿生和特异性的优势，但基因治疗相关的研究还处于实验室阶段，需要进一步的研究来验证其临床应用的可行性和安全性。
4、现有技术的缺点主要在于无法精确响应动态血糖变化，在研究过程中，需要综合考虑t2dm本身对骨组织的影响以及骨再生相关技术的可行性和安全性，仍需要进一步深入研究和临床实践来完善这一领域的治疗手段和策略
5、随着对干细胞治疗的不断深入研究，研究者们发现，干细胞对于骨组织的修复离不开其分泌的外泌体对于生长因子释放、信号传输的辅助作用。外泌体是一种由细胞分泌到胞外的膜性囊泡，其直径为30-150nm，携带母细胞的遗传物质、脂质与蛋白质，具有母细胞一定的生理功能。鉴于外泌体的纳米囊泡属性及其生理功能，相比于传统的“外来”纳米载体，干细胞外泌体可作为一种天然的新型纳米递送载体，并具备趋炎靶向性、低免疫原性、良好的稳定性和生物相容性，另外外泌体的纳米级尺寸以及双层膜结构，使其具备胶体材料的稳定性，不受损伤环境中的炎症以及自由基的影响，能够稳定发挥其抗炎修复作用，避免了干细胞移植治疗的寿命问题及运输保存等问题。然而，外切体的应用主要面临如下等问题：一方面外泌体的再生能力容易受到干细胞来源以及细胞状态的影响，通常需要对其进一步修饰，通过改造供体细胞来调节外泌体的功能及状态相对简单，不会对外泌体结构完整性产生不利影响，这有助于维持其功能；另一方面,由于复杂的病理环境，如高糖引起的微血管循环障碍，导致高mmps及自由基在损伤灶内的聚集，破坏外泌体膜蛋白的完整性及稳定性，因此需要良好的载体以实现外泌体的有效递送。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了复合水凝胶的制备方法及应用。
2、本发明提供了复合水凝胶的制备方法及应用。本发明实现精准的血糖响应：聚焦血糖波动在t2dm骨缺损修复再生中的负向作用，利用msc-exos的趋炎靶向性，同时利用tspba-pva葡萄糖响应式可逆降解特性，实现血糖波动环境下，抗炎和促成骨有效因子的精准释放。
3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
4、本发明提供了复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
5、步骤1：取smpd3过表达慢病毒转染后的细胞，离心，获得的exos-smpd3与明胶微球混合，获得所述exos-smpd3明胶微球；
6、步骤2：取tspba-pva溶液与纳米银离子溶液混合，获得所述tspba-pva纳米银离子外壳；
7、步骤3：取所述exos-smpd3明胶微球与所述tspba-pva纳米银离子外壳混合，获得所述复合水凝胶。
8、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述exos-smpd3的制备步骤为：取smpd3过表达慢病毒转染后的bmscs细胞，培养，收集所述bmscs细胞的上清液，离心，获得所述exos-smpd3。
9、在本发明的一些具体实施方案中，所述离心包括差速离心和超速离心；
10、所述差速离心包括：800×g，4℃，离心10min；取上清，2000×g，4℃，离心30min；取上清，10,000×g，4℃，离心45min；取上清，100,000×g，4℃，离心70min；弃上清，pbs重悬，100,000×g，4℃，离心70min；弃上清，pbs重悬，0.22μm过滤；
11、所述超速离心包括：2×105g，时间为1h，温度为4℃。
12、在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述纳米银离子溶液的制备步骤为：取硼氢化钠溶液与硝酸银溶液混合，获得所述纳米银离子溶液。
13、在本发明的一些具体实施方案中，所述硼氢化钠溶液的浓度为2×10-2mmol/l。
14、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述exos-smpd3与所述明胶微球的质量比为1：1；
15、步骤2中所述tspba-pva溶液与纳米银离子溶液的体积比为1：1；
16、步骤3中所述exos-smpd3明胶微球与所述tspba-pva纳米银离子外壳的质量体积比为1：1。
17、在本发明的一些具体实施方案中，所述exos-smpd3的制备步骤包括：
18、步骤1)：接种处于对数生长期的bmscs，当细胞融合率为50％时，加入培养基，培养至细胞贴壁；
19、步骤2)：取所述smpd3过表达慢病毒感染bmscs，培养；
20、步骤3)：步骤2)培养24h后，弃去含病毒的培养液，加入完全培养液，培养至第三代，收集细胞上清液，差速离心，再用超速离心，得到exos-smpd3。
21、在本发明的一些具体实施方案中，步骤2)中所述培养的温度为37℃、co2的浓度为5％。
22、在本发明的一些具体实施方案中，步骤2)中所述感染的bmscs的最佳融合度为70％。
23、在本发明的一些具体实施方案中，所述差速离心包括：800×g，4℃，离心10min；取上清，2000×g，4℃，离心30min；取上清，10,000×g，4℃，离心45min；取上清，100,000×g，4℃，离心70min；弃上清，pbs重悬，100,000×g，4℃，离心70min；弃上清，pbs重悬，0.22μm过滤；
24、所述超速离心包括：2×105g，时间为1h，温度为4℃。
25、本发明还提供了所述制备方法制得的复合水凝胶。
26、在上述研究的基础上，本发明还提供了所述复合水凝胶在制备如下任意项中的应用：
27、(1)、预防和/或治疗骨缺损的药物；和/或
28、(2)、靶向制剂。
29、在本发明的一些具体实施方案中，所述骨缺损包括2型糖尿病患者的骨缺损。
30、在本发明的一些具体实施方案中，所述预防和/或治疗骨缺损包括如下任意项：
31、(1)、调控巨噬细胞极化和/或炎症因子表达；和/或
32、(2)、调控巨噬细胞线粒体氧化应激的能力；和/或
33、(3)、调控成骨因子的表达；和/或
34、(4)、促进bmscs细胞的成骨向分化。
35、在本发明的一些具体实施方案中，所述促进bmscs细胞的成骨向分化包括自噬介导bmscs的成骨向分化。
36、在本发明的一些具体实施方案中，所述自噬介导bmscs的成骨向分化包括激活p38mapk和抑制mtor。
37、在本发明的一些具体实施方案中，所述bmscs细胞包括颌骨源的bmscs。
38、在本发明的一些具体实施方案中，所述调控噬细胞极化包括降低巨噬细胞促炎m1极化标志物的下降和/或提高巨噬细胞抗炎m2极化标志物表达；
39、所述调控炎症因子表达包括降低il-1β和/或tnf-α的表达；
40、所述调控巨噬细胞线粒体氧化应激的能力包括激活巨噬细胞的线粒体膜电位；
41、所述调控成骨因子的表达包括促进runx2、alp和/或ocn的表达。
42、在本发明的一些具体实施方案中，所述巨噬细胞促炎m1极化标志物包括inos和/或cd86；
43、所述巨噬细胞抗炎m2极化标志物包括cd206和/或arg。
44、本发明还提供了药物和/或靶向制剂，包括所述复合水凝胶。
45、本发明提供了复合水凝胶的制备方法及应用。本发明利用外泌体无免疫源性特征，通过编程化smpd3的msc-exos供受体偶联作用实现外泌体模块装载，完成纳米银离子的偶联，发挥smpd3促成骨的同时，充分保证了无免疫原性的仿生协调体系构建，并提高针对高糖环境的抗炎能力。
1.复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述exos-smpd3的制备步骤为：取smpd3过表达慢病毒转染后的bmscs细胞，培养，收集所述bmscs细胞的上清液，离心，获得所述exos-smpd3。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述纳米银离子溶液的制备步骤为：取硼氢化钠溶液与硝酸银溶液混合，获得所述纳米银离子溶液。
4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述exos-smpd3与所述明胶微球的质量比为1：1；
5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法制得的复合水凝胶。
6.如权利要求5所述的复合水凝胶在制备如下任意项中的应用：
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗骨缺损包括如下任意项：
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述调控噬细胞极化包括降低巨噬细胞促炎m1极化标志物的下降和/或提高巨噬细胞抗炎m2极化标志物表达；
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞促炎m1极化标志物包括inos和/或cd86；
10.药物和/或靶向制剂，其特征在于，包括如权利要求5所述的复合水凝胶。
