本发明涉及医药领域，更具体的，本发明涉及一种抗体romosozumab稳定制剂及其制备方法，以及该稳定制剂在用于治疗、预防或改善与硬化蛋白活性相关疾病的药物中的用途。
背景技术：
1、骨质疏松症(osteoporosis，op)包括绝经后妇女骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis，pmo)和老年性骨质疏松症，是一种以低骨量和骨微结构退化为特征，造成骨强度下降、骨脆性增加、易于发生骨折的全身性骨代谢障碍性疾病。据统计，全球约有2亿人骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。
2、硬骨素(sclerostin)作为新的生物靶点用于药物开发，其原理是可以通过调节成骨细胞合成代谢治疗骨质疏松，该靶点填补通过调控骨代谢方式治疗骨质疏松领域空白。
3、目前，amgen和ucb公司联合推出的抗硬骨素抗体romosozumab的临床报告显示其安全性和耐受性良好，受试体骨密度较空白组显著提高。lilly和novartis公司分别推出的两个单抗药。这些抗体的适用症均为骨质疏松/骨质疏松症以及骨损伤/相关骨病治疗等。
4、但是，抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定，并且，单克隆抗体广泛用作生物治疗剂，由于细胞外基质的存在，药物流动性受到限制，通常情况下皮下注射体积一般限定在1-2ml，抗体制剂浓度需达到90mg/ml以上才能满足临床用药剂量的要求，对其溶解性要求较高。
5、wo2019020069专利公开了romosozumab抗体药物组合物及其用途，组合物包括醋酸盐缓冲液、二糖、聚山梨醇酯80、钙盐等，该组合物可以提高抗体的稳定性，但是，对于抗体的溶解性并未涉及。
技术实现思路
1、本发明从解决现有技术的不足出发，提供了一种含有抗硬化蛋白抗体的稳定制剂，该制剂具有良好的溶解性以及长期稳定性。
2、本发明的上述目的通过如下技术方案实现：
3、一方面，本发明提供一种含有抗硬化蛋白抗体的稳定的制剂，其包含：
4、浓度为50-200mg/ml romosozumab抗体或其抗原片段；
5、浓度为10-200mmol/l的药学上可接受的助溶剂；及
6、浓度为0.01-1mg/ml的表面活性剂；其中，所述助溶剂选自羟基丙基-β-环糊精，所述表面活性剂为聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，所述聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80体积比为1：1-1：9，所述制剂的ph值为4.5-5.5。
7、作为本发明的优选技术方案，所述聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80体积比为1：1-1：6，在一个具体的实施方式中，所述聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80体积比为1：1-1：4，在一个具体的实施方式中，所述聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80体积比为1：4，在一个具体的实施方式中，所述聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80体积比为1：1.75。
8、在一些实施例中，所述romosozumab抗体或其抗原结合片段的浓度为50-120mg/ml。在一个具体的实施方式中，所述的抗硬化蛋白抗体或其抗原结合片段的浓度为90-100mg/ml。在一个具体的实施方式中，所述的抗硬化蛋白抗体或其抗原结合片段的浓度为90mg/ml。在一个具体的实施方式中，所述的抗硬化蛋白抗体或其抗原结合片段的浓度为95mg/ml。在一个具体的实施方式中，所述的抗硬化蛋白抗体或其抗原结合片段的浓度为100mg/ml。
9、作为本发明的优选技术方案，所述的羟基丙基-β-环糊精浓度为40-100mmol/l，优选为50-60mmol/l，更优选为60mmol/l；所述聚山梨醇酯20/聚山梨醇酯80的浓度为0.1-0.9mg/ml，优选为0.5-0.9mg/ml，更优选为0.6mg/ml。
10、作为本发明的优选技术方案，所述制剂还包括浓度为1-100mmol/l的缓冲剂；其中，所述缓冲剂选自醋酸-醋酸钠，所述醋酸-醋酸钠的浓度优选为10-50mmol/l，更优选为40mmol/l。
11、作为本发明的优选技术方案，所述制剂还包括：浓度为1-20mmol/l的氯化钙，优选浓度为5-15mmol/l，更优选浓度为15mmol/l。
12、作为本发明的优选技术方案，所述制剂还包括：
13、浓度为10-80mg/ml的赋形剂，所述赋形剂选自脯氨酸、蔗糖、氯化钠、山梨醇、甘露醇、或盐酸精氨酸中的任意一种或其组合，优选所述赋形剂为蔗糖，所述蔗糖浓度优选10-80mg/ml蔗糖，更优选为45mg/ml蔗糖。
14、作为本发明的优选技术方案，所述的稳定的液体制剂的ph值为4.5-5.5。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂的ph值为5.0-5.2。在一个具体的实施方式中，所述的稳定的液体制剂的ph值为5.0，5.2或5.5。
15、作为本发明的优选技术方案，所述制剂包含：
16、(1)浓度为90mg/ml-100mg/ml的romosozumab抗体或其抗原结合片段；
17、(2)浓度为40mmol/ml醋酸-醋酸钠和15mmol/ml氯化钙；
18、(3)浓度为0.5-0.9mmol/ml聚山梨醇酯20/聚山梨醇酯80和50-90mmol/ml的羟基丙基-β-环糊精；及
19、(4)浓度为45mg/ml-60mg/ml蔗糖；其中，所述制剂的ph值为4.5-5.2。
20、在一个更优选的实施方式中，本发明的稳定的液体制剂包含：
21、(1)浓度为95mg/ml或100mg/ml的romosozumab抗体或其抗原结合片段；
22、(2)浓度为40mmol/ml醋酸-醋酸钠和15mmol/ml氯化钙；
23、(3)浓度为0.6mg/ml聚山梨醇酯20/聚山梨醇酯80(体积比为1：1.75)和60mmol/ml的羟基丙基-β-环糊精；及
24、(4)浓度为45mg/ml蔗糖；其中，所述制剂的ph值为4.5-5.2。
25、第二方面，本发明提供了一种预填充注射器，所述预填充注射器中装载有上述的稳定的制剂，所述制剂是液体制剂，可以胃肠道外给药，优选皮下或肌肉注射。
26、第三方面，本发明提供了上述稳定的制剂在制备用于治疗、预防或改善任何与硬化蛋白相关的疾病或症状的药物中的用途，选自骨质疏松症或骨量减少症。
27、本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
28、提供了一种romosozumab抗体稳定制剂，具有低粘度、高溶解度以及长期稳定性的特性，不仅满足临床用药剂量的要求，而且满足在环境温度下使用注射器皮下递送所需的抗体粘度限度，尤其适合皮下注射或肌肉注射施用给药。
29、发明详述
30、本技术的以下描述只为说明本技术的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本技术范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本技术中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
31、定义
32、本发明中所使用的术语具有如下所列定义。如果在文中没有给出定义，则本发明中所使用的术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
33、本发明中所用的术语“约”，当用于列出的某一具体数值或数值范围时，意为该数值可在与所列具体数值±20％或±10％的变化，包括±5％、±1％和±0.1％，这些变化适于进行所公开的方法。
34、为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
35、对某种疾病或症状的“治疗”是指减轻某种疾病或症状，降低某种疾病或症状兴起或发展的速度，减少发展出某种疾病或症状的风险，或延迟与某种疾病或症状相关的症状发展，减少或终止与某种疾病或症状相关的症状，产生某种疾病或症状的完全或部分的逆转，治愈某种疾病或症状，或以上的组合。
36、“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有家族病史的受试者是预防性方案的候选者。通常，术语“预防”是指在病征或症状发生前，特别是在具有风险的受试者中发生前的药物施用。
37、“与抗硬化蛋白相关疾病或症状”是指通过硬化蛋白的变化引起或表征的疾病或症状，如软骨发育不全、锁骨颅骨发育不全、内生软骨瘤、纤维发育不良、戈谢病、低血磷性佝偻病、马凡氏综合征、遗传性多发性外生性骨疣病、神经纤维瘤、成骨不全病、骨硬化病、脆弱性骨硬化、硬化损害、假关节病、化脓性骨髓炎、牙周病、抗癫痫药引起的骨丢失、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进、家族性甲状旁腺功能亢进综合征、失重诱导的骨丢失、男性骨质疏松、绝经后骨丢失、骨关节炎、肾性骨病、渗透性骨病、口腔骨丢失、下颌骨坏死、青少年佩奇病、肢骨纹状肥大、代谢骨病、肥大细胞增生病、镰刀细胞贫血/病、与器官移植相关的骨丢失、与肾脏移植相关的骨丢失、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、癫痫、青少年型关节炎、地中海贫血、粘多糖贮积病、法布里病、特纳综合征、唐氏综合征、克莱里菲尔特综合征、麻风病、perthe氏病、青少年特发性脊柱侧弯、婴儿发作性多系统炎性病、温彻斯特综合征、门克斯病、威尔森氏病、缺血性骨病(例如累-卡-佩三氏病或区域性迁移性骨质疏松)、贫血状态、由类固醇引起的病况、糖皮质激素诱导的骨丢失、肝素诱导的骨丢失、骨髓病症、坏血病、营养不良、钙缺乏、骨质疏松症、骨量减少症、酒精中毒、慢性肝病、绝经后状态、慢性炎性病况、类风湿性关节炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、炎症性结肠炎、克罗恩病、月经稀发、无月经、怀孕、糖尿病、甲状腺机能亢进、甲状腺病症、副甲状腺病症、库兴氏病、肢端肥大症、性腺机能减退、废用或停用、反射性交感神经萎缩综合征、区域性骨质疏松症、骨软化、与关节置换相关的骨丢失、与hiv相关的骨丢失、与生长激素缺失相关的骨丢失、与囊肿性纤维化相关的骨丢失、与化学治疗相关的骨丢失、肿瘤诱导的骨丢失、与癌症相关的骨丢失、激素剥夺性骨丢失(hormone ablative bone loss)、多发性骨髓瘤、药物诱导的骨丢失、神经性厌食症、与疾病相关的面部骨丢失、与疾病相关的颅骨丢失、与疾病相关的下颌骨丢失、与疾病相关的头盖骨丢失、与衰老相关的骨丢失、与衰老相关的面部骨丢失、与衰老相关的颅骨丢失、与衰老相关的下颌骨丢失、与衰老相关的头盖骨丢失或与太空旅行相关的骨丢失。鉴定/诊断上述疾病或症状的方法在本领域是已知的。
38、术语“受试者”包括任何人类或非人类的动物。“非人类的动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物(包括但不限于家养动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(如猴)、兔、以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))和非哺乳动物(如家禽、两栖动物和爬行动物)。在一些实施方案中，受试者是人。
39、术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现预防或改善与疾病或病症有关的症状和/或减轻疾病或病症严重程度的剂量或浓度。本发明的制剂、抗体或其抗原结合片段或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也可被认为是制剂、抗体或其抗原结合片段或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。
40、术语“制剂”是指适合于向动物优选哺乳动物(包括人)施用的包含至少一种活性成分和至少一种非活性成分的组合物。“液体制剂”是指液体形式的制剂。本发明的制剂的组成可如前文所述的液体制剂实施方案中所示。本发明的液体制剂优选为注射剂，更优选为皮下注射剂或肌肉注射剂，最优选的是皮下注射剂。
41、术语“缓冲剂”是指ph缓冲剂。优选地，所述缓冲剂能够使本发明的液体制剂的ph保持在约4.5-5.5，优选约4.5-5.2，更优选5.0-5.2。缓冲剂在液体制剂中的浓度为约10-50mmol/l，优选的浓度是20-40mmol/l，更优选的浓度是40mmol/l。所述的缓冲剂选自醋酸-醋酸钠。
42、术语“赋形剂”是指可以向制剂添加以提供所需特性(例如稠度、提高的稳定性)和/或调节渗透压的非治疗试剂，所述的非治疗试剂添加到制剂中能够稳定活性成分的理化和生物特性。常用赋形剂的实例包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。优选赋形剂为蔗糖。
43、术语“渗透压调节剂”是一种促成溶液的克分子渗透压浓度的分子。本发明的“渗透压调节剂”是指能够调整、改变或优化所述本发明的抗硬化蛋白抗体液体制剂的渗透度，优选地，本发明所述的液体制剂的克分子渗透压浓度被调节，不仅维持液体制剂的等渗性，而且可以最大限度地提高本发明抗硬化蛋白抗体或其抗原结合片段的稳定性，同时也将给药时患者的不适度降低至最低。适用于改变克分子渗透压浓度的渗透压调节剂的实施例包括但不限于，氨基酸(脯氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸等)、盐类(氯化钠、氯化钾、氯化钙等)和/或糖类(蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇及其类似物)，优选的渗透压调节剂是氯化钙。
44、术语“表面活性剂”是指加入少量后能使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质。例如，能保护蛋白质(例如抗体)免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力影响，从而减少蛋白质的聚集或制剂中颗粒物的形成。示例性的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯40或聚山梨醇酯20)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，pluronic)、十二烷基硫酸钠(sds)。本发明优选的表面活性剂是非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20。优选表面活性剂为聚山梨醇酯80(ps80)和聚山梨醇酯20(ps20)，表面活性剂在液体制剂中的浓度0.01-1(mg/ml)，优选0.01-0.9(mg/ml)，优选0.1-0.9(mg/ml)，更优选0.1(mg/ml)或0.6(mg/ml)。
45、术语“粘度”可以是“运动粘度”或“绝对粘度”。“运动粘度”是对流体在重力影响下所产生的抵抗性流动的一种测量指标。当两种相同体积的流体被分别置入两个相同的毛细管粘度计并靠重力流动时，粘性流体流过毛细管所需的时间比粘度较低的流体所需的时间为长。“绝对粘度”，有时称为动态粘度或简单粘度，是运动粘度与流体密度的乘积(绝对粘度＝运动粘度×密度)。运动粘度的量纲是l2/t(其中，l是长度，t是时间)。通常，运动粘度以厘沲(cst)表示。运动粘度的国际单位制单位是mm2/s(即lcst)。绝对粘度以厘泊(cp)单位表示。绝对粘度的国际单位制单位是毫帕斯卡-秒(mpa-s)，其中1cp＝lmpa-s。
46、术语“低水平粘度”是指低于约15cp的绝对粘度。“中等水平粘度”是指介于约15cp和约35cp之间的绝对粘度。本发明使用标准粘度测量技术测量时，本发明的抗体液体制剂的绝对粘度为约3.8cp、4.2cp、6.0cp、约8.0cp、约9.0cp、约10.0cp、约11.0cp、或约12.0cp，表明本发明的液体制剂具有“低水平粘度”。在一些实施方式中，本技术的发明人惊奇地发现，脯氨酸不仅可以作为渗透压调节剂，而且与抗硬化蛋白抗体和缓冲剂一起配制时还可以减少本发明的抗体液体制剂的粘度。
47、术语“等渗”是指液体制剂具有与人血液基本相同的渗透压。等渗制剂一般具有约250～300mosm的渗透压。可使用蒸汽压或冰点下降式的渗透压计测量等渗性。
48、术语“溶媒”是指用于混合、分散、溶解受试物或对照物而不影响试验结果的物质。可用于本发明的溶媒包括但不限于注射用水、盐类(如生理盐水)、糖类(如葡萄糖注射液)、注射用有机溶剂(包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等)，或其组合。
49、“稳定的”抗体制剂是指抗体在生产制造过程中和/或储存期间基本保持其物理化学稳定性和/或生物学活性的制剂。即使所含的抗体在经过一定时间储存之后未能保持其100％的物理化学特性或生物功能，抗体制剂也可以被认为是稳定的。例如，经过一定时间储存后，该制剂能维持90％以上的抗体结构或功能，也可以视为是“稳定的”制剂。稳定性的标准例如，液体制剂肉眼观察无色、或澄清至轻度乳白色；制剂的抗体浓度、ph值和渗透压变化不超过±10％；抗体生物学活性为参照抗体的80～140％，优选90～120％；制剂的抗体单体降解不超过10％，优选5％，更优选为3％；制剂中形成的聚集物不超过10％，优选5％，更优选为3％。
50、如果肉眼观察制剂的颜色和/或澄清度，或经差示扫描量热法(dsc)、尺寸排阻色谱法(sec-hplc)和动态光散射(dls)检测，制剂中抗体的聚集、沉淀和/或变性无显著增加，表明所述制剂中的抗体“保持了其物理稳定性”。如果所述制剂中的抗体没有发生显著的化学变化，其化学结构保持了完整性，则表明所述抗体“保持了其化学稳定性”。大部分化学稳定性的破坏可归因于蛋白的共价修饰(例如，共价聚集物、降解物或电荷异构体)和蛋白的非共价修饰(例如，非共价聚集物)的形成。可以使用本领域技术人员已知的方法来测定抗体蛋白化学结构发生的变化(例如不同分子量或电荷的变体)。所述方法包括但不限于，使用sec-hplc和十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳(ce-sds)等方法来检测抗体的水解物，使用非还原性caliper检测抗体的降解片段以及分子量小于抗体的其它蛋白分子，或使用阳离子交换色谱法(ce-hplc)检测抗体的电荷异构体。如果在储存期间内，制剂中抗体的生物学活性仍在该制剂制备时显示的生物学活性范围内，表明该抗体“保持了其生物学活性”。抗体生物学活性的检测方法包括但不限于抗原结合elisa实验或抗体的细胞活性实验。
51、“药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与受试者相兼容。
1.一种稳定的制剂，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80体积比为1：1-1：6，优选为1：1-1：4，更优选为1：1.75。
3.根据权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述romosozumab抗体浓度优选为50-120mg/ml，更优选为90-100mg/ml，更优选为100mg/ml；所述的羟基丙基-β-环糊精浓度为40-100mmol/l，优选为50-60mmol/l，更优选为60mmol/l；所述聚山梨醇酯20/聚山梨醇酯80的浓度为0.1-0.9mg/ml，优选为0.5-0.9mg/ml，更优选为0.6mg/ml。
4.根据权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述制剂还包括：
5.根据权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述制剂还包括：浓度为1-20mmol/l的氯化钙，优选浓度为5-15mmol/l，更优选浓度为15mmol/l。
6.根据权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述制剂还包括：
7.根据权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述制剂的ph值为5.0-5.2，更优选ph值为5.0、5.2或5.5。
8.根据权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述制剂包含：
9.一种预填充注射器，其特征在于，所述的预填充注射器中装载有如权利要求1-8中任一项的稳定的制剂，所述制剂是液体制剂，可以胃肠道外给药，优选皮下或肌肉注射。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的稳定的制剂在制备用于治疗、预防或改善任何与硬化蛋白相关的疾病或症状的药物中的用途，选自骨质疏松症或骨量减少症。
