本发明属于法医学，具体涉及一种基于mtdna snp位点的复合扩增试剂盒及其在母系亲缘鉴定中的应用。
背景技术：
1、线粒体是位于细胞质中的一个含有双层膜的细胞器，具有自己的遗传系统。线粒体dna(mitochondrial dna，mtdna)是细胞核外dna，是人类基因组的重要组成部分。目前，修订的剑桥参考序列(revised cambridge reference sequence，rcrs)是国际上公认的标准，其genbank登录号为nc_012920.1。mtdna共有16569个碱基对，分为编码区和非编码区。其中，编码区较为保守，共37个基因编码多种rna和蛋白质。非编码区也叫控制区或d环区(d-loop)，与编码区相比，控制区存在较大差异，且主要集中在两个高变区(high variableregions,hvr)ⅰ和ⅱ。
2、mtdna的研究始于限制性片段长度多态性(rflp)。20世纪90年代开始了控制区序列测序分析，对控制区的测序一般集中hvrⅰ和hvrⅱ。进入21世纪以后，随着测序技术的发展和应用，许多研究小组相继发表了世界各地人群mtdna全序列的研究报告。phylotree数据库(www.phylotree.org)中已公布了24275条全序列数据，并在此基础上构建了最新最全的系统进化树，定义线粒体单倍型(haplotype)，为人类进化、遗传学及法医学等提供了基础框架。
3、由于mtdna表现出与核dna遗传系统不完全相同的特点：呈环状结构、母系遗传、多拷贝数、高突变率、不易发生重组等，mtdna对法医学、群体遗传学、人类生态学、分子进化和考古学有重要的意义。ivanov等人从俄国ekaterinburg附近发现的疑为沙皇nicholas二世及其家人的骸骨中提取了mtdna并测序，同时对romanov家族的母系后代的血液样本及nicholas二世兄弟的骸骨进行mtdna测序，最终证实骸骨属于沙皇nicholas二世及其家庭成员。
4、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snp)是指dna序列中单个碱基发生变化而引起的dna序列多态性。线粒体上的snp(mt-snp)复合pcr扩增体系在疑难检材检验中具有良好的应用效果。stephan等在6起案件中，用常规str检测的方法以及mtdna的hvⅰ区测序的方法都没有得到有效的结果，用包含32个mtdna-snp位点的体系来检测，得到了理想的结果，这6起案件涉及的检材时间从2个月到1400年不等，检材类型包括唾液、血液、精液、头发、骨头、牙齿以及混合斑。
技术实现思路
1、本发明的目的为制备mtdna snp位点分型的试剂盒。
2、本发明首先保护引物组合，可由引物组合1、引物组合2、引物组合3和引物组合4组成。
3、所述引物组合1可由引物5417f、引物5417a、引物5417g、引物7196c、引物7196a、引物7196r、引物709g、引物709a、引物709r、引物3010f、引物3010a、引物3010g、引物16129g、引物16129a、引物16129r、引物235f、引物235a、引物235g、引物10397a、引物10397g、引物10397r、引物8794f、引物8794t、引物8794c、引物9545f、引物9545g、引物9545a、引物3970f、引物3970t、引物3970c、引物15043a、引物15043g、引物15043r、引物16362t、引物16362c、引物16362r、引物11215t、引物11215c、引物11215r、引物12705t、引物12705c、引物12705r、引物13590a、引物13590g、引物13590r、引物8414f、引物8414c、引物8414t、引物4883f、引物4883c、引物4883t、引物14668f、引物14668c和引物14668t组成。引物5417f、引物5417a、引物5417g、引物7196c、引物7196a、引物7196r、引物709g、引物709a、引物709r、引物3010f、引物3010a、引物3010g、引物16129g、引物16129a、引物16129r、引物235f、引物235a、引物235g、引物10397a、引物10397g、引物10397r、引物8794f、引物8794t、引物8794c、引物9545f、引物9545g、引物9545a、引物3970f、引物3970t、引物3970c、引物15043a、引物15043g、引物15043r、引物16362t、引物16362c、引物16362r、引物11215t、引物11215c、引物11215r、引物12705t、引物12705c、引物12705r、引物13590a、引物13590g、引物13590r、引物8414f、引物8414c、引物8414t、引物4883f、引物4883c、引物4883t、引物14668f、引物14668c和引物14668t的核苷酸序列依次可如seq id no:1至seq id no:54所示。
4、所述引物组合2可由引物6962f、引物6962a、引物6962g、引物8020f、引物8020a、引物8020g、引物8701f、引物8701g、引物8701a、引物249f、引物249r、引物ca-f、引物ca-r、引物4491f、引物4491a、引物4491g、引物11969-f、引物11969g、引物11969a、引物10398a、引物10398g、引物10398-r、引物16519f、引物16519t、引物16519c、引物10310g、引物10310a、引物10310-r、引物12811f、引物12811c、引物12811t、引物1736a、引物1736g、引物1736r、引物9824t、引物9824c、引物9824a、引物9824r、引物16319f、引物16319g和引物16319a组成。引物6962f、引物6962a、引物6962g、引物8020f、引物8020a、引物8020g、引物8701f、引物8701g、引物8701a、引物249f、引物249r、引物ca-f、引物ca-r、引物4491f、引物4491a、引物4491g、引物11969-f、引物11969g、引物11969a、引物10398a、引物10398g、引物10398-r、引物16519f、引物16519t、引物16519c、引物10310g、引物10310a、引物10310-r、引物12811f、引物12811c、引物12811t、引物1736a、引物1736g、引物1736r、引物9824t、引物9824c、引物9824a、引物9824r、引物16319f、引物16319g和引物16319a的核苷酸序列依次可如seq idno:55至seq id no:95所示。
5、所述引物组合3可由引物4715f、引物4715a、引物4715g、引物5460g、引物5460a、引物5460r、引物4071c、引物4071t、引物4071-r、引物15535t、引物15535c、引物15535r、引物13104f、引物13104g、引物13104a、引物146t、引物146c、引物146r、引物1107t、引物1107c、引物1107r、引物12405f、引物12405c、引物12405t、引物10873t、引物10873c、引物10873r、引物14470f、引物14470c、引物14470t、引物14569g、引物14569a、引物14569r、引物4833f、引物4833a、引物4833g、引物16217t、引物16217c、引物16217r、引物8584f、引物8584g、引物8584a、引物16093f、引物16093t、引物16093c、引物10400c、引物10400t和引物10400r组成。引物4715f、引物4715a、引物4715g、引物5460g、引物5460a、引物5460r、引物4071c、引物4071t、引物4071-r、引物15535t、引物15535c、引物15535r、引物13104f、引物13104g、引物13104a、引物146t、引物146c、引物146r、引物1107t、引物1107c、引物1107r、引物12405f、引物12405c、引物12405t、引物10873t、引物10873c、引物10873r、引物14470f、引物14470c、引物14470t、引物14569g、引物14569a、引物14569r、引物4833f、引物4833a、引物4833g、引物16217t、引物16217c、引物16217r、引物8584f、引物8584g、引物8584a、引物16093f、引物16093t、引物16093c、引物10400c、引物10400t和引物10400r的核苷酸序列依次可如seq idno:96至seq idno:143所示。
6、所述引物组合4可由引物14476g、引物14476a、引物14476r、引物152f、引物152c、引物152t、引物5442c、引物5442t、引物5442r、引物11914a、引物11914g、引物11914r、引物7600f、引物7600g、引物7600a、引物16223f、引物16223c、引物16223t、引物5178c、引物5178a、引物5178r、引物13928f、引物13928c、引物13928g、引物9123g、引物9123a、引物9123r、引物16298t、引物16298c、引物16298r、引物1719g、引物1719a、引物1719r、引物9bp-f和引物9bp-r组成。引物14476g、引物14476a、引物14476r、引物152f、引物152c、引物152t、引物5442c、引物5442t、引物5442r、引物11914a、引物11914g、引物11914r、引物7600f、引物7600g、引物7600a、引物16223f、引物16223c、引物16223t、引物5178c、引物5178a、引物5178r、引物13928f、引物13928c、引物13928g、引物9123g、引物9123a、引物9123r、引物16298t、引物16298c、引物16298r、引物1719g、引物1719a、引物1719r、引物9bp-f和引物9bp-r的核苷酸序列依次可如seq id no:144至seq id no:178所示。
7、所述引物组合1可由54条引物混合而成。
8、所述引物组合2可由41条引物混合而成。
9、所述引物组合3可由48条引物混合而成。
10、所述引物组合4可由35条引物混合而成。
11、上述任一所述引物组合1中，引物5417f、引物5417a、引物5417g、引物7196c、引物7196a、引物7196r、引物709g、引物709a、引物709r、引物3010f、引物3010a、引物3010g、引物16129g、引物16129a、引物16129r、引物235f、引物235a、引物235g、引物10397a、引物10397g、引物10397r、引物8794f、引物8794t、引物8794c、引物9545f、引物9545g、引物9545a、引物3970f、引物3970t、引物3970c、引物15043a、引物15043g、引物15043r、引物16362t、引物16362c、引物16362r、引物11215t、引物11215c、引物11215r、引物12705t、引物12705c、引物12705r、引物13590a、引物13590g、引物13590r、引物8414f、引物8414c、引物8414t、引物4883f、引物4883c、引物4883t、引物14668f、引物14668c和引物14668t的摩尔比可为0.04：0.04：0.04：0.30：0.30：0.30：0.30：0.30：0.30：0.27：0.27：0.27：0.13：0.13：0.13：0.50：0.50：0.50：0.07：0.07：0.07：0.33：0.33：0.33：0.27：0.27：0.27：0.10：0.10：0.10：0.27：0.27：0.27：0.20：0.20：0.20：0.07：0.07：0.07：0.67：0.67：0.67：0.50：0.50：0.50：0.17：0.17：0.17：0.17：0.17：0.17：0.67：0.67：0.67。
12、上述任一所述引物组合2中，引物6962f、引物6962a、引物6962g、引物8020f、引物8020a、引物8020g、引物8701f、引物8701g、引物8701a、引物249f、引物249r、引物ca-f、引物ca-r、引物4491f、引物4491a、引物4491g、引物11969-f、引物11969g、引物11969a、引物10398a、引物10398g、引物10398-r、引物16519f、引物16519t、引物16519c、引物10310g、引物10310a、引物10310-r、引物12811f、引物12811c、引物12811t、引物1736a、引物1736g、引物1736r、引物9824t、引物9824c、引物9824a、引物9824r、引物16319f、引物16319g和引物16319a的摩尔比可为0.13：0.13：0.13：0.33：0.33：0.33：0.15：0.08：0.15：0.05：0.05：0.05：0.05：0.05：0.05：0.05：0.67：0.67：0.67：0.45：0.75：0.75：0.40：0.40：0.40：0.30：0.30：0.30：0.13：0.13：0.13：0.45：0.80：0.80：0.40：0.40：0.40：0.40：0.50：0.50：0.50。
13、上述任一所述引物组合3中，引物4715f、引物4715a、引物4715g、引物5460g、引物5460a、引物5460r、引物4071c、引物4071t、引物4071-r、引物15535t、引物15535c、引物15535r、引物13104f、引物13104g、引物13104a、引物146t、引物146c、引物146r、引物1107t、引物1107c、引物1107r、引物12405f、引物12405c、引物12405t、引物10873t、引物10873c、引物10873r、引物14470f、引物14470c、引物14470t、引物14569g、引物14569a、引物14569r、引物4833f、引物4833a、引物4833g、引物16217t、引物16217c、引物16217r、引物8584f、引物8584g、引物8584a、引物16093f、引物16093t、引物16093c、引物10400c、引物10400t和引物10400r的摩尔比可为0.07：0.07：0.07：0.50：0.50：0.50：0.67：0.67：0.67：0.33：0.33：0.33：0.07：0.07：0.07：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.30：0.30：0.30：0.40：0.40：0.40：1.00：1.00：1.00：1.00：1.00：1.00：1.00：1.00：1.00：0.33：0.33：0.33：0.23：0.23：0.23：0.40：0.40：0.40：0.36：0.36：0.36。
14、上述任一所述引物组合4中，引物14476g、引物14476a、引物14476r、引物152f、引物152c、引物152t、引物5442c、引物5442t、引物5442r、引物11914a、引物11914g、引物11914r、引物7600f、引物7600g、引物7600a、引物16223f、引物16223c、引物16223t、引物5178c、引物5178a、引物5178r、引物13928f、引物13928c、引物13928g、引物9123g、引物9123a、引物9123r、引物16298t、引物16298c、引物16298r、引物1719g、引物1719a、引物1719r、引物9bp-f和引物9bp-r的摩尔比可为0.67：0.67：0.67：0.30：0.30：0.30：0.40：0.40：0.40：1.67：1.67：1.67：1.33：1.33：1.33：1.67：1.67：1.67：0.50：0.50：0.50：0.67：0.67：0.67：1.00：1.00：1.00：1.67：1.67：1.67：4.00：4.00：4.00：0.80：0.80。
15、上述任一所述引物组合1中，引物5417f、引物7196r、引物709r、引物3010f、引物16129r、引物235f、引物10397r、引物8794f、引物9545f、引物3970f、引物15043r、引物16362r、引物11215r、引物12705r、引物13590r、引物8414f、引物4883f和引物14668f用荧光标记甲标记。
16、上述任一所述引物组合2中，引物6962f、引物8020f、引物8701f、引物249f、引物ca-f、引物4491f、引物11969-f、引物10398-r、引物16519f、引物10310-r、引物12811f、引物1736r、引物9824r、引物16319f用荧光标记乙标记。
17、上述任一所述引物组合3中，引物4715f、引物5460r、引物4071-r、引物15535r、引物13104f、引物146r、引物1107r、引物12405f、引物10873r、引物14470f、引物14569r、引物4833f、引物16217r、引物8584f、引物16093f和引物10400r用荧光标记丙标记。
18、上述任一所述引物组合4中，引物14476r、引物152f、引物5442r、引物11914r、引物7600f、引物16223f、引物5178r、引物13928f、引物9123r、引物16298r、引物1719r和引物9bp-f用荧光标记丁标记。
19、所述荧光标记甲具体可为fam标记。
20、所述荧光标记乙具体可为hex标记。
21、所述荧光标记丙具体可为tamra标记。
22、所述荧光标记丁具体可为rox标记。
23、上述任一所述的引物组合1可用于扩增个18mtdna snp位点。
24、上述任一所述的引物组合2可用于扩增个14mtdna snp位点。
25、上述任一所述的引物组合3可用于扩增个16mtdna snp位点。
26、上述任一所述的引物组合4可用于扩增个12mtdna snp位点。
27、所述引物组合用于扩增60个mtdna snp位点。
28、本发明还保护一种基于上述60个mtdna snp位点的复合扩增体系，由复合扩增体系1、复合扩增体系2、复合扩增体系3和复合扩增体系4组成；
29、所述复合扩增体系1包括上述任一所述引物组合1；
30、所述复合扩增体系2包括上述任一所述引物组合2；
31、所述复合扩增体系3包括上述任一所述引物组合3；
32、所述复合扩增体系4包括上述任一所述引物组合4。
33、所述复合扩增体系1具体可由上述任一所述引物组合1组成。
34、所述复合扩增体系2具体可由上述任一所述引物组合2组成。
35、所述复合扩增体系3具体可由上述任一所述引物组合3组成。
36、所述复合扩增体系4具体可由上述任一所述引物组合4组成。
37、引物5417f、引物5417a、引物5417g、引物7196c、引物7196a、引物7196r、引物709g、引物709a、引物709r、引物3010f、引物3010a、引物3010g、引物16129g、引物16129a、引物16129r、引物235f、引物235a、引物235g、引物10397a、引物10397g、引物10397r、引物8794f、引物8794t、引物8794c、引物9545f、引物9545g、引物9545a、引物3970f、引物3970t、引物3970c、引物15043a、引物15043g、引物15043r、引物16362t、引物16362c、引物16362r、引物11215t、引物11215c、引物11215r、引物12705t、引物12705c、引物12705r、引物13590a、引物13590g、引物13590r、引物8414f、引物8414c、引物8414t、引物4883f、引物4883c、引物4883t、引物14668f、引物14668c和引物14668t在复合扩增体系1中的浓度依次可为0.04μm、0.04μm、0.04μm、0.30μm、0.30μm、0.30μm、0.30μm、0.30μm、0.30μm、0.27μm、0.27μm、0.27μm、0.13μm、0.13μm、0.13μm、0.50μm、0.50μm、0.50μm、0.07μm、0.07μm、0.07μm、0.33μm、0.33μm、0.33μm、0.27μm、0.27μm、0.27μm、0.10μm、0.10μm、0.10μm、0.27μm、0.27μm、0.27μm、0.20μm、0.20μm、0.20μm、0.07μm、0.07μm、0.07μm、0.67μm、0.67μm、0.67μm、0.50μm、0.50μm、0.50μm、0.17μm、0.17μm、0.17μm、0.17μm、0.17μm、0.17μm、0.67μm、0.67μm、0.67μm。
38、所述引物组合2中，引物6962f、引物6962a、引物6962g、引物8020f、引物8020a、引物8020g、引物8701f、引物8701g、引物8701a、引物249f、引物249r、引物ca-f、引物ca-r、引物4491f、引物4491a、引物4491g、引物11969-f、引物11969g、引物11969a、引物10398a、引物10398g、引物10398-r、引物16519f、引物16519t、引物16519c、引物10310g、引物10310a、引物10310-r、引物12811f、引物12811c、引物12811t、引物1736a、引物1736g、引物1736r、引物9824t、引物9824c、引物9824a、引物9824r、引物16319f、引物16319g和引物16319a在复合扩增体系2中的浓度依次可为0.13μm、0.13μm、0.13μm、0.33μm、0.33μm、0.33μm、0.15μm、0.08μm、0.15μm、0.05μm、0.05μm、0.05μm、0.05μm、0.05μm、0.05μm、0.05μm、0.67μm、0.67μm、0.67μm、0.45μm、0.75μm、0.75μm、0.40μm、0.40μm、0.40μm、0.30μm、0.30μm、0.30μm、0.13μm、0.13μm、0.13μm、0.45μm、0.80μm、0.80μm、0.40μm、0.40μm、0.40μm、0.40μm、0.50μm、0.50μm、0.50μm。
39、所述引物组合3中，引物4715f、引物4715a、引物4715g、引物5460g、引物5460a、引物5460r、引物4071c、引物4071t、引物4071-r、引物15535t、引物15535c、引物15535r、引物13104f、引物13104g、引物13104a、引物146t、引物146c、引物146r、引物1107t、引物1107c、引物1107r、引物12405f、引物12405c、引物12405t、引物10873t、引物10873c、引物10873r、引物14470f、引物14470c、引物14470t、引物14569g、引物14569a、引物14569r、引物4833f、引物4833a、引物4833g、引物16217t、引物16217c、引物16217r、引物8584f、引物8584g、引物8584a、引物16093f、引物16093t、引物16093c、引物10400c、引物10400t和引物10400r在复合扩增体系3中的浓度依次可为0.07μm、0.07μm、0.07μm、0.50μm、0.50μm、0.50μm、0.67μm、0.67μm、0.67μm、0.33μm、0.33μm、0.33μm、0.07μm、0.07μm、0.07μm、0.08μm、0.08μm、0.08μm、0.08μm、0.08μm、0.08μm、0.30μm、0.30μm、0.30μm、0.40μm、0.40μm、0.40μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、0.33μm、0.33μm、0.33μm、0.23μm、0.23μm、0.23μm、0.40μm、0.40μm、0.40μm、0.36μm、0.36μm、0.36μm。
40、所述引物组合4中，引物14476g、引物14476a、引物14476r、引物152f、引物152c、引物152t、引物5442c、引物5442t、引物5442r、引物11914a、引物11914g、引物11914r、引物7600f、引物7600g、引物7600a、引物16223f、引物16223c、引物16223t、引物5178c、引物5178a、引物5178r、引物13928f、引物13928c、引物13928g、引物9123g、引物9123a、引物9123r、引物16298t、引物16298c、引物16298r、引物1719g、引物1719a、引物1719r、引物9bp-f和引物9bp-r在复合扩增体系4中的浓度依次可为0.67μm、0.67μm、0.67μm、0.30μm、0.30μm、0.30μm、0.40μm、0.40μm、0.40μm、1.67μm、1.67μm、1.67μm、1.33μm、1.33μm、1.33μm、1.67μm、1.67μm、1.67μm、0.50μm、0.50μm、0.50μm、0.67μm、0.67μm、0.67μm、1.00μm、1.00μm、1.00μm、1.67μm、1.67μm、1.67μm、4.00μm、4.00μm、4.00μm、0.80μm、0.80μm。
41、所述复合扩增体系1、所述复合扩增体系2、所述复合扩增体系3或所述复合扩增体系4还可包括进行pcr扩增反应所需的试剂；所述“进行pcr扩增反应所需的试剂”不包括pcr扩增反应所需的引物。
42、上述任一所述复合扩增体系1由热启动taq酶(roche公司)、mgcl2(sigma公司)、pcrbuffer、上述任一所述引物组合1和模板组成。该复合扩增体系1中，mg2+的浓度为2.5mm，引物组合1中各个引物的浓度见表1中第4列。所述模板具体可为样品的线粒体dna。所述样品可为人血液采集卡。
43、复合扩增体系2由热启动taq酶、mgcl2、pcrbuffer、上述任一所述引物组合2和模板组成。该复合扩增体系2中，mg2+的浓度为2.5mm，引物组合2中各个引物的浓度见表1中第4列。所述模板具体可为样品的线粒体dna。所述样品可为人血液采集卡。
44、复合扩增体系3由热启动taq酶、mgcl2、pcrbuffer、上述任一所述引物组合3和模板组成。该复合扩增体系3中，mg2+的浓度为2.5mm，引物组合3中各个引物的浓度见表1中第4列。所述模板具体可为样品的线粒体dna。所述样品可为人血液采集卡。
45、复合扩增体系4由热启动taq酶、mgcl2、pcrbuffer、上述任一所述引物组合3和模板组成。该复合扩增体系3中，mg2+的浓度为2.5mm，引物组合3中各个引物的浓度见表1中第4列。所述模板具体可为样品的线粒体dna。所述样品可为人血液采集卡。
46、含有上述任一所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的用途可为a1)-a4)中的至少一种：a1)mtdna snp位点分型；a2)mtdna分型；a3)检测遗传标记；a4)母系亲缘关系鉴定；
47、所述用途用于非疾病的诊断与治疗。
48、本发明还保护上述任一所述复合扩增体系或上述任一所述试剂盒的制备方法；该制备方法包括将上述任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
49、本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为a1)-a4)中的至少一种：a1)mtdna snp位点分型；a2)mtdna分型；a3)检测遗传标记；a4)母系亲缘关系鉴定；
50、所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
51、本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系的应用，可为a1)-a4)中的至少一种：a1)mtdna snp位点分型；a2)mtdna分型；a3)检测遗传标记；a4)母系亲缘关系鉴定；
52、所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
53、所述60个mtdna snp位点分别为g5417a、c7196a、g709a、g3010a、g16129a、a235g、a10397g、c8794t、a9545g、c3970t、g15043a、t16362c、c11215t、c12705t、g13590a、c8414t、c4883t、c14668t、g6962a、g8020a、a8701g、a249d、(ca)n、g4491a、g11969a、g10398a、t16519c、g10310a、t12811c、a1736g、t9824c,a、g16319a、a4715g、g5460a、c4071t、c15535t、a13104g、t146c、t1107c、c12405t、c10873t、t14470c、g14569a、a4833g、t16217c、g8584a、t16093c、c10400t、g14476a、c152t、t5442c、g11914a、g7600a、t16223c、c5178a、g13928c、g9123a、t16298c、g1719a和norm9bpdel。
54、本发明提供的试剂盒可以检测60个mtdna snp位点，即可以检测更多的遗传信息。同时本发明提供的复合扩增体系中60个mtdna snp位点中扩增子长度均小于300bp，有利于降解检材的分析。本发明制备的试剂盒操作简便、结果可靠、耗时较短，能够达到高通量、低成本、可重复及自动化等要求，便于今后大规模推广应用。同时该试剂盒用现有的毛细管电泳平台可以检测，有助于后期在基层dna实验室进行大规模推广和应用。本发明具有重要的应用价值。
1.引物组合，由引物组合1、引物组合2、引物组合3和引物组合4组成；
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：
3.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：
4.复合扩增体系，由复合扩增体系1、复合扩增体系2、复合扩增体系3和复合扩增体系4组成；
5.如权利要求4所述复合扩增体系，其特征在于：
6.如权利要求4所述复合扩增体系，其特征在于：所述复合扩增体系1、所述复合扩增体系2、所述复合扩增体系3或所述复合扩增体系4还包括进行pcr扩增反应所需的试剂；所述“进行pcr扩增反应所需的试剂”不包括pcr扩增反应所需的引物。
7.含有权利要求1至3任一所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为a1)-a4)中的至少一种：
8.权利要求4至6任一所述复合扩增体系或权利要求7所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1至3任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
9.权利要求1至3任一所述引物组合或权利要求4至6任一所述复合扩增体系在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为a1)-a4)中的至少一种：
10.权利要求1至3任一所述引物组合或权利要求4至6任一所述复合扩增体系的应用，为a1)-a4)中的至少一种：
