本文所述方法和组合物总体上涉及核酸扩增的领域。
背景技术：
：：1、存在多种可用的核酸扩增方法，且许多方法已被用于进行基于核酸检测的灵敏诊断测定。聚合酶链式反应(pcr)仍是最广泛使用的dna扩增和定量方法。示例性pcr相关方法和组合物记载于以下专利和出版物中：2、美国专利4,965,188process for amplifying,detecting,and/or cloningnucleic acid sequences using a thermostable enzyme-pcr；3、美国专利5,011,769methods for detecting nucleic acid sequences-cyclingprobe technology；4、美国专利5,066,584methods for generating single stranded dna by thepolymerase chain reaction-asymmetric pcr；5、美国专利5,432,272method for incorporating into dna or rnaoligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases-non-naturalbases；6、美国专利5,712,124strand displacement amplification-sda isothermalamplification；7、美国专利5,994,056homogeneous methods for nucleic acid amplificationand detection-real time pcr；8、美国专利6,150,097nucleic acid detection probes having non-fretfluorescence quenching and kits and assays including such probes-molecularbeacons；9、美国专利6,174,670b1 monitoring amplification of dna during pcr-hrmprobes；10、美国专利6,410,278b1 process for synthesizing nucleic acid-loop-mediated isothermal amplification(lamp)；11、美国专利7,270,981b2 recombinase polymerase amplification-rpaisothermal amplification；12、美国专利7,282,328b2 helicase dependent amplification of nucleicacids-hda isothermal amplification；13、美国专利7,381,818b2 fluorescent probes containing 5’minor groovebinder,fluorophore and quenching moieties and methods of use thereof-mgbpleaides probes；14、美国专利7,485,442b2 real-time linear detection probes：sensitive 5’-minor grove binder-containing probes for pcr analysis-mgb eclipse probes；15、美国专利8,911,948b2 rnase h-based assays utilizing modifiedrnamonomers-rnase h2-dependent pcr(rhamp pcr)；16、美国专利9,689,031b2 nicking and extension amplification reaction forthe exponential amplification of nucleic acids-near isothermal amplification；17、美国专利申请2019/0226015a1 improvements in or relating to nucleicacid amplification processes-star non-isothermal near amplification；和18、don et al.1991.‘touchdown’pcr to circumvent spurious priming duringgene amplification.nucleic acids research第19卷，第14期：第4008页.19、这些方法代表了过去三十年来分子生物学中一些最大的创新，特别地因为它们涉及用于扩增和实时检测多种dna或rna分析物的不同方法。虽然每种方法都有不同程度的优势和限制，但整个领域集合的单个最大限制是它们在单个扩增和检测系统中缺乏一致性，无法在单个临床目的样本上提供它们所有的集合属性。20、多结构域酶确实存在于自然界中，其具有多种功能，旨在增强天然特性。本领域寻求增强聚合酶的天然特性，其中，例如，拓扑异构酶v的序列-非特异性dna结合螺旋-发夹-螺旋结构域与dna聚合酶催化结构域的融合被用于增强dna结合，提高持续合成能力(processivity)、热稳定性或耐盐性1,2。这已通过酶证实，例如taq dna聚合酶的stoffel片段、pfu dna聚合酶、φ29dna聚合酶和bst dna聚合酶。异源dna结合蛋白也已与dna聚合酶融合。源自硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的sso7d与激烈火球菌(pyrococcus furiosus)(pfu聚合酶)和taq dna聚合酶的融合提高了持续合成能力3。通过融合taq stoffel dna聚合酶与激烈火球菌连接酶的dna结合结构域，证实了聚合酶的持续合成能力的增强和对pcr抑制剂的耐受性提高4。21、肽接头通常用于融合多肽以形成融合蛋白。富含丝氨酸的接头提供了增加的溶解性和提高的蛋白水解抗性5,7。螺旋接头被插入重组嵌合体的结构域之间，其有助于更高水平的表达并减少结构域间的相互作用6,7。22、1.pavlov,a.et al.biochemistry 2012,51,2032-2043.23、2.pavlov,a.et al.pnas,2002,99,13510-13515.24、3.wang,y.et al.nucleic acids res.2004,32(3),1197-1207.25、4.spibida,m.et al.applied microbiology and biotechnology,2018,102(2),713-721.26、5.美国专利5,525,491serine-rich peptide linkers.27、6.美国专利7,943,733spacers to increase the expression of recombinantfusion proteins.28、7.chen,x.et al.advance drug delivery reviews 65(2013)1357-1369.29、聚合酶的进一步描述记载于以下专利中。30、美国专利9,023,633chimeric dna polymerases31、美国专利8,404,808phage phi29 dna polymerase chimera32、美国专利7,148,049thermostable or thermoactive dna polymerasemolecules with attenuated 3’-5’exonuclease activity33、美国专利8,883,454dna polymerase fusions and uses thereof34、美国专利5,814,506over expression and purification of a truncatedthermostable dnapolymerase by protein fusion35、美国专利9,434,988rnase h based assays utilizing modified rna monomers技术实现思路1、本文考虑到的多种实施方案可包括但不必限于以下一种或多种：2、实施方案1：一种核酸构建体，其包含：靶-特异性区；和位于靶-特异性区的5’的通用适配体序列，其中所述通用适配体序列包含非天然核苷酸碱基。3、实施方案2：实施方案1的核酸构建体，其中核酸构建体额外包含3’末端帽。4、实施方案3：实施方案1或实施方案2的核酸构建体，其中靶-特异性区包含靶-特异性切割结构域。5、实施方案4：实施方案3的核酸构建体，其中靶-特异性切割结构域包含核糖核苷酸。6、实施方案5：实施方案1-4中任一项的核酸构建体，其中非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸。7、实施方案6：实施方案1-4中任一项的核酸构建体，其中非天然核苷酸碱基是脱氧核糖核苷酸。8、实施方案7：实施方案1-4中任一项的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基选自黄嘌呤、异鸟嘌呤、脱氧黄嘌呤、脱氧异鸟嘌呤、异胞嘧啶、脱氧异胞嘧啶、6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、2-氨基-8-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮和2-氨基-8-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮。9、实施方案8：实施方案7的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基选自6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、2-氨基-8-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮和2-氨基-8-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮。10、实施方案9：实施方案7的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基选自2-氨基-8-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮或2-氨基-8-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮。11、实施方案10：一种融合蛋白，其包含：聚合酶或其片段，和内切核酸酶或其片段。12、实施方案11：实施方案10的融合蛋白，其中所述聚合酶是bst dna聚合酶或其片段。13、实施方案12：实施方案11的融合蛋白，其中所述聚合酶是bst dna聚合酶的大片段。14、实施方案13：实施方案11的融合蛋白，其中所述聚合酶是bst 2.0dna聚合酶或其片段。15、实施方案14：实施方案10-13中任一项的融合蛋白，其中所述内切核酸酶是内切核糖核酸酶。16、实施方案15：实施方案14的融合蛋白，其中所述内切核糖核酸酶是rnase h2或其片段。17、实施方案16：一种引物对，其包含：正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物均包含实施方案1-9中任一项的核酸构建体。18、实施方案17：实施方案16的引物对，其中正向引物额外包含3’末端帽(terminal3'cap)。19、实施方案18：实施方案16或实施方案17的引物对，其中反向引物额外包含3’末端帽。20、实施方案19：实施方案16-18中任一项的引物对，其中正向引物的非天然核苷酸碱基与反向引物的非天然核苷酸碱基是相同的。21、实施方案20：实施方案16-18中任一项的引物对，其中正向引物的非天然核苷酸碱基与反向引物的非天然核苷酸碱基是不同的。22、实施方案21：实施方案16-20中任一项的引物对，其中正向引物的非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸且反向引物的非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸。23、实施方案22：实施方案17的引物对，其中正向引物的非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸且反向引物的非天然核苷酸碱基是脱氧核糖核苷酸。24、实施方案23：一种检测靶核酸序列的方法，该方法包括：25、a)提供反应混合物，其包含26、i)实施方案16-22中任一项的引物对；27、ii)样品核酸，其可包含或可不包含所述靶序列；28、iii)切割活性；和29、iv)聚合酶活性；30、b)将引物对的第一引物与靶核酸序列(如果存在)杂交，以形成包含靶核酸序列和第一靶-特异性切割结构域的第一双链底物；31、c)在第一靶-特异性切割结构域内的点或邻近第一靶-特异性切割结构域处的点用第一切割活性切割杂交的第一引物；32、d:)用聚合酶活性延伸引物以形成第一模板；33、e)将引物对的第二引物与第一模板杂交，以形成包含靶核酸序列和第二靶-特异性切割结构域的第二双链底物；34、f)在第二切割结构域内的点或邻近第二切割结构域的点用第二切割活性切割杂交的第二引物；35、g)用聚合酶活性延伸引物以形成第一扩增子，所述第一扩增子在第一链上包含源于所述第一引物的第一非天然核苷酸碱基；36、h)在第一非天然核苷酸处或邻近所述第一链处用第三切割活性切割第一链，产生具有3’羟基基团的第一切口；和37、i)用所述聚合酶活性从3’羟基基团延伸，置换第一切口的第一链3’的部分，任选地其中第一、第二和第三切割活性是相同的。38、实施方案24：实施方案22的方法，其中每个引物的3’端末端包含3’末端帽。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.一种核酸构建体，其包含：
2.权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体额外包含3’末端帽。
3.权利要求1或权利要求2所述的核酸构建体，其中所述靶-特异性区包含靶-特异性切割结构域。
4.权利要求3所述的核酸构建体，其中所述靶-特异性切割结构域包含核糖核苷酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸。
6.权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基是脱氧核糖核苷酸。
7.权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基选自黄嘌呤、异鸟嘌呤、脱氧黄嘌呤、脱氧异鸟嘌呤、异胞嘧啶、脱氧异胞嘧啶、6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、2-氨基-8-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮和2-氨基-8-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮。
8.权利要求7所述的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基选自6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮、2-氨基-8-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮和2-氨基-8-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮。
9.权利要求7所述的核酸构建体，其中所述非天然核苷酸碱基为2-氨基-8-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮或2-氨基-8-(1’-β-d-2’-脱氧呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮。
10.一种融合蛋白，其包含：聚合酶或其片段，和内切核酸酶或其片段。
11.权利要求10所述的融合蛋白，其中所述聚合酶是bst dna聚合酶或其片段。
12.权利要求11所述的融合蛋白，其中所述聚合酶是bst dna聚合酶的大片段。
13.权利要求11所述的融合蛋白，其中所述聚合酶是bst 2.0dna聚合酶或其片段。
14.权利要求10-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述内切核酸酶是内切核糖核酸酶。
15.权利要求14所述的融合蛋白，其中所述内切核糖核酸酶是rnase h2或其片段。
16.一种引物对，其包含：正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物均包含权利要求1-9中任一项所述的核酸构建体。
17.权利要求16所述的引物对，其中所述正向引物额外包含3’末端帽。
18.权利要求16或权利要求17所述的引物对，其中所述反向引物额外包含3’末端帽。
19.权利要求16-18中任一项所述的引物对，其中所述正向引物的非天然核苷酸碱基与所述反向引物的非天然核苷酸碱基是相同的。
20.权利要求16-18中任一项所述的引物对，其中所述正向引物的非天然核苷酸碱基与所述反向引物的非天然核苷酸碱基是不同的。
21.权利要求16-20中任一项所述的引物对，其中所述正向引物的非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸且所述反向引物的非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸。
22.权利要求17所述的引物对，其中所述正向引物的非天然核苷酸碱基是核糖核苷酸且所述反向引物的非天然核苷酸碱基是脱氧核糖核苷酸。
23.一种检测靶核酸序列的方法，该方法包括：
24.权利要求22所述的方法，其中每个引物的3’端末端包含3’末端帽。
技术总结本申请记载了一种综合的新的扩增系统，其可以采用新的核酸构建体作为封闭引物，这种构建体包括靶‑特异性区，其中靶‑特异性区包含靶‑特异性切割结构域，以及位于靶‑特异性区5’的通用适配体序列，其中通用适配体序列包含非天然核苷酸碱基。还记载了用于该系统中的聚合酶和内切核酸酶之间的融合蛋白，以及相关的方法和试剂盒。
技术研发人员：G·约翰斯,C·M·麦克道尔-布坎南,V·巴拉兹奈诺克
受保护的技术使用者：塞弗德公司
技术研发日：技术公布日：2024/6/26
