本发明涉及使用从患者基因组提取的信息来产生核糖核酸rna疫苗。具体地，发现了一种生产rna疫苗的方法，该疫苗包含从感染原或癌症新表位的靶标特异性推导出的多个表位。更具体地，本发明涉及一种用于肿瘤患者的mrna癌症疫苗。本发明还涉及为患者选择新抗原的离体方法，包括提交来自已施用mrna癌症疫苗的患者的血液样品的步骤。在肿瘤学中，用于治疗肿瘤的个性化疫苗，例如包含患者肿瘤的肿瘤特异性抗原(新抗原)的个性化治疗性疫苗，作为下一代个性化癌症免疫疗法具有很大的前景。
背景技术：
1、个性化癌症疫苗接种的概念基于能够触发适当免疫应答的新抗原的鉴定。这将能够产生最佳的个性化疫苗，该疫苗将特异性地增强患者的免疫系统攻击肿瘤。
2、rna疫苗是在个性化癌症治疗中开发的，但也用于威胁和/或预防不同的传染病。rna疫苗可用于诱导针对癌症或传染病的平衡免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫，且不存在例如插入诱变的可能性的风险。rna疫苗可用于治疗和/或预防不同阶段或转移程度的疾病或癌症。
3、目前，rna(mrna)疫苗的一个关键限制(尤其是个性化mrna癌症疫苗)为正确鉴定特异性表位，即肿瘤新表位，这将在患者体内引起适当的免疫应答，导致患者体内t细胞的充分激活，以有效地攻击肿瘤和/或疾病。
4、文献ep3400005涉及一种针对肿瘤新抗原的多个新表位的抗癌疫苗。因此，获得了特异性靶向所鉴定的肿瘤抗原的个性化新抗原疫苗。一方面，本发明涉及一种治疗性抗癌疫苗，其包含免疫有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗原单位的核苷酸序列，所述抗原单位包含(i)2至50个抗原亚单位，每个亚单位包含至少一部分癌症新表位序列和接头，(ii)最终的癌症新表位序列。
5、目前，mrna疫苗的生产为基于dna模板的体外转录。dna模板可以是质粒，也可以是由多个dna片段的多个连接步骤产生的，其通常编码串联表位或新表位。
6、例如，文献wo2018/144082描述了一种rna癌症疫苗及其制备方法。特别地，本文描述了一种基于多联体的mrna疫苗，其中在单个mrna上存在多个癌性表位。
7、文献wo2020/097291描述了一种用mrna疫苗治疗患者癌症的方法。疫苗核酸在给定长度下显示出最大的抗癌功效。
8、kreiter sebastian等人的文献(the journal of immunology，第180卷，2008，309-318页)提到了通过将抗原偶联至mhc分子的抗原呈递效率，其中载体具有启动子、poly-a尾和3’utr序列。
9、遗憾的是，尽管现有技术中的文献描述了其技术优点，但是目前还没有方法能够开发出在患者体内高效触发免疫应答的mrna疫苗。在mrna癌症疫苗中，只有4-20％由mrna疫苗编码的新表位能够激活t细胞反应。肿瘤可以由许多(例如100多个)不同的新表位来表征。因此，一个关键的挑战是选择合适的新表位或特定疾病的表位，将其掺入到mrna疫苗中以在患者体内触发适当的免疫反应。
10、目前的研究进展试图改进预测算法，旨在确定“最佳”新抗原候选物，即患者肿瘤的新抗原候选物，这将在患者体内触发最佳免疫应答，其特征在于激活患者的特定t细胞。本发明人认为，现有技术中已知的鉴定最佳新抗原候选物的方法是基于新抗原肽和hla受体之间的亲和力数据，这些数据仅适用于特定类型的hla受体。因此，目前鉴定最佳新抗原候选物的方法可能对具有所述特定类型hla受体的患者有一定的疗效，而对于具有不同特定类型hla受体的大部分患者，这些方法将是无效的。
技术实现思路
1、因此，需要开发一种用于生产rna疫苗的方法，所述rna疫苗包含从患者的靶标特异性推导出的多个表位，其中所述多个表位对患者的特定hla受体具有亲和力。
2、具体地，本发明提供了一种生产包含从靶标特异性推导出的多个表位的rna疫苗的方法；所述方法包括如下步骤：
3、-在编码从所述靶标推导出的多个不同表位的库中获得多个不同的合成dna构建体，所述dna构建体位于允许真核细胞将rna序列翻译成肽的序列附近，并且具有用于将编码所述表位的所述dna构建体和允许翻译成肽的所述序列转录成所述mrna序列的启动子；
4、和
5、-在体外将所述多个合成dna构建体转录成相应的多个rna；
6、其中所述靶标为肽；所述肽来自感染原或在一名患者中特异性鉴定为在肽水平上具有至少一个氨基酸差异的癌症新表位。换而言之，这相当于与来自所述患者正常细胞的肽相比具有至少一个氨基酸差异的肽。事实上，本发明的方法(其中多个合成dna构建体已在库中获得)允许具有大量的、可能是无限数量的不同dna构建体。因此，本发明的rna疫苗可以掺入非常大量的传染病表位或来自肿瘤的表位，即新表位，并且其中许多将导致患者的t细胞活化。
7、根据本发明，患者体内的免疫应答是指靶向新抗原或感染原的特异性t细胞，优选细胞毒性t细胞的产生。可选地，通过检测患者t细胞产生的一种或多种免疫标记物(例如ifn-γ)来体外测试免疫应答，其中将患者的所述t细胞与mrna疫苗的特异性表位接触。可选地，或此外，通过从已经施用了本发明的mrna疫苗的患者的血液样本中鉴定cd8+cd107a+t细胞来测定免疫应答。
8、根据本发明，术语“与来自正常细胞的肽相比至少一个氨基酸差异”是指存在于来自患者的肿瘤细胞的dna或rna或来自感染原的dna或rna中的开放阅读框编码的氨基酸序列，并且不存在于患者的正常细胞(例如外周血单个核细胞(pbmc))中或匹配的非癌组织中。
9、本发明还涉及一种用于患有肿瘤的患者的mrna癌症疫苗，该疫苗包含编码多种新抗原的多种mrna，其中所述多种新抗原是从肿瘤中推导出来的，其中所述多种mrna编码在所述肿瘤中鉴定的所有肿瘤新抗原的至少1％，优选至少2％，进一步优选为至少5％，更优选为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
10、本发明还涉及一种为患者选择新抗原的离体的方法，其包括将来自已施用根据本发明的mrna癌症疫苗或通过根据本发明的方法可获得的rna疫苗的患者的血液样本与相应的合成肽新表位或其一种或多种截短版本接触，以及鉴定哪些合成肽新表位触发了免疫应答的步骤。
11、本发明的其他特征和优点将从以下非限制性描述，并通过参考附图和实施例得出。
12、根据本发明，术语“新抗原(neoantigen)”是指患者的肿瘤特异性抗原。在本发明的框架中，“新抗原”包含与患者正常细胞中天然存在的肽相比，至少具有一个氨基酸不同的氨基酸序列。
13、根据本发明，术语“新表位(neoepitope)”是指源于能够与患者的主要组织相容性复合体(mhc)结合的新抗原的肿瘤特异性肽。
14、根据本发明，术语“与患者正常细胞中天然存在的肽相比至少具有一个氨基酸不同的氨基酸序列”是指(i)具有在患者正常细胞中天然存在的氨基酸序列的相应位置至少有一个氨基酸不同的氨基酸序列的肽，和/或(ii)患者正常细胞中不存在的肽，即肿瘤中存在，而患者正常细胞中不存在的全新氨基酸序列(这种情况与用感染原的氨基酸序列接种疫苗有更多相似之处)，因此，其是有利的。此外，术语“与患者正常细胞中天然存在的肽相比，至少具有一个氨基酸不同的氨基酸序列”涵盖易位事件或剪接位点突变后产生的新抗原；这些事件产生具有与来自正常组织的肽高度同源的片段和不同的c-末端片段的肽，或者产生与来自正常组织的另一肽高度同源的肽。换而言之，任何产生与正常组织中发现的肽不是100％相同的肽的遗传事件都符合上述定义。
15、在本发明(产生mrna，(起始)dna构建体，获得的mrna或mrna本身的方法)中，优选地，dna，并且因此mrna包含3’poly a片段。优选地，该3’poly a片段由100％的腺苷组成，或基本上由腺苷组成，例如由其他核苷酸分隔的至少10个连续腺苷残基的片段，优选至少20、30、40个连续腺苷残基的片段，少于20个、优选少于10个残基的片段不形成上述片段；接着是至少10个连续腺苷残基的第二片段(与第一片段的长度无关，至少20、30、40个连续腺苷残基)；接着可能是分隔的核苷酸(少于20个残基，优选少于10个残基不形成一个片段)和随后的腺苷片段(也包含在术语“poly a片段”的限定中)，条件是在这些片段中存在至少90个腺苷残基，优选至少120个腺苷残基，以形成“poly a片段”。
16、具体地，本发明人开发了一种生产mrna疫苗的方法，该疫苗包含从靶标特异性推导出的多个表位。这可以确保施用能够被患者免疫系统识别的表位。本发明人已经证明了这种方法提供了比基于疫苗接种的方法更强的免疫应答，在基于疫苗接种的方法中，向患者施用一种或几种不同的表位，即使这些表位是使用最新技术选择和/或设计的，该最新技术包括为增加免疫应答的可预测性而开发的生物信息学工具。鉴于有效的表位被大量的非有效表位所稀释，这种积极的结果是令人惊讶的。该方法包括以下步骤：
17、-在编码从所述靶标推导出的多个不同表位的库中获得多个不同的合成dna构建体，所述dna构建体位于允许真核细胞将rna序列翻译成肽的序列附近，并且具有用于转录编码所述表位的所述dna构建体和允许翻译成肽的所述序列的启动子；
18、和
19、-在体外将所述多个合成dna构建体转录成相应的多个rna；
20、其中所述靶标为肽，所述肽来自感染原或来自在一名患者体内被特异性鉴定为与来自所述患者正常细胞的肽相比具有至少一个氨基酸差异的癌症新表位。
21、优选地，dna转录成rna序列是在假尿苷和/或n1-甲基假尿苷、15-甲基尿苷(m5u)和/或2-硫尿苷(s2u)存在下进行的。
22、优选地，获得rna序列的方法还包括添加5’帽元件的步骤，该元件包含通过三磷酸片段分隔(以5’-3’连接)的两个核苷酸。这两个核苷酸可以是天然的，也可以是经修饰的，例如，通过对形成5’帽元件的一个或两个残基中2’位的-oh残基(2-o-me核苷酸)进行甲基化修饰。5’帽元件可以包含额外的基团，包括额外的核苷酸，前提是两个核苷酸通过三磷酸基团而不是单磷酸基团分隔(以5’-3’连接)。
23、优选地，dna构建体(因此也是编码的mrna)进一步包含多个编码肽序列的序列元件，用于编码的肽的内体靶向。例如，用于内体靶向的肽序列为溶酶体相关膜蛋白(lamp1或lamp2)的信号序列，例如树突状细胞(dc-lamp)的信号序列和/或靶向mhc-1受体的表位的序列，例如seq id no:3。
24、有利地，dna构建体(因此也是编码的mrna)进一步包含多个编码肽序列的序列元件，用于装载编码的肽以呈递至t淋巴细胞。更优选地，编码用于装载编码的肽以呈递至t淋巴细胞的肽序列的多个序列元件为树突状细胞溶酶体相关膜糖蛋白信号序列，例如seq idno:5。
25、优选地，多个不同的dna构建体共享相同的多个编码用于编码的肽的内体靶向的肽序列的序列元件，和/或相同的多个编码用于装载编码的肽以呈递至t淋巴细胞的肽序列的序列元件。
26、优选地，允许真核细胞将rna序列翻译成肽的序列为位于dna构建体5’utr区(编码区上游)的翻译增强子/启动子序列。更优选地，允许翻译的序列为选自包含以下翻译增强子/启动子序列的组中的翻译增强子/启动子序列：人巨细胞病毒(cmv)增强子、α或β-球蛋白增强子(例如seq id no:2)、ef-1α增强子、猿猴病毒40(sv40)增强子、pgk1启动子、泛素c启动子、hsd17b4和β-肌动蛋白启动子。
27、优选地，所述dna构建体(因此也是编码的mrna)进一步包含至少一个编码3’-utr和/或3’poly a尾部片段的序列元件。更优选地，3’poly a尾部片段至少有68个核苷酸，有利地至少有100个核苷酸(见上文定义)。
28、有利的是，多个dna构建体共享相同的启动子序列(用于rna分子的转录)。优选地，启动子序列为噬菌体rna聚合酶启动子。更优选地，该启动子序列属于一组启动子序列，其包含t7 rna聚合酶(seq id no:1)、sp6 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、syn5rna聚合酶、kp34rna聚合酶的启动子序列。有利地，本发明的启动子序列为t7 rna聚合酶的启动子序列。关于dna构建体以及dna构建体的dna序列的详细解释可以参见2021年9月13日提交的专利文献ep21196390.5。
29、优选地，在转录步骤中加入识别共享启动子序列的转录因子。
30、根据本发明，库中的多个合成mrna构建体可通过生产多个合成dna构建体的方法获得，该方法包括进行以下合成的步骤：
31、(i)第一单链dna分子，其包含用于在rna中转录的启动子、用于其翻译的片段和用于内体寻址的靶向序列，该靶向序列与肿瘤新抗原或来自感染原的表位在框架内融合，以及编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染原的表位以呈递至t淋巴细胞的序列的遗传元件的第一部分；以及
32、(ii)第二单链dna分子，其编码遗传元件的第二部分，该遗传元件编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染原的表位以呈递至t淋巴细胞的序列，其中所述第二单链dna分子为反义的，并且其中所述第一和第二部分形成用于装载肿瘤新抗原或来自感染原的表位以呈递至t淋巴细胞的完整序列，并且所述第一和第二部分呈现允许特异性碱基配对的重叠(至少15个连续核苷酸)。
33、所述方法还包括将(i)中的dna分子与(ii)中的dna分子杂交并延伸这两个分子以产生双链dna分子，然后在体外转录多个dna分子以形成多个mrna构建体的步骤；该双链dna分子编码启动子、翻译起始子、与肿瘤新抗原或来自感染原的表位在框架内融合的用于内体寻址的靶向序列和编码用于装载编码的肿瘤新抗原或来自感染原的表位以呈递至t淋巴细胞的序列的遗传元件。
34、根据本发明，第一单链dna分子和可能的第二单链dna分子的合成优选使用硅基dna写入技术合成。或者，第二个单链分子为“母液”，它已合成一次，经过酶促扩增并储存，以提高整个过程的效率，因为只有一个分子需要进行化学合成。
35、优选地，根据本发明的方法进一步包括优化多个dna的序列的初始步骤，优选地，通过选择更丰富的密码子，和/或避免有害的二级结构。有害的二级结构可以使用现有的计算机模拟工具进行预测，从而在可能的情况下加以避免。
36、优选地，在转录成rna的步骤中添加假尿苷。
37、优选地，在转录成rna的步骤中，将假尿苷进一步添加到尿苷中或替换所有尿苷。除了假尿苷和/或n1-甲基假尿苷之外，15-甲基尿苷(m5u)和/或2-硫尿嘧啶(s2u)也可以掺入mrna中。
38、优选地，可能通过使用密码子简并性，使得多个mrna中的每个mrna的rna序列富含假尿苷，同时保持相应编码的肽的序列。
39、优选地，如所提及的，rna序列包含一个5’帽元件，该元件包含通过三磷酸片段分隔(以5’-3’连接)的两个核苷酸。这两个核苷酸可以是天然的，也可以是经修饰的，例如，在2’位的-oh残基(2-o-me核苷酸)进行甲基化修饰。5’帽元件可以包含额外的基团，包括额外的核苷酸，前提是两个核苷酸通过三磷酸基团而不是单磷酸基团分隔(以5’-3’连接)。
40、优选地，多个不同的dna分子中至少有40个不同dna分子编码至少40个不同的表位、优选至少50个或至少60、80、100或甚至120个不同的表位。
41、优选地，本发明的方法进一步包括扩增多个合成dna构建体以产生dna构建体扩增库的步骤，其中dna构建体扩增库用作体外转录步骤的模板。
42、优选地，用于生产mrna疫苗的方法还包括在体外转录步骤之后检查多种mrna中的每种mrna的质量和/或数量的步骤。优选地，通过对多种mrna进行测序来测定多种mrna中的每种mrna的质量和/或数量。
43、优选地，用于生产mrna疫苗的方法还进一步包括将多种mrna任选地与一种或多种佐剂一起配制到可施用于患者的载体中的步骤。然而，这种rna疫苗接种不需要佐剂，尤其是当尿苷残基较少或完全被假尿苷取代时。
44、本发明还涉及一种用于患有肿瘤的患者的mrna癌症疫苗，该疫苗包含编码多种新抗原的多种mrna，其中所述多种新抗原是从肿瘤中推导出来的，其中所述多种mrna编码肿瘤中鉴定的所有肿瘤新抗原的至少1％，优选至少2％，进一步优选至少5％，更优选在肿瘤中鉴定的所有肿瘤新抗原的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
45、优选地，如上所述，根据本发明的mrna疫苗进一步包含(i)编码用于稳定和/或靶向和/或转运肿瘤新抗原的序列的片段，和/或(ii)编码用于将编码的肿瘤新抗原定位到mhc分子的序列的片段，和/或(iii)编码翻译增强子的片段，和/或(iv)3’-utr和/或(v)3’poly a尾片段和/或(vi)5’-utr。
46、优选地，rna序列包含一个5’帽元件，该元件包含通过三磷酸片段分隔(以5’-3’连接)的两个核苷酸。这两个核苷酸可以是天然的，也可以是经修饰的，例如，在2’位的-oh残基(2-o-me核苷酸)进行甲基化修饰。5’帽元件可以包含额外的基团，包括额外的核苷酸，前提是两个核苷酸通过三磷酸基团而不是单磷酸基团分隔(以5’-3’连接)。
47、优选地，多种mrna编码肿瘤中鉴定出的所有肿瘤新抗原的至少2％、优选至少5％、更优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
48、有利地，将多种mrna掺入一种或多种脂质纳米颗粒中。优选地，多种mrna与带正电荷的脂质复合。优选地，多种mrna和带正电的脂质在微流体芯片中混合。
49、任选地，一种或多种1型佐剂与多种mrna掺入以形成mrna癌症疫苗，其中一种或多种佐剂优选选自具有无定形羟基磷酸硫酸铝(aahs)、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)或单磷酸脂质a的1型佐剂的组中。然而，当假尿苷已掺入mrna疫苗中时，不需要此类佐剂。
50、可选地，多种mrna还包括dna或mrna形式的2型佐剂，该2型佐剂编码组成活性tlr4(catlr4)和/或cd70和/或cd40l和/或干扰素γ和/或诱饵白介素受体，即白介素1受体ii型。有利地，当掺入mrna疫苗中时，2型佐剂dna或mrna促进对患者树突状细胞的刺激，并增加向患者t细胞呈递多个新表位的功效。此类佐剂对患者树突状细胞的离体成熟特别有用。
51、优选地，多种mrna还包括dna或mrna形式存在的3型佐剂，所述3型佐剂编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)，例如编码甲病毒nsp1-4的非结构蛋白的dna或rna。事实上，mrna疫苗的多种mrna能够进行反式扩增，例如基于编码的rdrp的反式扩增，是有用的。这种rna反式扩增允许减少患者的mrna疫苗的施用剂量。
52、优选地，多种mrna的每种mrna的rna序列中存在的至少25％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％的尿苷被假尿苷或n1-甲基假尿苷或15-甲基尿苷或2-硫代尿苷取代。更优选地，多种mrna的每种mrna的rna序列中存在的至少25％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％的尿苷被假尿苷取代。
53、本发明还涉及一种为患者选择新抗原的离体方法，其包括将来自已施用根据本发明的mrna癌症疫苗或通过根据本发明的方法可获得的rna疫苗的患者的血液样本与相应的合成肽新表位或其一个或多种截短版本接触，以及鉴定哪些合成肽新表位触发免疫应答的步骤。
54、事实上，这种选择患者肿瘤新抗原的方法包括以下步骤：提交该患者的离体血液样本，该样本之前已经给予了如上所述的多种肿瘤新抗原，并对血液样本进行测试，以确定其对哪种新表位产生反应。
55、该方法允许快速产生用于治疗该患者的更精细的新抗原库。
56、在实践中，合成对应于已鉴定的新抗原的肽，然后在不同隔室中配制成水溶液，并允许一种肽在给定隔室中与离体样本反应。对于太长的肽或预计水溶性太差的新抗原，可以生成具有从该新抗原推导出的序列的截短的肽，例如从新抗原的n-端末端开始，或者从该n-端末端下游的氨基酸(例如，从n-端末端开始的1、2、3、4或5个氨基酸)开始的肽，到第一个已鉴定的突变为止，或者从该已鉴定的突变后的1、2、3、4或5个氨基酸处结束。替代地或优选地，此外，合成第二重叠肽，其中第一个鉴定的突变在第一个突变的上游侧翼有3、4、5、6、7、8或9个氨基酸，并在第一个突变的下游侧翼有3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。可选地，或优选地，此外，还合成了起始于第一个鉴定的突变，或该第一个鉴定的突变上游的1、2、3、4或5个氨基酸，并终止于新抗原c末端，或该新抗原c末端上游的1、2、3、4或5个氨基酸的(第二个或第三个)重叠肽。这些(两个或三个)重叠肽可放置在同一隔室中进行测试，或放置在本发明的mrna癌症疫苗或可通过本发明所述方法获得的mrna癌症疫苗的两个或三个不同隔室中，用于在体外鉴定患者肿瘤的一系列新抗原。
57、本发明还涉及根据本发明的离体方法选择的用于受肿瘤影响的患者的疫苗接种的新抗原。
58、本发明还涉及一种在体外扩增对影响患者的肿瘤具有特异性的细胞毒性t细胞的方法，其包括用本发明选择的新抗原处理来自所述患者的血液样本的步骤。
59、实施例
60、实施例1：制备与患者肺部肿瘤中鉴定的新表位相对应的97种mrna
61、发明人从患者的肺部肿瘤样本中分离出dna和rna。发明人还从患者的正常细胞(外周血单核细胞，pbmc)中分离出dna。然后，实施以下步骤：
62、-对来自肿瘤的dna、来自pbmc细胞的dna和rna进行测序，
63、-通过比较来自肿瘤的dna和来自pbmc细胞的dna的dna测序数据，并通过鉴定具有导致检测到mrna转录本的dna变体的肿瘤的开放阅读框，鉴定编码肿瘤新抗原的肿瘤dna变体。
64、-鉴定肿瘤的新抗原，已鉴定出97种不同的新抗原。
65、-生成97个双链dna模板，每个模板包含编码具有27个氨基酸的氨基酸序列的1个不同新表位的dna序列，其中每个新表位序列为一个新抗原序列的一部分，
66、-体外转录这97个双链dna模板以产生97种mrna。
67、实施例2：根据本发明的mrna疫苗的组合物
68、发明人开发了一种mrna疫苗，其包含：
69、-97种不同的mrna，每种mrna编码从患者的肺部肿瘤中鉴定出的27个氨基酸的新表位。每剂mrna疫苗中这97种不同mrna的总量为1000μg。
70、-带正电荷脂质。
71、实施例3：mrna疫苗中包括的97种不同mrna的质量和数量
72、在将多种mrna(参见实施例1中的97种不同mrna)掺入mrna疫苗组合物(参见实施例2)之前，发明人通过进行rna测序来检查多种mrna中的每种mrna的质量和数量。为此，发明人使用逆转录酶准备了双链cdna合成，并通过pcr进行illumina接头连接和cdna文库扩增。然后使用高通量设备(此处为illumina novaseq 6000)以成对末端100b模式进行rna测序。
73、实施例4：使用mrna疫苗作为诊断工具，通过检测t细胞激活来生产更有效的个性化mrna疫苗
74、本发明人使用实施例2的mrna疫苗作为诊断工具，在编码各自不同新表位的97种不同mrna中鉴定刺激患者t细胞的新表位。
75、为此，将实施例2的mrna疫苗施用给患有肺部肿瘤的患者。10天后，收集患者的血液，从中分离出外周血单核细胞和t细胞。使用抗cd3磁珠(milteny)从血液的pbmc中分离出t细胞。同时，合成对应于97种不同mrna的新表位氨基酸序列的3×97个肽，每个肽的量为1～4μg；在每种情况下，一个肽从新抗原的n-末端开始，结束于第一个已鉴定的差异(突变)后的三个氨基酸处；第二个肽从第一个已鉴定的差异(突变)前的7个氨基酸开始，结束于该差异之后的7个氨基酸；第三个肽从第一个差异(突变)前的3个氨基酸开始，结束于新表位的c-末端。通过elispot检测法测试了3×97种新表位的每个肽，其中将从患者血液中分离出的t细胞与每个肽(源自一个新表位的三个肽在一孔中组合存在)接触。然后，发明人通过检测对应于给定新表位(肽)的孔中ifn-γ的产生来检测患者的t细胞是否被mrna疫苗编码的给定新表位(肽)激活。
76、从97种新抗原中，发明人鉴定出63种激活患者t细胞的新抗原。
77、实施例5：使用mrna疫苗作为工具，通过检测cd8细胞活化来生产第二代mrna疫苗
78、与实施例4一样，将实施例2的mrna疫苗施用给患有肺部肿瘤的患者。10天后，收集患者的血液样本，从中分离出外周血单核细胞(pbmc)和t细胞。使用抗cd3磁珠(milteny)从血液的pbmc中分离出t细胞。从分离出的cd3+细胞(t细胞)部分中，分别通过抗cd8和抗cd4磁珠分离出cd8+和cd4+细胞。从cd8+细胞和cd4+细胞中去除的cd3+细胞部分代表抗原呈递细胞(apc)的部分。平行地，使用与实施例4相同的方法合成了对应于97种不同mrna的新表位氨基酸序列的3×97个肽，每个肽的量为1至4μg。通过elispot检测法测试了97种新抗原中的每个肽，其中从患者血液中分离出的t细胞与每种新抗原(源自一个新抗原的三个肽在一孔中组合存在)接触。然后，在cd8+细胞存在的情况下，用每个肽对抗原呈递细胞(apc)部分进行电穿孔。然后测量ifn-γ的产量。
79、从97种新抗原中，发明人鉴定出24种特异性激活患者cd8+细胞的新抗原。
80、实施例6：使用mrna疫苗作为工具，通过检测cd107a生产更有效的个性化mrna疫苗。
81、进行与实施例5中相同的步骤。此外，通过使用抗cd107a标记物测量每孔中cd107a的表达。cd107a为脱颗粒标记物(cd8+细胞功能性细胞毒性的指标)。
82、从特异性激活患者cd8+细胞的24种新抗原中(参见实施例5)，通过测量cd107a的表达鉴定出7种新抗原具有功能性细胞毒性。
83、实施例7：优化的mrna疫苗
84、将mrna疫苗注射到患者的肺部肿瘤中后2个月(参见实施例5)，向患者施用300μg包含7种鉴定的新抗原的优化的mrna疫苗。
85、实施例8：第二代细胞疗法
86、对于一些患者来说，细胞治疗方法为首选的，因此，本发明人利用上述广泛且完善的系统来产生能够直接攻击肿瘤的体外t细胞。为此，如实施例4-7，在患者的肺部肿瘤中注射mrna疫苗并鉴定出优化的新表位2个月后，通过分离患者的7个cd8+cd107a+细胞系对肿瘤进行细胞治疗。为此，使用作为mrna疫苗施用的7个优化的新表位以及通过转染编码活性tlr4(catlr4)、cd70和cd40l的质粒，使患者的树突状细胞成熟。然后，将患者的7个cd8+cd107a+细胞系进行离体扩增，然后重新注射到患有肺部肿瘤的患者体内。
87、应当理解，本发明不限于所描述的实施例，在不超出权利要求的范围的情况下，可以应用各种变体。
1.一种生产包含从靶标特异性推导出的多个表位的rna疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dna构建体进一步包含多个编码肽序列的序列元件，所述序列元件用于编码的肽的内体靶向。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述dna构建体还包含多个编码肽序列的序列元件，所述序列元件用于装载编码的肽以呈递至t淋巴细胞，和/或其中所述dna构建体还包含至少一个编码翻译增强子的序列元件，和/或，其中所述dna构建体还包含至少一个编码3’-utr和/或3’poly a尾段的序列元件，优选地，其中多个不同的dna构建体共享相同的多个编码用于编码的肽的内体靶向的肽序列的序列元件，和/或相同的多个编码用于装载编码的肽以呈递至t淋巴细胞的肽序列的序列元件。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，多个dna构建体共享相同的启动子序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在转录步骤中加入识别共享启动子序列的转录因子。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在转录成rna的步骤中添加假尿苷。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括优化多个dna序列的初始步骤，优选地，通过选择更丰富的密码子，和/或避免有害的二级结构。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，多个不同的dna分子中至少有40个不同的dna分子编码至少40个不同的表位、优选至少50个或至少60、80、100或甚至120个不同的表位。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向不同表位添加5’帽元件的步骤，其中所述帽元件包含由三磷酸片段分隔的两个核苷酸。
10.一种用于患有肿瘤的患者的mrna癌症疫苗，其特征在于，所述mrna癌症疫苗包含编码多种新抗原的多种mrna，其中所述多种新抗原是从肿瘤中推导出来的，其中所述多种mrna编码在肿瘤中鉴定的所有肿瘤新抗原的至少1％，优选至少2％，更优选至少5％，进一步更优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
11.如权利要求10所述的mrna癌症疫苗，其特征在于，所述多种mrna的每种mrna的rna序列中存在的至少25％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％的尿苷被假尿苷或n1-甲基假尿苷或15-甲基尿苷或2-硫代尿苷取代。
12.一种为患者选择新抗原的离体的方法，其特征在于，所述方法包括将来自已施用如权利要求10或11所述的mrna癌症疫苗或通过如权利要求1-9任一项所述的方法获得的rna疫苗的患者的血液样本与相应的合成肽新表位或其一种或多种截短版本接触，以及鉴定哪些合成肽新表位触发免疫应答的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述免疫应答为细胞毒性免疫反应。
14.根据如权利要求12或13所述的方法所选择的新抗原在受肿瘤影响的患者的疫苗接种中的应用。
15.一种体外扩增对影响患者的肿瘤具有特异性的细胞毒性t细胞的方法，其特征在于，所述方法包括用如权利要求12或13所述的方法所选择的新抗原处理来自所述患者的血液样本的步骤。
