本发明涉及干诱导多能性干细胞，尤其是涉及一种具有免疫细胞的结肠类器官构建方法。
背景技术：
1、随着发育生物学与转化医学等领域的快速发展，基于人诱导多能干细胞（ips）的肠、肝、脑、肾、胃等多种类器官诱导分化技术近年来依次被成功开发；较之传统细胞模型，该技术不仅解决了样本来源受限的问题，产生的类器官在谱系多样性、结构仿生性、与功能特异性上也更接近人体真实器官的生理原貌，因此在疾病的分子机制解析、治疗靶点发现、与药效药毒评价等方面潜力巨大。
2、然而，与真实器官相比，大部分诱导分化而来的类器官仅由内胚层衍生的上皮细胞构成，尚缺乏中胚层所衍生的免疫细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等。这些谱系类型不但对器官生理上的形态发生和功能行使至关重要，也与炎症发生、纤维化、癌变等多种疾病的发生发展密切相关。关键谱系类型的缺失使得这些模型在生理病理指标上与临床结果偏差较大，成为类器官向药毒药效评价模型转化的一大阻碍。迄今为止，尚无可内源性产生含免疫细胞的大肠类器官的相关报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明旨在提供一种具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，该方法在不引入任何外源细胞，且不进行遗传改造的前提下，实现了具有功能性巨噬细胞的结肠类器官的诱导分化。功能上，巨噬细胞具备吞噬功能，在不同诱导条件下可发生m1与m2型极化。该技术克服了当下类器官模型在谱系多样性上的短板，适合作为新一代人源精细化肠道类器官模型，为肠病的分子机制研究、疾病模拟、药物靶点发现、药效筛选等提供更可靠的研究工具。
2、为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：
3、一种具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，该方法包括如下步骤：
4、s1、诱导多能干细胞产生内胚层及小部分中胚层；
5、s2、使用添加有vegf和scf的培养基继续培养至产生后肠管衍生物；
6、s3、使用添加有vegf和m-csf的培养基继续培养至产生具备巨噬细胞的多谱系结肠类器官；
7、其中，s2和s3还采用造血细胞培养基stempro-34。
8、在s2中，在大肠经典诱导组合的基础上，添加诱导因子vegf与scf可促进造血祖细胞的分化；以此为基础，在s3加入vegf与m-csf促进巨噬细胞的分化与形成。
9、此外，造血细胞培养基stempro-34在s2与s3添加用以维持。s2和s3任何一个阶段缺少stempro-34都会影响cd68+巨噬细胞的形成。
10、进一步，s1的培养天数为2-3天，s2的培养天数为6-7天，s3的培养天数为30-32天。
11、优选地，s1的培养天数为3天，s2的培养天数为6天，s3的培养天数为31天。
12、进一步，s1包括两个阶段，即s11和s12，s11在添加有bmp4、acta的培养基中进行，s12在添加有acta、fgf2的培养基中进行。
13、进一步，在s1之前，待多能干细胞汇合度达80-95%，启动分化。
14、进一步，s2中，vegf为rhvegf，浓度为10-20 ng/ml；scf为rhscf，浓度为5-15 ng/ml；培养基中stempro-34的体积比为21.25%-42.5%。
15、进一步，s2之后，收集2d细胞单层上产生的3d中后肠衍生物后，使用cultrex基质胶进行3d包被，并加入s3的分化培养基中。
16、进一步，s3包括两个阶段，即s31和s32；s31的培养基中添加有bmp2、egf和wnt/β-连环蛋白激活剂，培养基中stempro-34的体积比为21.25%-42.5%；s32的培养基中添加有egf、vegf、m-csf、bmp抑制剂和wnt/β-连环蛋白激活剂，vegf为rhvegf，浓度为10-20ng/ml，m-csf为rhm-csf，浓度为10-20 ng/ml，培养基中stempro-34的体积比为17.5-35%。
17、优选地，wnt/β-连环蛋白激活剂为chir99021、wnt3a中的一种；
18、bmp抑制剂为ldn193189、nog、bml-275 中的一种。
19、本发明还提供了一种具备免疫细胞的多谱系结肠类器官，该类器官由上述所述的方法构建，该类器官表达cd68，具有功能性巨噬细胞。
20、本发明还提供了一种如上述所述的具备免疫细胞的多谱系结肠类器官在建立疾病模型上的应用。
21、本发明还提供了一种用于上述所述的方法的培养基，所述培养基包括在s2中添加并用于促进造血祖细胞的分化的vegf和scf、在s3中添加并用于促进巨噬细胞的分化与形成的vegf和m-csf以及在s2和s3连续使用的造血细胞培养基stempro-34。
22、相对于现有技术，本发明所述的具有免疫细胞的结肠类器官构建方法具有以下优势：
23、本发明所述的方法在不引入任何外源细胞，且不进行遗传改造的前提下，实现了具有功能性巨噬细胞的结肠类器官的分化。功能上，巨噬细胞具备吞噬功能，在不同诱导条件下可发生m1与m2型极化。该技术克服了当下类器官模型在谱系多样性上的短板，适合作为新一代人源精细化肠道类器官模型，为肠病的分子机制研究、疾病模拟、药物靶点发现、药效筛选等提供更可靠的研究工具。
1.一种具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，其特征在于：s1的培养天数为2-3天，s2的培养天数为6-7天，s3的培养天数为30-32天。
3.根据权利要求1所述的具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，其特征在于：s1包括两个阶段，即s11和s12，s11在添加有bmp4、acta的培养基中进行，s12在添加有acta、fgf2的培养基中进行。
4.根据权利要求1所述的具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，其特征在于：在s1之前，待多能干细胞汇合度达80-95%，启动分化。
5.根据权利要求1所述的具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，其特征在于：s2中，vegf为rhvegf，浓度为10-20ng/ml；scf为rhscf，浓度为5-15ng/ml；培养基中stempro-34的体积比为21.25%-42.5%。
6.根据权利要求1所述的具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，其特征在于：s2之后，收集2d细胞单层上产生的3d中后肠衍生物后，使用cultrex基质胶进行3d包被，并加入s3的分化培养基中。
7.根据权利要求1所述的具有免疫细胞的结肠类器官构建方法，其特征在于：s3包括两个阶段，即s31和s32；s31的培养基中添加有bmp2、egf和wnt/β-连环蛋白激活剂，培养基中stempro-34的体积比为21.25%-42.5%；s32的培养基中添加有egf、vegf、m-csf、bmp抑制剂和wnt/β-连环蛋白激活剂，vegf为rhvegf，浓度为10-20ng/ml，m-csf为rhm-csf，浓度为10-20 ng/ml，培养基中stempro-34的体积比为17.5-35%。
8.一种具备免疫细胞的多谱系结肠类器官，其特征在于：该类器官由权利要求1-7任一项所述的方法构建，该类器官表达cd68，具有功能性巨噬细胞。
9.一种如权利要求8所述的具备免疫细胞的多谱系结肠类器官在建立疾病模型上的应用。
10.一种用于权利要求1-7任一项所述的方法的培养基，其特征在于：所述培养基包括在s2中添加并用于促进造血祖细胞的分化的vegf和scf、在s3中添加并用于促进巨噬细胞的分化与形成的vegf和m-csf以及在s2和s3连续使用的造血细胞培养基stempro-34。
