本发明属于医药，具体的涉及用于一种pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒及其应用。
背景技术：
1、降钙素原（procalcitonin ，pct）是降钙素的激素原，由116个氨基酸组成，分子量约为12.8kd是一种无激素活性的糖蛋白，也是一种内源性非类固醇类抗炎物质，非感染情况下由甲状腺产生。发生全身性感染时，很多器官的不同类型细胞在受到促炎症反应刺激后分泌降钙素原，特别是受到细菌感染时，其代谢很少或几乎不依赖肾脏功能，肾功能衰竭患者其清除率并不受影响，同时pct代谢也不受类固醇激素影响。在临床诊断中，脓毒症患者的降钙素原浓度升高较早，便于医生的早期诊断和监测。文献报道，机体在全身性感染情况下血清中的pct在2~4小时内就开始升高，8~24小时达到高峰，持续数天或数周，当大于一定数值时要考虑患者有可能发展成重度。pct目前主要用于全身重症细菌感染的诊断，也可根据其动态变化判断感染的严重程度、治疗效果、评估预后并指导抗菌药物治疗的启动及停用。pct是目前临床常用且参考意义较大的重要细菌感染生物标志物。
2、巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，hyperlink"https://www.cusabio.cn/recombinant-proteins/recombinant-human-macrophage-migration-inhibitory-factor(mif)-1179939.html" mif）是一种具有广泛功能的细胞因子，该因子在炎症及免疫方面有不可替代的作用，机体受到各种炎性因素刺激后，分泌的可以限制巨噬细胞移动的细胞因子。mif在感染性休克中起着重要作用，其表达和分泌在各种急慢性炎症疾病中增加，如败血症、关节炎和哮喘等。脓毒症患者血清mif浓度升高，与疾病严重程度和预后密切相关。
3、trem1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1)是与感染相关的免疫球蛋白超家族受体成员之一，strem-1是其可溶性形式。strem-1在急性炎症反应时在中性粒细胞及单核/巨噬细胞表面表达，释放于血液或体液，出现早，半衰期较短。其增高可见于细菌性脑膜炎、细菌性胸腔积液、慢阻肺合并感染和脓毒血症等患者；而在非感染性炎症疾病中很少或者不表达，提示其可作为诊断感染的较特异的指标。
4、现有技术中炎症感染及脓毒症检测通常采用单一的炎症指标进行检测，但是仅用pct来鉴别感染与否并不可靠。pct在局灶性感染中往往正常或仅有轻度增高，另外pct在一些非细菌感染引起的发热中往往不会增高，因此单独指标诊断感染的准确度有待提升。
5、免疫层析技术，又称侧向免疫层析检测技术(lateral flow immunoassay)，是基于抗原抗体反应的原理，通过抗体与目标分析物的特异性结合，实现对目标物质的检测。免疫层析技术通常采用试纸条或检测卡的形式，将抗体固定在固相载体上，如硝酸纤维素膜或微孔板。当样品中的目标分析物与固相载体上的抗体结合后，通过标记物（如胶体金、荧光染料等）的显色或信号产生，可以直观地观察和判断检测结果。然而在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的荧光素等发色团进行荧光检测时灵敏度就会严重下降。
6、综上所述，在同时检测多种蛋白时，迫切需要一种精密度高，检测背景信号低，灵敏度高，线性范围宽的免疫层析方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种精密度高，检测背景信号低，灵敏度高，线性范围宽，操作简单的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒。
2、本发明提供了一种pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，包括荧光免疫层析试纸条，所述试纸条包括样品垫1、荧光垫2、底板3、包被膜8和吸水垫9，所述样品垫1、荧光垫2、包被膜8和吸水垫9水平方向顺序连接固定于底板3上，其中，所述包被膜8上包被有检测线和质控线7，所述荧光垫2包含抗体标记的免疫荧光微球，所述抗体标记的免疫荧光微球包括pct单克隆抗体标记的免疫荧光微球、mif单克隆抗体标记的免疫荧光微球、strem-1单克隆抗体标记的免疫荧光微球。
3、在一些实施方案中，所述样品垫1为经过缓冲液处理的样品垫1。优选的，经pbs缓冲液处理的样品垫；所述pbs缓冲液的浓度优选为10mm，ph优选为7.0-7.5。进一步，所述pbs缓冲液包含0.5%（w/v%）bsa，0.5% （w/v%）tween-20；经过包含0.5%（w/v%）bsa，0.5% （w/v%）tween-20的pbs缓冲液处理的样品垫，能够有效地降低检测背景信号的干扰，提高pct、mif、strem-1检测的灵敏度。更优选的，所述pbs缓冲液包含0.5%（w/v%）bsa，0.5%（w/v%）tween-20，0.03%（w/v%）酪蛋白，0.05%（w/v%）蔗糖，0.01%（w/v%）氯化钙。本技术发明人发现，在处理液中添加0.03%（w/v%）酪蛋白，0.05%（w/v%）蔗糖，0.01%（w/v%）氯化钙后处理样品垫，尤其对于mif、strem-1的抗原检测更有效，能够有效地降低检测背景信号的干扰，提高两者检测的灵敏度。
4、进一步，所述荧光线2还包括兔igg抗体 (当质控线上的抗体为羊抗兔源时)标记的免疫荧光微球。
5、在一些实施方案中，所述免疫荧光微球的粒径为100～500nm。若粒径高于500nm，与抗体连接后，微球不稳定，容易发生沉淀，严重影响项目的检测线性及稳定性；若粒径低于100nm，抗体连接工艺会变复杂，离心时间大大延长，同样严重影响项目的检测线性及稳定性。优选的，所述荧光微球的粒径为200～300nm，进一步改善检测线性和稳定性。
6、进一步，strem-1单克隆抗体的标记的免疫荧光微球选自100nm粒径strem-1免疫荧光微球和300nm粒径strem-1免疫荧光微球，两者重量比2:1~4:1混合（优选3:1）。当样品中含有高浓度strem-1时，样品中的strem-1可同时与偶联两种粒径（100nm和300nm）荧光微球的抗strem-1单克隆抗体和包被在nc（膜硝酸纤维素膜）上抗strem-1单克隆抗体发生特异结合，在检测线处形成双抗体夹心结构，此时在检测线处的荧光强度为两种粒径荧光微球的总和。当样品中strem-1的浓度低时，样品中的strem-1主要与偶联300nm粒径的荧光微球的抗strem-1单克隆抗体和包被在nc膜上抗strem-1单克隆抗体发生特异结合，在检测线处形成双抗体夹心结构，此时在检测线处的荧光强度为300nm粒径荧光微球的荧光；有效解决了粒径小的荧光微球能检测出高浓度的strem-1抗原而在低浓度时无法检测，粒径大的荧光微球能检测出低浓度的抗原，而在高浓度出无法检测，本发明提供的技术方案选择两种粒径微球可以同时检测出低浓度和高浓度的strem-1抗原，进一步提高了strem-1检测线性范围，且灵敏度进一步提高。
7、在一些实施方案中，所述免疫荧光微球的内部填充有镧系元素的螯合物；所述的镧系元素优选为铕、钐、鈊、镝中的一种或多种；所述免疫荧光微球优选为铕粒子螯合物填充的免疫荧光微球。优选的，稀土元素铕(eu)的固含量为0.5-2%(w/v%)，优选为1% (w/v%)。采用含有稀土元素铕(eu)的免疫荧光微球相比于传统的荧光素等发色团，灵敏度更高。
8、在一些实施方案中，荧光垫2的制备步骤包括：将抗体（比如pct单克隆抗体1、mif单克隆抗体1、strem-1单克隆抗体1、兔igg抗体）标记的免疫荧光微球混合溶液喷涂在荧光垫2上，烘干，制备得到包含抗体标记的免疫荧光微球的荧光垫2。
9、在一些实施方案中，所述荧光垫2上的喷涂量为4-6μl/cm。优选5μl/cm。本发明人在实验过程中发现，低于4灵敏度达不到；高于6没有显著变化，但是成本会升高很多。
10、在一些实施方案中，烘干温度为35-40℃，优选的烘干温度为37℃，烘干时间为16~24小时。
11、在一些实施方案中，将所述抗体（例如pct、mif、 strem-1、兔igg）标记的免疫荧光微球溶于含有0.5%(w/v%) bsa的pbs缓冲液中，形成浓度为0.001%~0.1%（w/v%）的免疫荧光微球混合溶液。本发明人在实验过程中发现，低于0.001%（w/v%）灵敏度达不到；高于0.1%（w/v%）微球释放效果不好，精密度变差。
12、在一些实施方案中，所述抗体（比如pct单克隆抗体1、mif单克隆抗体1、strem-1单克隆抗体1、兔igg抗体）标记的免疫荧光微球混合溶液的制备步骤包括：将免疫荧光微球与所述抗体进行反应，封闭后超声即可。
13、在一些实施方案中，所述的免疫荧光微球需进行活化处理，具体步骤包括：将免疫荧光微球溶于缓冲液1中，超声，加入活化剂，反应，离心。优选的缓冲液1为mes缓冲溶液；所述mes缓冲溶液的ph为6-6.5；本技术发明人在实验过程中也尝试过其他缓冲液配方，总体来说信号值都不如mes的效果好。
14、进一步，所述活化剂为nhs和/或edc；nhs终浓度为0.02-0.1mg/ml，优选nhs终浓度为0.05mg/ml；edc终浓度为0.02-0.1mg/ml，优选edc终浓度为0.05mg/ml。
15、在一些实施方案中，免疫荧光微球与所述活化剂避光反应，反应时间20-60min；优选30min。
16、在一些实施方案中，所述的荧光微球经进行活化处理后，采用复溶试剂1进行复溶，加入抗体反应，再加入封闭试剂进行封闭处理，离心，采用复溶试剂2进行复溶。
17、进一步，所述复溶试剂1为pbs缓冲液。
18、进一步，免疫荧光微球与抗体的反应时间2-4h，优选3h。
19、进一步，所述封闭试剂为bsa，浓度为0.5%（w/v%）。
20、进一步，所述复溶试剂2为含有0.5%bsa的pbs缓冲液。本技术发明人在实验过程中也尝试过复溶试剂2中含有不同配比的bsa，其中bsa的含量过高，比如1%，总体来说信号值都不如低浓度的效果好。
21、进一步，所述离心的转速为10000-20000rpm，优选为12000-15000 rpm。
22、在一些实施方案中，所述包含抗体（比如pct单克隆抗体1、mif单克隆抗体1、strem-1单克隆抗体1、兔igg抗体）标记的免疫荧光微球混合溶液的制备步骤包括：
23、1)将荧光微球溶于mes缓冲溶液中，离心，除去上清；
24、2)加入mes缓冲溶液，添加nhs和/或edc的活化剂，反应，离心，除去上清；
25、3)加入复溶试剂1复溶，加入抗体反应，离心，除去上清；
26、4)加入封闭试剂，进行封闭处理，离心，除去上清；
27、5)加入复溶试剂2再次复溶，得到抗体标记的免疫荧光微球混合溶液。
28、在一些实施方案中，缓冲液1、缓冲液2为mes缓冲溶液；所述mes缓冲溶液的ph为6-6.5；优选ph为6。本技术发明人在实验过程中也尝试过其他缓冲液配方，总体来说信号值都不如mes的效果好。
29、在一些实施方案中，活化剂选自nhs和/或edc；nhs终浓度为0.02-0.1mg/ml，优选nhs终浓度为0.05mg/ml；edc终浓度为0.02-0.1mg/ml，优选edc终浓度为0.05mg/ml。
30、在一些实施方案中，所述免疫荧光微球与所述活化剂避光反应，反应时间20-60min；优选30min。
31、在一些实施方案中，所述免疫荧光微球与抗体的反应时间2-4h，优选3h。
32、在一些实施方案中，所述封闭试剂为bsa，浓度为0.5%（w/v%）。
33、在一些实施方案中，所述复溶试剂1为pbs缓冲液，ph为7-7.5，优选ph为7.2。所述复溶试剂2为含有0.5%bsa的pbs缓冲液，ph为7-7.5，优选ph为7.2。本技术发明人在实验过程中也尝试过复溶试剂2中含有不同配比的bsa，其中bsa的含量过高，比如2%，总体来说信号值都不如低浓度的效果好。
34、在一些实施方案中，所述包含抗体（比如pct单克隆抗体1、mif单克隆抗体1、strem-1单克隆抗体1、兔igg抗体）标记的免疫荧光微球混合溶液的制备步骤包括：
35、1）取0.1ml 固含量为1%(w/v)eu时间分辨荧光微球；加入0.9ml ph为6.0 的25mmmes缓冲溶液，旋涡混匀后，12000-15000 rpm 离心30分钟，去除上清；
36、2）向上一步骤中加入ph为6.0 的25mm mes缓冲溶液 1ml，100w超声混匀，加入edc和nhs，终浓度均为0.05mg/ml；旋涡混匀，避光反应30分钟；12000-15000 rpm 离心30分钟，去除上清；
37、3）向上一步骤加入ph为7.2 的10mm pbs缓冲液1ml，100w超声混匀，使得微球均匀分散；然后加入pct单克隆抗体（或mif单克隆抗体1或 strem-1 单克隆抗体1或兔igg）10.1mg，旋涡混匀，静置反应3小时，离心管12000-15000 rpm 离心30分钟，去除上清；
38、4）向上一步骤加入含0.5%bsa的ph为7.2 的10mm pbs1ml；旋涡混匀后，静置反应30min；12000-15000 rpm 离心30分钟；
39、5）用含0.5% bsa的ph为7.2 的10mm pbs缓冲液1ml重悬微球，得到pct免疫荧光微球液混合溶液。
40、在一些实施方案中，所述检测线为检测所述一种或多种抗原的抗体。优选为3种抗体的检测限，包括pct检测线4、mif检测线5以及strem-1检测线6。所述pct检测线4为pct单克隆抗体2、mif检测线5)为mif单克隆抗体2、strem-1检测线6为strem-1单克隆抗体2构成的检测线。
41、在一些实施方案中，所述质控线7为羊抗兔单克隆抗体构成的质控线。
42、当样本中含有pct、mif、strem-1等抗原，样本溶液经过荧光垫2时，复溶荧光垫中相应免疫荧光微球，并与免疫荧光微球上的特异性抗体（例如pct单克隆抗体1）进行特意结合，再继续向前层析时，会被相应的检测线上的捕获单克隆抗体2（例如pct单克隆抗体2），捕获形成荧光微球抗体1-抗原-抗体2，夹心复合物，荧光型号的强弱样本中抗原物质的含量成正向关，通过荧光免疫分析仪读取每个指标的含量。
43、另一方面，本发明还提供一种荧光免疫层析试纸条的制备方法，其包括如下步骤：用0.5% bsa的pbs缓冲液(ph为7.2）稀释抗体（比如pct单克隆抗体1、mif单克隆抗体1、strem-1单克隆抗体1、兔igg抗体）标记的免疫荧光微球混合溶液，然后喷涂于玻璃纤维垫形成荧光垫2；用pbs缓冲液（ph为7.2）稀释抗体2（比如pct单克隆抗体2、mif单克隆抗体2、strem-1单克隆抗体2），然后划线于硝酸纤维素膜（包被膜）上形成所述检测线，将稀释后的羊抗兔抗体划线于硝酸纤维素膜（包被膜）上形成所述质控线7，烘干；将玻璃纤维垫经过样品处理液处理后，形成样品垫1；在所述底板3上由左到右依次粘附样品垫1、荧光垫2、包被膜8、吸水垫9即可。
44、另一方面，本发明还提供上述荧光免疫层析试剂盒在检测抗原中的应用，所述抗原优选为蛋白，例如pct、mif和strem-1。
45、本发明所述的荧光免疫层析试纸条、包含其的试剂、试剂盒及其制备方法能在较短的检测时间内同时快速定量多种抗原(例如同时检测pct、mif、strem-1)，不仅能够提高检测的灵敏度及线性范围，而且能够实现一步法上样的(例如75-100μl的样本)操作，极大提高操作的精密度和准确性，减少人为操作的误差，操作更简单，有利于工业化生产。在本发明的实施例中，同时检测pct、mif、strem-1时，精密度均小于10％。检测pct的最低检测限可达0.040ng/ml；检测mif的最低检测限可达0.040ng/ml；检测strem-1的最低检测限可达4.058pg/ml。pct的线性范围为0.1ng/ml-50 ng/ml, mif的线性范围为0.1ng/ml-50 ng/ml, strem-1的线性检测范围为10pg/ml-10000 pg/ml，pct、mif、strem-1的线性相关系数均>0.99。
1.一种pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，包括荧光免疫层析试纸条，所述试纸条包括样品垫(1)、荧光垫（2）、底板(3)、包被膜(8)和吸水垫(9)，所述样品垫(1)、荧光垫(2)、包被膜(8)和吸水垫(9)水平方向顺序连接固定于底板(3)上，其中，所述包被膜(8)上包被有检测线和质控线(7)，其中，所述荧光垫(2)包括抗体标记的免疫荧光微球，所述抗体标记的免疫荧光微球包括pct单克隆抗体标记的免疫荧光微球、mif单克隆抗体标记的免疫荧光微球、strem-1单克隆抗体标记的免疫荧光微球；所述免疫荧光微球为内部填充铕粒子螯合物的免疫荧光微球，所述铕粒子螯合物的免疫荧光微球中铕(eu)的固含量为0.5-2%(w/v%)；所述样品垫(1)为经过pbs缓冲液处理的样品垫(1)，所述pbs缓冲液包含0.5%（w/v%）bsa，0.5%（w/v%）tween-20。
2.根据权利要求1所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，所述样品垫(1)为经过pbs缓冲液处理的样品垫(1)，所述pbs缓冲液包含0.5%（w/v%）bsa，0.5%（w/v%）tween-20，0.03%（w/v%）酪蛋白，0.05%（w/v%）蔗糖，0.01%（w/v%）氯化钙。
3.根据权利要求1或2所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，所述免疫荧光微球的粒径为100～500nm。
4.根据权利要求1所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，所述荧光垫（2）的制备步骤包括：将抗体标记的免疫荧光微球混合溶液喷涂在荧光垫（2）上，烘干，制备得到包含抗体标记的免疫荧光微球的荧光垫（2）。
5.根据权利要求4所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，所述抗体标记的免疫荧光微球混合溶液的浓度为：0.001%~0.1%（w/v%）。
6.根据权利要求4所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，所述荧光垫(2)的喷涂量为4-6μl/cm。
7.根据权利要求4所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，烘干温度为35-40℃；烘干时间为16~24小时。
8.根据权利要求4所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，所述抗体标记的免疫荧光微球混合溶液的制备步骤包括：
9.根据权利要求8所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒，其中，
10.如权利要求1-9任一项所述的pct/mif/strem-1联合检测的荧光免疫层析试剂盒在检测抗原中的应用，所述抗原包括pct、mif和strem-1。
