本发明属于γ-聚谷氨酸生产，具体涉及利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术：
1、γ-聚谷氨酸（poly-γ-g/lutamicacid，γ-pga）是一种具有多功能的黏性高分子生物聚合物，由d-和/或l-谷氨酸的α-氨基与相邻谷氨酸的γ-羧基脱水缩合形成的一种谷氨酸多聚体结构。一些细菌、古生菌、真核生物都可产生γ-聚谷氨酸，其中芽孢杆菌属细菌是产γ-聚谷氨酸的主要微生物。γ-聚谷氨酸的生产方法包括化学合成法与微生物发酵法。有研究显示，微生物发酵法是一种简单而经济有效的γ-聚谷氨酸生产方式。
2、具体地，微生物发酵法制备γ-聚谷氨酸包括发酵工艺和纯化工艺。其中，发酵工艺得到的γ-聚谷氨酸发酵液具有粘度高和菌液分离困难的问题，因此需要进行发酵液的分离纯化。现有技术中常采用的分离纯化方法包括有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法。其中，有机溶剂沉淀是指利用离心或凝聚菌体的方法将发酵液中的菌体去除，然后在上清液中加入低级醇类（如甲醇、乙醇等）沉淀得到γ-聚谷氨酸；无机盐沉淀则是用饱和硫酸铜、氯化钠等溶液代替低级醇类盐析使γ-聚谷氨酸沉淀；膜分离沉淀法存在膜易堵塞的问题。因此，针对利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法的改进具有积极生产意义。
3、申请公布号为cn116731309a的中国专利公开了利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，该发明专利采用复合无机陶瓷膜代替有机膜和使用自制的吸附剂，最终实现提高γ-聚谷氨酸收率（90%左右）和纯度（97%-99%）的目的。本发明旨在现有技术的基础上，进一步改进工艺过程，旨在进一步提高γ-聚谷氨酸纯度。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，以提高γ-聚谷氨酸纯度。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
3、利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
4、s1、利用枯草芽孢杆菌发酵培养得原发酵液，调节原发酵液的黏度，再升温至80-100℃，恒温搅拌后冷却，再调节ph至3.0-3.2，搅拌、离心，收集上清液，再向上清液中加入脱色树脂、活性炭和硅藻土，振荡10h，再过滤，得到脱色滤液，脱色滤液再经超滤膜超滤处理，收集截留液；
5、s2、将截留液浓缩至原体积10%-20%，得到浓缩液，向浓缩液中搅拌加入沉淀剂，搅拌、静置、离心、干燥后，得到γ-聚谷氨酸粗品；
6、s3、将γ-聚谷氨酸粗品置于纯水中，调节ph至9.5-10.0，向其中搅拌加入磁选载体，再经外加磁场分离，得到γ-聚谷氨酸-磁选复合载体，将γ-聚谷氨酸-磁选复合载体置于质量分数为0.5%的乙酸中，搅拌2-3h，再利用纯水洗涤γ-聚谷氨酸，得到纯品，纯品再经真空脱水后，得到γ-聚谷氨酸。
7、进一步的，s1中所述发酵培养过程如下：
8、菌种活化：从-20℃保藏菌种的冷冻甘油管中取1环菌种接入斜面培养基中，37℃培养24h，革兰氏染色镜检无误后，记作活化菌种；
9、种子培养：取1环活化菌种接种于种子培养基中，37℃恒温振荡培养12h，得到种子液；
10、摇瓶发酵：将种子液以3%（w/w）的接种量接入发酵培养基中，200r/min，37℃，恒温振荡培养72h，得到原发酵液。
11、进一步的，所述斜面培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、氯化钠10g/l、明胶20g/l，将ph调至7.0，于高压灭菌锅121℃灭菌20min；所述种子培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、氯化钠10g/l、蔗糖1g/l，将ph调至7.0，于高压灭菌锅121℃灭菌20min；所述发酵培养基：l-谷氨酸钠25g/l、柠檬酸三钠16.8g/l、蔗糖20g/l、nh4cl 7g/l、kh2po40.5g/l、mgso4・7h2o 0.5g/l、mgso4・h2o 0.1g/l、cacl20.15g/l、fecl3・6h2o 0.04g/l，ph7.0，于121℃灭菌20min。
12、进一步的，s1中所述脱色树脂为d301树脂。
13、进一步的，s1中所述脱色树脂、活性炭、硅藻土和上清液的用量比为1-2g:2-5g:1-2g:20ml。
14、进一步的，s1中所述超滤膜的截留分子量为60000da。
15、进一步的，s2中所述沉淀剂为饱和硫酸铵溶液。
16、进一步的，s2中所述沉淀剂与浓缩液的体积用量比为2.5-3.0:1。
17、进一步的，s3所述磁选载体的用量至少为γ-聚谷氨酸粗品质量的1%。
18、进一步的，所述磁选载体的制备过程如下：
19、a1、向纯水中搅拌加入纳米四氧化三铁，在氮气保护、80℃条件下加入油酸，搅拌反应30-40min后，降温至45-50℃，再向其中搅拌加入peg-6000，超声搅拌20-30min，搅拌完毕后，冷却至室温，得到磁性载体；
20、a2、向纯水中搅拌加入无水乙醇和γ-聚谷氨酸，搅拌混合30min，再向其中搅拌加入甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯和磁性载体，超声搅拌20-30min，搅拌完毕后，得到预聚体；
21、a3、向无水乙醇中加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌至固体完全溶解，充入氮气并升温至60-65℃，向其中搅拌加入偶氮二异丁腈和预聚体，60-65℃恒温、氮气保护下，搅拌反应24h，反应完毕后，冷却至室温，用外加磁场分离固体组分，按顺序用质量分数为0.5%的乙酸和纯水先后冲洗固体组分，然后将洗净后的固体组分置于60℃条件下干燥至恒重，冷却至室温，得到磁选载体。
22、进一步的，a1中所述纯水、纳米四氧化三铁、油酸和peg-6000的用量比为40-50ml:2.5-3.0g:5-10ml:8-10g。
23、进一步的，a2中所述γ-聚谷氨酸的分子量≤100000da。
24、进一步的，a2中所述纯水、无水乙醇、γ-聚谷氨酸、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯和磁性载体的用量比为100ml:100ml:1.2-1.5g:50mmol:200-210mmol:10-12g。
25、进一步的，a3中所述无水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈和预聚体的用量比为200ml:0.4-0.5g:0.1g:5g。
26、本发明的有益效果：
27、本发明提供了一种利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，本发明通过综合膜分离、化学沉淀法分离和磁选纯化的方式，旨在提高γ-聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的纯化过程的纯度，经检测，经本发明方法纯化的γ-聚谷氨酸的纯度为99.3%-99.7%，纯度表现优异，具有推广价值。其中磁选纯化过程中，本发明利用自制的磁选载体进行γ-聚谷氨酸粗品的进一步纯化，其中，磁选载体的制备原理和有益效果如下：
28、首先，本发明利用纳米四氧化三铁的磁性，再通过油酸和peg-6000对纳米四氧化三铁进行包裹，peg-6000的疏水端和油酸的疏水端形成双层胶束，使磁性载体能很好地分散在溶液中；然后，本发明通过氢键作用将γ-聚谷氨酸和甲基丙烯酸链接，再与交联剂（乙二醇二甲基丙烯酸酯）、磁性载体混合形成预聚复合物；接着，在引发剂（偶氮二异丁腈）的作用下采用热引发方法将预聚复合物、交联剂、磁性载体聚合，形成固体组分；最后，利用甲醇、乙酸和纯水冲洗固体组分，将γ-聚谷氨酸从固体组分中洗脱出来，剩余的固体组分上留出与γ-聚谷氨酸具有特异识别的空穴，最终得到磁选载体，磁选载体针对γ-聚谷氨酸具有特异性吸附作用，再通过纳米四氧化三铁的磁性，在外加磁场的条件下，实现γ-聚谷氨酸的磁选纯化。
29、同时，本发明利用由枯草芽孢杆菌发酵合成的γ-聚谷氨酸在酸性和碱性环境下分别呈现出平行的β-片层结构和收缩随机结构的特点，通过在碱性条件下进行γ-聚谷氨酸粗品中γ-聚谷氨酸的磁性吸附，最后通过质量分数为0.5%的乙酸进行γ-聚谷氨酸的洗脱，利用γ-聚谷氨酸在碱性过渡到酸性条件下发生的结构的舒展，提高其洗脱效率，同时，γ-聚谷氨酸粗品中的杂蛋白等在酸性和碱性条件下易发生水解，不易被磁选载体吸附，因此最终提取纯化的γ-聚谷氨酸的纯度表现优异。
1.利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，s1中所述发酵培养过程如下：
3.根据权利要求2所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述斜面培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、氯化钠10g/l、明胶20g/l，将ph调至7.0，于高压灭菌锅121℃灭菌20min；
4.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，s1中所述脱色树脂为d301树脂；s1中所述超滤膜的截留分子量为60000da。
5.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，s1中所述脱色树脂、活性炭、硅藻土和上清液的用量比为1-2g:2-5g:1-2g:20ml。
6.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，s2中所述沉淀剂为饱和硫酸铵溶液；所述沉淀剂与浓缩液的体积用量比为2.5-3.0:1。
7.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，s3所述磁选载体的用量至少为γ-聚谷氨酸粗品质量的1%。
8.根据权利要求1所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，a1中所述纯水、纳米四氧化三铁、油酸和peg-6000的用量比为40-50ml:2.5-3.0g:5-10ml:8-10g；a2中所述纯水、无水乙醇、γ-聚谷氨酸、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯和磁性载体的用量比为100ml:100ml:1.2-1.5g:50mmol:200-210mmol:10-12g；a3中所述无水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈和预聚体的用量比为200ml:0.4-0.5g:0.1g:5g。
9.根据权利要求8所述的利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，a2中所述γ-聚谷氨酸的分子量≤100000da。
